本發(fā)明涉及制備表面修飾的磁性納米銀花sers基底，具體涉及一種基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法，屬于光子材料、納米材料、食品安全檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

食品安全問題受到國際社會的廣泛關(guān)注，抗生素殘留是食品安全檢測的重要內(nèi)容。目前傳統(tǒng)的針對食品中抗生素的檢測分析方法，大部分采用的是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等方法。這些方法靈敏度高，重復(fù)性好，應(yīng)用普遍，但需要專業(yè)人員操作，樣品前處理過程繁瑣，耗時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度大。因此，建立一種簡單、有效的分析方法來實(shí)現(xiàn)食品中抗生素殘留的有效檢測是非常重要的。

作為一種高靈敏度的表征手段，近年來表面增強(qiáng)拉曼光譜光譜技術(shù)(sers)在食品中抗生素殘留分析與檢測上的研究越來越深入和廣泛。sers檢測技術(shù)中，sers活性基底的選擇和制備成為獲得高質(zhì)量sers信號的關(guān)鍵。制備一種表面修飾的磁性納米銀花基底，在增強(qiáng)拉曼信號的同時(shí)，富集溶液中具有疏水基團(tuán)的抗生素分子，從而獲得更強(qiáng)的抗生素分子的拉曼信號。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是制備一種磁性納米銀花基底，圍繞sers基底的增強(qiáng)能力，對該基底表面進(jìn)行化學(xué)修飾，針對食品中抗生素殘留問題展開一系列的應(yīng)用研究。

一種基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法，包括以下步驟：

1)制備本實(shí)驗(yàn)室自主合成的磁性納米銀花；

2)用步驟1)制備好的磁性納米銀花溶于10mg/ml無水乙醇中，超聲10分鐘使其完全分散；加入若干微升配制好的10mm正己硫醇(c6)原液，使得終濃度分別為50μm；

3)將步驟2)得到的溶液超聲反應(yīng)2小時(shí)，使正己硫醇(c6)完全自組裝于銀殼磁珠表面，用乙醇洗三次，保存于乙醇溶液中待用；

4)抗生素溶液樣品制備：將氯霉素和環(huán)丙沙星分別配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。隨后，采用10倍稀釋的方法制備濃度范圍從10^-3m～10^-12m的抗生素溶液，待用。

5)牛奶抗生素樣品制備：將步驟4)配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入牛奶依次10倍稀釋成 10^-3～10^-10m的加標(biāo)牛奶，用spe固相萃取法進(jìn)行純化富集，將洗脫液濃縮后待用；

6)將步驟3)分別加入步驟4)和步驟5)制備好的樣品中，利用便攜式拉曼光譜儀對樣品進(jìn)行檢測。

7)根據(jù)抗生素的拉曼峰強(qiáng)度計(jì)算樣品回收率。

步驟(1)所述的這種磁性納米銀花的制備方法是本實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)的，首先在200nmfe3o4納米粒子外包覆一層sio2，并通過化學(xué)鍍的方法長出銀種子顆粒，最后通過甲醛和氨水在超聲條件下快速還原出花狀外殼。磁性納米銀花的外殼上凸起的銀棒是一種典型的納米尖端結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的sers增強(qiáng)性能。我們對這種磁性納米銀花的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征，證明了其具有很強(qiáng)的sers活性及磁性。

步驟(2)所述的磁性納米銀花在超聲條件下避免了合成過程中磁性粒子的團(tuán)聚，決定了磁性納米銀花的分散性及結(jié)構(gòu)均一性。正己硫醇(c6)通過巰基(-sh)與ag殼連接，并通過化學(xué)鍵結(jié)合，依靠磁性納米銀花表面上的自組裝疏水層與抗生素分子間的疏水作用對抗生素分子進(jìn)行富集。正己硫醇(c6)修飾的sers基底在增強(qiáng)拉曼信號的同時(shí)，可以富集溶液中具有疏水基團(tuán)的抗生素分子，將抗生素分子拉近到金屬納米結(jié)構(gòu)表面，使sers基底表面能吸附更多的樣品分子，從而獲得更強(qiáng)的抗生素分子的拉曼信號。

步驟(3)所述正己硫醇(c6)修飾的sers基底(fe3o4@sio2-ag-c6)用乙醇清洗3遍，洗掉基底中的雜質(zhì)和溶劑殘留物，保持基底干凈無雜質(zhì)，4℃冰箱保存，待用。

