本發(fā)明涉及聯(lián)用sers基底的sers信號(hào)均一性、重復(fù)性及穩(wěn)定性的研究，具體涉及一種聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法，屬于光子材料、納米材料、食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

激素在自然界中分布廣泛，是一類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的類固醇激素，分為內(nèi)源性雌激素和外源性雌激素，其一端含有一個(gè)羧基的長(zhǎng)的脂肪族碳?xì)滏?，可直接影響到?dòng)物的代謝與繁殖。激素進(jìn)入機(jī)體后長(zhǎng)期蓄積，半衰期長(zhǎng)，難以生物降解，導(dǎo)致激素殘留問題日益嚴(yán)重。人類攝入激素的途徑很多，其中乳制品是主要來源，我國(guó)兒童和青少年是乳品與乳制品的主要消耗人群，由于現(xiàn)在奶牛的品種多為經(jīng)基因改良的高產(chǎn)品種以及在飼料中提高了高蛋白飼料的比例，導(dǎo)致所產(chǎn)牛奶中的激素水平有較大程度地上升，從而造成“奶粉致性早熟事件”的發(fā)生。

由于sers具有較高的靈敏度和良好的選擇性，在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用愈來愈廣泛。我們選擇fe3o4@sio2-ag-c6+棒銀聯(lián)用sers基底，使聯(lián)用基底既可以富集溶液中激素分子，同時(shí)又彌補(bǔ)c6吸附在銀殼表面所帶來的拉曼信號(hào)的損失?？疾榱寺?lián)用sers基底的均一性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。實(shí)現(xiàn)了聯(lián)用sers基底對(duì)溶液和實(shí)際牛奶中激素的定性和定量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將制備的正己硫醇修飾磁性納米銀花與棒銀進(jìn)行聯(lián)用，考察聯(lián)用sers基底的均一性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，基于該聯(lián)用sers基底對(duì)食品中激素殘留問題展開一系列的應(yīng)用研究。

一種聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法，包括以下步驟：

1)制備本實(shí)驗(yàn)室自主合成的正己硫醇修飾的磁性納米銀花(fe3o4@sio2-ag-c6)；

2)用步驟1)制備好的fe3o4@sio2-ag-c6sers基底用乙醇洗三次，保存于乙醇溶液中待用；

3)以10^-6m的乙烯雌酚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)步驟2)獲得的fe3o4@sio2-ag-c6sers基底+棒銀sers基底(本實(shí)驗(yàn)室自主合成)聯(lián)用進(jìn)行sers信號(hào)的均一性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的考 察研究；

4)2種激素溶液樣品制備：將乙烯雌酚和17β-雌二醇分別配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。隨后，采用10倍稀釋的方法制備濃度范圍從10^-5m～10^-13m的激素溶液，待用。

5)2種牛奶激素樣品制備：將步驟4)配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入牛奶依次10倍稀釋成10^-3～10^-10m的加標(biāo)牛奶，用spe固相萃取法進(jìn)行純化富集，將洗脫液濃縮后待用；

6)將fe3o4@sio2-ag-c6分別加入步驟4)和步驟5)制備好的樣品中，室溫下自然干燥后，點(diǎn)上棒銀，干燥后利用便攜式拉曼光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

7)根據(jù)牛奶中激素的拉曼峰強(qiáng)度計(jì)算樣品回收率。

步驟(1)所述的這種正己硫醇(c6)修飾的磁性納米銀花的制備方法是本實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)的，首先在200nmfe3o4納米粒子外包覆一層sio2，并通過化學(xué)鍍的方法長(zhǎng)出銀種子顆粒，最后通過甲醛和氨水在超聲條件下快速還原出花狀外殼。配制10mm正己硫醇原液，向配制好的磁性納米銀花的乙醇溶液中加入若干微升的正己硫醇，使得終濃度為50μm，超聲反應(yīng)2小時(shí)，使正己硫醇完全自組裝于銀殼磁珠表面。

步驟(2)所述正己硫醇(c6)修飾的sers基底(fe3o4@sio2-ag-c6)用乙醇清洗3遍，洗掉基底中的雜質(zhì)和溶劑殘留物，保持基底干凈無雜質(zhì)，4℃冰箱保存，待用。

