本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，特別是涉及一種用于檢測牛布魯菌病的ELISPOT檢測試劑盒及其在牛布魯菌病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
牛布魯菌病(以下簡稱“牛布病”)是由布魯菌引起的人獸共患慢性傳染病，家畜感染以后會出現(xiàn)不育以及流產(chǎn)等癥狀，公牛會出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎以及睪丸炎，使配種能力明顯下降，嚴重地威脅著牛群的健康狀況，對畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康造成非常大的危害。布魯菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，感染機體后可引起細胞免疫應(yīng)答。細胞免疫應(yīng)答可以產(chǎn)生一系列的細胞因子，這些細胞因子在機體對抗感染的過程中發(fā)揮重要的作用。在機體感染布魯菌時，特定的免疫原性蛋白可以激活T細胞反應(yīng)，包括活化巨噬細胞和CD4+、CD8+毒性T細胞，產(chǎn)生幾種重要的細胞因子，如γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。這些細胞因子在清除機體內(nèi)布魯菌的過程中起著重要的作用。特別是IFN-γ的分泌是宿主產(chǎn)生T細胞免疫反應(yīng)的重要指標，其在對抗布魯菌感染中發(fā)揮重要作用，通過檢測抗原特異性的IFN-γ分泌狀況可間接反映布魯菌感染后產(chǎn)生的機體細胞免疫狀況。IFN-γ主要是由特異性抗原刺激而活化的CD4+Th1細胞、CD8+T細胞及NK細胞等產(chǎn)生的細胞因子，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫調(diào)節(jié)功能，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。IFN-γ的免疫學(xué)檢測是在特異性抗IFN-γ單克隆抗體(McAb)的基礎(chǔ)上建立的用于對樣本中的IFN-γ進行定性定量分析的實驗方法。應(yīng)用不同的單抗標記物和檢測技術(shù)，已經(jīng)開發(fā)出多種方法，如ELISA，酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)，流式細胞術(shù)(FCM)分析法等?，F(xiàn)階段布病的檢測手段主要包括以下幾種：(1)細菌學(xué)方法，通過培養(yǎng)病原體，根據(jù)其生物學(xué)特征進行判斷，診斷的可靠性和準確性較高；(2)分子生物學(xué)技術(shù)，如建立的布魯菌屬特異性的PCR檢測方法、針對布魯菌的插入序列IS711建立了AMOS-PCR方法等；(3)血清學(xué)診斷方法，包括試管凝集試驗(SAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)、補體結(jié)合試驗(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等；(4)布魯菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，其抗原為布魯菌素(以下簡稱Br-PPD)。但是，上述檢測方法仍然不能滿足本領(lǐng)域?qū)ε２剪斁腥镜奶禺愋詸z測的現(xiàn)實需要；且上述檢測方法，不能滿足本領(lǐng)域?qū)ε２剪斁腥驹缙跈z測的現(xiàn)實需要。雖然目前ELISA是公認的特異性和敏感性相對較高的布病診斷方法，但其基于體液免疫檢測，特異性不理想。由于耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O517等革蘭氏陰性細菌中的脂多糖(LPS)與布魯菌的LPS具有極高的同源性，抗原結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，血清學(xué)檢測時經(jīng)常出現(xiàn)交叉反應(yīng)，從而使針對特異性抗體檢測方法的特異性受到一定程度影響，其中也包括ELISA檢測試劑盒的特異性。因此需要建立特異性更好的試劑盒用于牛布病的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種針對牛布病的ELISPOT檢測試劑盒，該試劑盒能夠?qū)ε２疾∵M行高度特異性地檢測。