步驟(4)所述抗生素溶液的配制方法：取氯霉素1.1mg溶于1.1ml80％乙醇中，制備得到1mg/ml的氯霉素乙醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；環(huán)丙沙星1.2mg溶于1.2ml去離子水中，加入1.5μl甲酸，制備得到1mg/ml的環(huán)丙沙星酸性水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

步驟(5)所述將抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用牛奶依次10倍稀釋，濃度范圍10^-3～10^-10m的加標(biāo)牛奶，用spe固相萃取柱進(jìn)行純化富集，洗脫液濃縮至300μl待用。

步驟(6)所述將制備好的fe3o4@sio2-ag-c6sers基底用去離子水清洗2遍；加入300μl乙醇復(fù)溶；將300μl不同濃度的抗生素溶液和牛奶抗生素洗脫液，分別加入20μlfe3o4@sio2-ag-c6sers基底，室溫下超聲30分鐘，點(diǎn)在硅片上，配制各抗生素的溶劑和空白牛奶作為對照，進(jìn)行拉曼檢測。便攜式拉曼光譜光譜儀型號為bws465-785h9(b&wtek公司)，激發(fā)波長785nm，端口輸出功率為340mw，經(jīng)40×物鏡聚焦后，光斑直徑為105μm，拉曼信號由冷卻溫度為-2℃的ccd接收，拉曼光譜均用硅片在520.7cm-1處的拉曼峰來進(jìn)行校正。

步驟(7)所述選用了未檢出2種待測抗生素的超市購買的牛奶樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，在空白牛奶中分別加入1000、100和10μm/l的3個(gè)濃度的2種抗生素，然后用spe固相萃取柱對牛 奶中抗生素進(jìn)行提取，提取液濃縮后，進(jìn)行拉曼光譜檢測，然后根據(jù)抗生素的拉曼峰強(qiáng)度計(jì)算回收率。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果為：

本發(fā)明所述對磁性納米銀花sers基底進(jìn)行表面化學(xué)修飾，將表面修飾劑正己硫醇通過巰基與ag殼連接，并通過化學(xué)鍵結(jié)合，可以在基底表面形成致密的自組裝層，通過疏水作用對抗生素分子進(jìn)行富集。正己硫醇修飾的sers基底在增強(qiáng)拉曼信號的同時(shí)，可以富集溶液中具有疏水基團(tuán)的抗生素分子，使sers基底表面能吸附更多的抗生素分子，從而獲得更強(qiáng)的抗生素分子的拉曼信號。

本發(fā)明所述的基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法，正己硫醇修飾的磁性納米銀花sers基底，既具有磁珠富集濃縮樣品的特性，又具有銀納米材料光學(xué)及化學(xué)特性。將該sers基底用于食品抗生素殘留分析檢測中，比國標(biāo)要求的檢測方法更簡單、快速，獲得的檢測限更低，并具有較高的樣品回收率。可作為一種有效的檢測方法用于各種食品中抗生素殘留的分析研究。

附圖/表說明

圖1為基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法中制備正己硫醇修飾的磁性納米銀花的流程示意圖。

圖2為基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法中正己硫醇修飾的磁性納米銀花在sers檢測中的應(yīng)用原理圖。

圖3基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法應(yīng)用于不同濃度氯霉素溶液的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖4為基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法應(yīng)用于不同濃度環(huán)丙沙星溶液的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖5為基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法應(yīng)用于不同濃度牛奶中氯霉素的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖6為基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法應(yīng)用于不同濃度牛奶中環(huán)丙沙星的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖7為基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法應(yīng)用于牛奶中氯霉素、環(huán)丙沙星的加標(biāo)回收率計(jì)算數(shù)值。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施將結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

一種高性能表面修飾的磁性納米銀花的制備：

圖1給出正己硫醇修飾的磁性納米銀花的流程示意圖。其具體的制備方法分為以下五步：第一步首先在200nmfe3o4納米粒子外包覆一層sio2；第二步通過化學(xué)鍍的方法長出銀種子顆粒；第三步通過甲醛和氨水在超聲條件下快速還原出花狀外殼；第四步正己硫醇(c6)通過巰基(-sh)與ag殼連接，并通過化學(xué)鍵結(jié)合，依靠磁性納米銀花表面上的自組裝疏水層與抗生素分子間的疏水作用對抗生素分子進(jìn)行富集；第五步正己硫醇(c6)修飾的sers基底(fe3o4@sio2-ag-c6)用乙醇清洗3遍，洗掉基底中的雜質(zhì)和溶劑殘留物，保持基底干凈無雜質(zhì)，4℃冰箱保存，待用。