步驟(3)所述將10^-6m的乙烯雌酚溶液300μl分別與20μlfe3o4@sio2-ag-c6sers基底混合，渦輪震蕩10秒，超聲30分鐘，通過外加磁鐵對(duì)sers基底進(jìn)行富集，棄去多余液體，超聲重新混懸后，將基底混合溶液10μl點(diǎn)在硅片上，室溫下自然干燥后，點(diǎn)上棒銀，干燥后進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。硅片平放在測(cè)試平臺(tái)上，調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)平臺(tái)的x向和y向，使基底平移到15個(gè)位置，分別測(cè)試15個(gè)sers光譜；日內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，我們?nèi)×巳齻€(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)間隔6小時(shí)(0h，6h，12h)，共15個(gè)檢測(cè)點(diǎn)；日間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，連續(xù)5天將基底混合溶液分別平行點(diǎn)在硅片上5個(gè)點(diǎn)，共25個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)；批次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，先后制備三個(gè)批次的sers基底，制備過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)步驟，共15個(gè)檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)；將一個(gè)批次新制備合成的sers基底分別在0，1，2，3個(gè)月的時(shí)候，平行點(diǎn)在硅片上5個(gè)點(diǎn)，共25個(gè)檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。

步驟(4)所述2種激素溶液的配制方法：取乙烯雌酚1.3mg溶于1.3ml80％甲醇中，制備得到1mg/ml的乙烯雌酚甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；17β-雌二醇1.35mg溶于1.35ml80％甲醇中，制備得到1mg/ml的17β-雌二醇甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

步驟(5)所述將2種激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用牛奶依次10倍稀釋，濃度范圍10^-3～10^-10m的加標(biāo) 牛奶，用spe固相萃取柱進(jìn)行純化富集，洗脫液濃縮至300μl待用。

步驟(6)所述將制備好的fe3o4@sio2-ag-c6sers基底用去離子水清洗2遍；加入300μl乙醇復(fù)溶；將300μl不同濃度的激素溶液和牛奶激素洗脫液，加入20μlfe3o4@sio2-ag-c6sers基底，配制激素的溶劑和空白牛奶作為對(duì)照，室溫下超聲30分鐘，點(diǎn)在硅片上，進(jìn)行拉曼檢測(cè)。便攜式拉曼光譜光譜儀型號(hào)為bws465-785h9(b&wtek公司)，激發(fā)波長(zhǎng)785nm，端口輸出功率為340mw，經(jīng)40×物鏡聚焦后，光斑直徑為105μm，拉曼信號(hào)由冷卻溫度為-2℃的ccd接收，拉曼光譜均用硅片在520.7cm-1處的拉曼峰來進(jìn)行校正。

步驟(7)所述選用了未檢出2種待測(cè)激素的超市購買的牛奶樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，在空白牛奶中分別加入1000、100和10μm/l的3個(gè)濃度的2種激素，然后用spe固相萃取柱對(duì)牛奶中激素進(jìn)行提取，提取液濃縮后，進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，然后根據(jù)激素的拉曼峰強(qiáng)度計(jì)算回收率。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果為：

本發(fā)明所述首次采用正己硫醇修飾的sers基底進(jìn)行二次增強(qiáng)，即fe3o4@sio2-ag-c6+棒銀的聯(lián)用方法。在富集樣品分子的同時(shí)，彌補(bǔ)了烷基硫醇吸附在銀殼表面可能導(dǎo)致的sers基底熱點(diǎn)效應(yīng)的減少。通過聯(lián)用sers基底完成了對(duì)2種激素的檢測(cè)，建立了一種可應(yīng)用于食品安全檢測(cè)的簡(jiǎn)單、高效、靈敏度高的表面增強(qiáng)拉曼光譜法。

本發(fā)明所述的聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法，聯(lián)用sers基底，既能富集溶液中激素分子，使sers基底表面能吸附更多的激素分子，同時(shí)又彌補(bǔ)了c6吸附在銀殼表面所帶來的拉曼信號(hào)的損失，二者結(jié)合對(duì)激素進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以獲得更強(qiáng)的拉曼信號(hào)。將聯(lián)用sers基底用于食品激素殘留分析檢測(cè)中，比國(guó)標(biāo)要求的檢測(cè)方法更簡(jiǎn)單、快速，獲得的檢測(cè)限更低，并具有較高的樣品回收率?？勺鳛橐环N有效的檢測(cè)方法用于各種食品中激素殘留的分析研究。

附圖/表說明

圖1為聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法中對(duì)聯(lián)用sers基底均一性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的考察研究。

圖2為聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法應(yīng)用于不同濃度乙烯雌酚溶液的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖3為聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法應(yīng)用于不同濃度17β-雌二醇的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖4為聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法中應(yīng)用于不同濃度牛奶中乙烯雌酚的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖5為聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法中應(yīng)用于不同濃度牛奶中17β-雌二醇的sers光譜與log-log關(guān)系圖。

圖6為聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法應(yīng)用于牛奶中乙烯雌酚、17β-雌二醇的加標(biāo)回收率計(jì)算數(shù)值。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