本發(fā)明的ELISPOT檢測試劑盒還能夠?qū)崿F(xiàn)牛布病的早期檢測。本發(fā)明涉及一種用于檢測牛布魯菌病ELISPOT檢測試劑盒，所述ELISPOT檢測試劑盒包括：支持介質(zhì)、捕獲抗體、檢測抗體、陰性對照和陽性對照、特異性刺激劑，其中，所述捕獲抗體為第一牛γ干擾素單克隆抗體，所述檢測抗體為經(jīng)過標記的第二牛γ干擾素單克隆抗體，特異性刺激劑為布魯菌素Br-PPD，其中，所述支持介質(zhì)與試劑接觸面上有微孔濾膜；所述捕獲抗體包被在支持介質(zhì)上或所述捕獲抗體與支持介質(zhì)分別放置；以及所述捕獲抗體與所述檢測抗體能與牛γ干擾素共同發(fā)生抗原抗體結(jié)合作用。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的檢測試劑盒在用于非診斷目的牛布魯菌感染檢測中的應(yīng)用，其中，所述非診斷目的包括流行病學(xué)分析和研究、離體組織進行檢測、表位鑒定研究以及定性和定量檢驗布魯菌抗原特異的牛IFN-γ。本發(fā)明的技術(shù)效果：本發(fā)明試劑盒中所采用的由雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有效價高、特異性好、與天然抗原親和力強的優(yōu)勢。本發(fā)明基于Br-PPD的ELISPOT試劑盒，相比于其他的基于抗體的商品化ELISA試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)牛布魯菌感染的早期檢測。并且，由于本發(fā)明基于Br-PPD的試劑盒為基于細胞水平的檢測，相比于ELISA試劑盒，排除了交叉反應(yīng)造成的假陽性的干擾，顯示出良好的特異性。附圖說明圖1為實施例2中根據(jù)本發(fā)明的ELISPOT試劑盒的?？鼓獦悠窓z測結(jié)果：A.PWM刺激牛抗凝血檢測結(jié)果；B.未刺激牛抗凝血檢測結(jié)果；圖2為實施例3中根據(jù)本發(fā)明的ELISPOT試劑盒的?？鼓獦悠窓z測結(jié)果圖：A.PWM刺激?？鼓獧z測結(jié)果；B.Br-PPD刺激牛抗凝血檢測結(jié)果；C.未刺激牛抗凝血檢測結(jié)果。具體實施方式以下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。本發(fā)明提供了一種用于檢測牛布魯菌病ELISPOT檢測試劑盒，所述ELISPOT檢測試劑盒包括：支持介質(zhì)、捕獲抗體、檢測抗體、陰性對照和陽性對照、特異性刺激劑，其中，所述捕獲抗體為第一牛γ干擾素單克隆抗體，所述檢測抗體為經(jīng)過標記的第二牛γ干擾素單克隆抗體，特異性刺激劑為布魯菌素Br-PPD，其中，所述支持介質(zhì)與試劑接觸面上有微孔濾膜；所述捕獲抗體包被在支持介質(zhì)上或所述捕獲抗體與支持介質(zhì)分別放置；以及所述捕獲抗體與所述檢測抗體能與牛γ干擾素共同發(fā)生抗原抗體結(jié)合作用。術(shù)語“ELISPOT”為酶聯(lián)免疫斑點實驗(Enzyme-linkedImmunospot)的簡稱，具有高度敏感性，現(xiàn)已成為近年來應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法之一，在疫苗研發(fā)、臨床診斷以及基礎(chǔ)研究等方面得到廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的進行IFN-γ檢測的抗病毒活性分析方法(AVA)相比，建立在免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上的IFN-γ檢測方法的靈敏度和特異性更高，作為細胞免疫狀態(tài)的重要指標，針對IFN-γ的ELISPOT檢測方法目前已被廣泛地用于研究基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)、疫苗免疫效果評估、器官移植、過敏反應(yīng)以及多種胞內(nèi)病原感染的診斷等。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述第一牛γ干擾素單克隆抗體為牛γ干擾素單克隆抗體2G5，所述牛γ干擾素單克隆抗體2G5由保藏號為CCTCCNO：C2012107的雜交瘤細胞株2G5或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生；以及所述第二牛γ干擾素單克隆抗體為牛γ干擾素單克隆抗體5E11，所述牛γ干擾素單克隆抗體5E11由保藏號為CCTCCNO：C2012108的雜交瘤細胞株5E11或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生。