圖2給出的正己硫醇修飾的磁性納米銀花在sers檢測中的應(yīng)用原理圖。取300μl抗生素溶液，加入20μlfe3o4@sio2-ag-c6sers基底混合，渦輪震蕩10秒，超聲30分鐘，通過外加磁鐵對sers基底進(jìn)行富集，棄去多余液體，超聲重新混懸后，將基底混合溶液10μl點(diǎn)在硅片上，室溫下自然干燥，進(jìn)行拉曼光譜檢測。

實(shí)施例2

基于表面修飾的磁性納米銀花基底的抗生素拉曼光譜檢測方法用于兩種抗生素溶液的定性定量分析：

圖3是氯霉素溶液的定性定量分析結(jié)果。使用fe3o4@sio2-ag-c6sers基底對濃度范圍從10^-3～10^-10m的氯霉素溶液進(jìn)行拉曼檢測，并且以配制氯霉素溶液的80％乙醇作為信號參照物，得到的sers光譜如圖3a所示。sers信號強(qiáng)度隨著氯霉素濃度的降低而逐步降低。由于sers信號強(qiáng)度對氯霉素的濃度非常靈敏，利用扣除背景的氯霉素的sers信號強(qiáng)度對其濃度作圖。圖3a為氯霉素在1347cm^-1處扣除背景的拉曼峰強(qiáng)度與濃度的log-log關(guān)系圖，該線性回歸方程為y＝89755+6246.8245x，該方程的相關(guān)系數(shù)為0.99，從低到高濃度條件下，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該方法對cap的檢測限為100pm(32ppt)，低于歐盟對氯霉素的檢測限0.1μg/kg(100ppt)和美國fda規(guī)定的檢出限0.3μg/kg(300ppt)，該方法具有較好的檢測限和線性范圍。

圖4是環(huán)丙沙星溶液的定性定量分析結(jié)果。使用fe3o4@sio2-ag-c6sers基底對濃度范圍從10^-3～10^-10m的環(huán)丙沙星溶液進(jìn)行拉曼檢測，并且以配制環(huán)丙沙星溶液的酸性水作為信號參照物，得到的sers光譜如圖4a所示。我們選擇環(huán)丙沙星主要特征峰1387cm^-1繪制了 它們的log-log曲線。如圖4a所示，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示同一個(gè)濃度經(jīng)三次測量得到的平均值，這三次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差以誤差棒的形式展現(xiàn)在圖中。在10^-3～10^-10m濃度范圍內(nèi)，特征峰強(qiáng)度與濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程分別為y＝71438+6253.5815x，線性相關(guān)系數(shù)為0.98?？梢詾槔帽砻嬖鰪?qiáng)拉曼光譜定量檢測cip提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，該方法對cip的檢測限為100pm(33ppt)。

實(shí)施例3

圖5-圖7是牛奶中氯霉素和牛奶中環(huán)丙沙星的定性定量分析結(jié)果。以空白牛奶作為信號參照物，得到的sers光譜如圖5a、圖6b所示。如圖5a，圖6b所示，我們選擇了譜圖中氯霉素的特征峰1347cm^-1，環(huán)丙沙星的特征峰1387cm^-1，根據(jù)它們的溶液濃度和所對應(yīng)的特征峰強(qiáng)度繪制了它們的log-log曲線。氯霉素、環(huán)丙沙星在10^-3～10^-9m濃度范圍內(nèi)，分別獲得線性方程y＝6818+653.05879x，r²＝0.99；y＝13843+1212.5468x，r²＝0.98，線性關(guān)系良好。該方法對牛奶中氯霉素、環(huán)丙沙星的檢測限分別為0.1nm(30ppt).，1nm(331ppt)，遠(yuǎn)低于2002國家食品安全法規(guī)規(guī)定的最大殘留0.3ng/ml(300ppt)，100μg/l(100ppb)10倍以上。選用未檢出2種待測抗生素的超市購買的牛奶樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，在空白牛奶中分別加入1000、100和10μm/l的3個(gè)濃度的2種抗生素，然后用spe固相萃取柱對牛奶中抗生素進(jìn)行提取，提取液濃縮后，進(jìn)行拉曼光譜檢測，圖7為根據(jù)氯霉素和環(huán)丙沙星的拉曼峰強(qiáng)度計(jì)算的回收率結(jié)果。通過spe固相萃取法獲得2種抗生素的拉曼峰強(qiáng)度和樣品濃度在10～1000μm/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率在78.50％～113.59％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10.83％～16.89％，該方法具有較高的回收率，完全可以滿足對抗生素殘留分析的要求。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能依此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。