一種聯(lián)用sers基底的均一性、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察：

圖1給出的fe3o4@sio2-ag-c6+棒銀sers信號(hào)質(zhì)量研究圖。從圖1a可以看出，15條sers曲線基本相同，以乙烯雌酚拉曼特征峰1028cm^-1作為參考，計(jì)算獲得15個(gè)sers光譜拉曼峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.88％，表明基底具有較好的均一性。日間重復(fù)性，獲取25個(gè)拉曼光譜峰，日內(nèi)重復(fù)性獲取15個(gè)拉曼光譜峰，批次重復(fù)性，三次共采集15個(gè)拉曼光譜峰，如圖1b，c，d，在1028cm^-1位置處sers信號(hào)的強(qiáng)度值柱形圖分別顯示在b，c，d插圖，獲取的sers光譜顯示了較好的均一性，sers信號(hào)強(qiáng)度離散相對(duì)大一些。在聯(lián)用sers基底剛制備好、1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月后重新測(cè)試其sers光譜，測(cè)試得到的4組光譜如圖1e所示，2個(gè)月內(nèi)的sers信號(hào)強(qiáng)度均一性較好，具有良好的穩(wěn)定性，隨著時(shí)間的推移，3個(gè)月的sers信號(hào)略有降低。

實(shí)施例2

聯(lián)用sers基底檢測(cè)食品中激素的應(yīng)用方法用于兩種激素溶液的定性定量分析：

圖2是乙烯雌酚溶液的定性定量分析結(jié)果。我們對(duì)濃度范圍10^-5～10^-12m的乙烯雌酚溶液進(jìn)行拉曼檢測(cè)，并且以配制乙烯雌酚溶液的80％甲醇作為信號(hào)參照物，得到的sers光譜如圖2a所示。如圖2a所示，我們選擇1028cm^-1作為乙烯雌酚的特征峰繪制了log-log曲線，測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差以誤差棒的形式展現(xiàn)在圖中，在10^-5～10^-12m濃度范圍內(nèi)，獲得的線性方程為y＝12661+8044.1465x，r²＝0.97，線性關(guān)系良好。該方法對(duì)乙烯雌酚的檢測(cè)限為5pm(1.5ppt)。

圖3是17β-雌二醇溶液的定性定量分析結(jié)果。使用fe3o4@sio2-ag-c6+棒銀聯(lián)用基底對(duì)濃度范圍從10^-3～10^-8m的17β-雌二醇溶液進(jìn)行拉曼檢測(cè)，以80％甲醇作為信號(hào)參照物，得到的sers光譜如圖3a所示。如圖3a所示，隨著17β-雌二醇濃度的降低，其對(duì)應(yīng)sers 光譜中特征峰的強(qiáng)度降低，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示同一個(gè)濃度經(jīng)三次測(cè)量得到的平均值，這三次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差以誤差棒的形式展現(xiàn)在圖中。在10^-3～10^-8m濃度范圍內(nèi)，我們選擇1449cm^-1作為17β-雌二醇的特征峰繪制了log-log曲線，獲得線性方程y＝26124+2513.0450x，相關(guān)系數(shù)r²＝0.99，線性關(guān)系良好，該方法對(duì)17β-雌二醇的檢測(cè)限為10nm(2.7ppb)。

實(shí)施例3

圖4-圖6是牛奶中乙烯雌酚和牛奶中17β-雌二醇的定性定量分析結(jié)果。以空白牛奶作為信號(hào)參照物，得到的sers光譜如圖4a、圖5b所示。如圖4a，圖5b所示，我們分別選擇了譜圖中乙烯雌酚、17β-雌二醇的特征峰1028cm^-1和1449cm^-1，根據(jù)它們?cè)谌芤褐邢鄬?duì)應(yīng)的濃度繪制log-log曲線。隨著激素濃度降低，它們對(duì)應(yīng)sers光譜中特征峰的強(qiáng)度也逐步降低，乙烯雌酚和17β-雌二醇分別在10^-3～10^-10m和10^-3～10^-8m濃度范圍內(nèi)，線性方程分別為y＝40532+3495.8084x，r²＝0.99；y＝35161+3540.0586x，r²＝0.99，所有線性關(guān)系均良好。該方法對(duì)牛奶中乙烯雌酚、17β-雌二醇的檢測(cè)限分別為100pm(27ppt)，10nm(21ppb)。選用未檢出2種待測(cè)激素的超市購買的牛奶樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn)，在空白牛奶中分別加入1000、100和10μm/l的3個(gè)濃度的2種激素，然后用spe固相萃取柱對(duì)牛奶中激素進(jìn)行提取，提取液濃縮后，進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，圖6為根據(jù)乙烯雌酚和17β-雌二醇的拉曼峰強(qiáng)度計(jì)算的回收率結(jié)果。通過spe固相萃取法獲得2種激素的拉曼峰強(qiáng)度和樣品濃度在10～1000μm/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率在88.72％～110.04％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在13.25％～17.05％，該方法具有較高的回收率，完全可以滿足對(duì)食品中激素殘留分析的要求。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能依此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。