雜交瘤細胞株2G5和雜交瘤細胞株5E11公開于專利CN102965343B。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述支持介質(zhì)為微孔濾膜板。更優(yōu)選地，所述支持介質(zhì)為披覆PVDF薄膜微孔培養(yǎng)板。其中，優(yōu)選地，所述支持介質(zhì)與試劑接觸面上有PVDF膜。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述捕獲抗體包被在微孔濾膜板中。所述ELISPOT檢測試劑盒中，微孔濾膜板可以事先包被有捕獲抗體，也可以只提供空白微孔濾膜板與捕獲抗體，在檢測前由操作者自行采用常規(guī)方法在微孔濾膜板上包被捕獲抗體。所述微孔濾膜板可為各種常見規(guī)格的微孔濾膜板，如96孔濾膜板。在本發(fā)明提供的牛布病ELISPOT檢測試劑盒中，所述第二牛γ干擾素單克隆抗體不同于所述第一牛γ干擾素單克隆抗體。優(yōu)選地，所述標記包括生物素標記或堿性磷酸酶標記。更優(yōu)選地，所述標記為生物素標記。所述標記牛IFN-γ單克隆抗體的方法采用常規(guī)。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述試劑盒中還包括下列試劑中的一種或多種：1)親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物；2)底物液；3)濃縮PBS緩沖液、封閉液、細胞培養(yǎng)液、洗滌液。上述試劑均為ELISOPT檢測中的通用試劑，不受具體檢測項目的限制，因此即可根據(jù)需要有選擇地加入檢測方法中，也可由操作者自行配置或者單獨購買。為方便操作者，最優(yōu)的選擇是方法中同時包括親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物、底物液和洗滌液。所述底物液可為ELISPOT檢測方法中常用的通用底物液，如液氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)底物液。所述洗滌液可為ELISPOT檢測試劑盒中常用的洗滌液，如磷酸鹽緩沖液或磷酸鹽吐溫緩沖液等?？梢愿鶕?jù)需要選用濃縮或未濃縮的洗滌液。進一步的，所述方法中還可以有選擇地包括其他ELISPOT檢測所需通用試劑，如封閉液、細胞培養(yǎng)液(完全1640培養(yǎng)液)等。所述封閉液可為包被微孔濾膜板常用的封閉液，如脫脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。通常情況下，本發(fā)明的ELISPOT檢測試劑盒中，各試劑分別隔離儲存。利用本發(fā)明的ELISPOT檢測試劑盒檢測牛抗凝血樣品的檢測方法包括下列步驟：1、捕獲抗體包被微孔濾膜板；2、抗凝血孵育及檢測①無菌采取1mL牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；②在上述捕獲抗體包被的微孔濾膜板中加入下列試劑：每個抗凝血樣品包括3個試驗孔，50μL細胞培養(yǎng)液至陰性對照孔，50μL細胞培養(yǎng)液稀釋的PWM至陽性對照孔(終濃度為5μg/mL)，50μL細胞培養(yǎng)液稀釋的特異性刺激劑Br-PPD至試驗孔(終濃度為10μg/mL)。上述每孔加入50μL牛抗凝血，將96孔濾膜板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時；③棄培養(yǎng)上清，洗板后，加入1μg/mL的生物素標記牛γ干擾素單克隆抗體，100μL/孔，置于37℃孵育1小時；④洗板，加入1：1000稀釋的親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小時；⑤每孔加入100μL底物液，放置于室溫避光顯色。在微孔濾膜板中加入純凈水終止反應(yīng)，去除液體，室溫下過夜或37℃烤箱中2-3小時烘干；⑥使用倒置顯微鏡計數(shù)每個反應(yīng)孔中紫色的斑點，每一個點代表一個分泌牛γ干擾素的T細胞；或?qū)⑽⒖诪V膜板放入ELISPOT儀中，對實驗結(jié)果進行掃描計數(shù)和分析。本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的檢測試劑盒在用于非診斷目的的牛布魯菌感染檢測中的應(yīng)用，其中，所述非診斷目的包括流行病學(xué)分析和研究、離體組織進行檢測、表位鑒定研究以及定性和定量檢驗布魯菌抗原特異的牛IFN-γ。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述應(yīng)用為用于非診斷目的的牛布魯菌感染或布魯菌抗原特異的牛IFN-γ的早期檢測中的應(yīng)用。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實施例1本發(fā)明的基于Br-PPD的牛布病ELISPOT檢測試劑盒的制備ELISPOT試劑盒組裝步驟如下：1)牛γ干擾素單克隆抗體2G5的純化分泌牛γ干擾素單克隆抗體2G5的雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔，待產(chǎn)生腹水后，收集腹水，將收集的2G5腹水使用ProteinG親和層析方法進行純化。2)生物素標記牛γ干擾素單克隆抗體(記為Bio-5E11)的制備分泌牛γ干擾素單克隆抗體5E11的雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔，待產(chǎn)生腹水后，收集腹水，將收集的5E11腹水使用ProteinG親和層析方法進行純化。將純化的5E11單抗采用標準生物素標記法進行標記：溶解2～10mg單抗5E11蛋白于1mL的磷酸鹽緩沖液中，并計算溶解的毫摩爾數(shù)；平衡生物素至室溫，加2mgSulfo-NHS-Biotin于100μL超純水中，加入一定濃度的生物素；室溫30分鐘，或冰上放置2小時；用30mLPBS預(yù)洗純化柱，上樣，加入與欲收集量相同的緩沖液，收集0.5mL或1mL于單獨的管中，以280nm的吸收值測定單抗蛋白含量。本發(fā)明的5E11單抗也可以使用本領(lǐng)域公知的其他方法進行標記。3)將96孔濾膜板、單抗2G5、生物素標記牛γ干擾素單克隆抗體Bio-5E11、特異性刺激劑布魯菌素Br-PPD、陰性對照(完全1640培養(yǎng)基)和陽性對照(美洲商陸PWM)分別包裝組裝成試劑盒。進一步的，試劑盒中依據(jù)需要組裝入：親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物、NBT/BCIP底物液、濃縮PBS緩沖液、封閉液、細胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液或磷酸鹽吐溫緩沖液中的一種或多種。試劑盒中，微孔濾膜板、單抗2G5也可采用預(yù)先包被了牛γ干擾素單克隆抗體2G5的微孔濾膜板替代。包被牛γ干擾素單克隆抗體2G5的微孔濾膜板的制備方法：①96孔濾膜板中加入2.5μg/mL的捕獲牛γ干擾素抗體2G5，100μL/孔，4℃過夜包被；②棄包被液，使用含有0.05％吐溫的滅菌PBST洗板3次，5min/次；③加入含10％胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基，200μL/孔，37℃孵育封閉2h；④棄封閉液，使用PBST洗板1次，將96孔濾膜板放于密封袋中，置4℃保存。上述制備的牛γ干擾素單克隆抗體2G5的微孔濾膜板需在1周內(nèi)使用。實施例2基于非特異性刺激劑PWM的ELISPOT檢測試劑盒檢測牛外周血樣品1.實驗材料使用實施例1中制備的牛布病ELISPOT檢測試劑盒。2.抗凝血孵育及檢測①無菌采取1mL牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；②在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑：每個抗凝血樣品包括2個試驗孔，50μL細胞培養(yǎng)液至陰性對照孔，50μL細胞培養(yǎng)液稀釋的PWM至陽性對照孔(終濃度為5μg/mL)，上述每孔加入50μL牛抗凝血，將96孔濾膜板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時；③將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛γ干擾素檢測抗體Bio-5E11，100μL/孔，置于37℃孵育1小時；④用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀釋的親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小時；⑤每孔加入100μL底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室溫避光顯色。在96孔濾膜板中加入純凈水終止反應(yīng)，去除液體，室溫下過夜或37℃烤箱中2-3小時烘干；⑥使用倒置顯微鏡計數(shù)每個反應(yīng)孔中紫色的斑點，每一個點代表一個分泌牛γ干擾素的T細胞；或?qū)?6孔濾膜板放入ELISPOT儀中，對實驗結(jié)果進行掃描計數(shù)和分析。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示在檢測?？鼓獦悠窌r，陽性對照孔(A)中出現(xiàn)的有效斑點數(shù)顯著多于陰性對照孔(B)，結(jié)果表明本發(fā)明的試劑盒可用于對牛外周抗凝血進行直接檢測，結(jié)果同樣可以有效檢測出PWM刺激牛抗凝血中分泌牛IFN-γ的T淋巴細胞，本發(fā)明的試劑盒具有較好的靈敏度和特異性。實施例3使用本發(fā)明的基于特異性刺激劑Br-PPD的牛布病ELISPOT檢測試劑盒檢測牛外周血樣品1.實驗材料使用實施例1中制備的牛布病ELISPOT檢測試劑盒。2.抗凝血孵育及檢測①無菌采集1mL布病陽性牛的血液加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；②在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑：每個抗凝血樣品包括3個試驗孔，50μL細胞培養(yǎng)液至陰性對照孔，50μL細胞培養(yǎng)液稀釋的PWM至陽性對照孔(終濃度為5μg/mL)，50μL細胞培養(yǎng)液稀釋的特異性刺激劑Br-PPD至試驗孔(終濃度為10μg/mL)。上述每孔加入50μL牛抗凝血，將96孔濾膜板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時；③將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛γ干擾素檢測抗體Bio-5E11，100μL/孔，置于37℃孵育1小時；④用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀釋的親和素-堿性磷酸酶結(jié)合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小時；⑤每孔加入100μL底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室溫避光顯色。在96孔濾膜板中加入純凈水終止反應(yīng)，去除液體，室溫下過夜或37℃烤箱中2-3小時烘干；⑥使用倒置顯微鏡計數(shù)每個反應(yīng)孔中紫色的斑點，每一個點代表一個分泌牛γ干擾素的T細胞；或?qū)?6孔濾膜板放入ELISPOT儀中，對實驗結(jié)果進行掃描計數(shù)和分析。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明本發(fā)明的試劑盒也可用于對?？鼓M行直接檢測，結(jié)果同樣可以檢測出陽性孔中分泌牛γ干擾素的T淋巴細胞。3.試驗有效的條件PWM陽性對照孔中斑點數(shù)大于陰性對照孔中斑點數(shù)，且PWM陽性對照孔中斑點數(shù)>20，判定抗凝血樣品有效。4.牛布病結(jié)果判定①如果陰性對照孔中斑點數(shù)<5，Br-PPD檢測孔中斑點數(shù)減去陰性對照孔中斑點數(shù)>6時；②如果陰性對照孔中斑點數(shù)>6，Br-PPD檢測孔中斑點數(shù)>2倍陰性對照孔中斑點數(shù)時；出現(xiàn)以上任一檢測結(jié)果，判定為牛布病陽性，反之則判為陰性。結(jié)果顯示本發(fā)明的試劑盒可以有效檢測出牛布病抗原特異性分泌牛γ干擾素的T淋巴細胞。實施例4基于Br-PPD的牛布病外周血γ干擾素ELISPOT檢測試劑盒與布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒結(jié)果比較地點：江蘇某牛場。時間：2014年2月。試驗頭數(shù)：150頭。本試驗檢測了一定數(shù)量的臨床奶牛抗凝血樣品，并且與布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒(SVANOVIR)進行對比，以進一步確認Br-PPD作為牛布病外周血γ-干擾素體外釋放試驗刺激原的效果。IFN-γ試驗方法和結(jié)果判定同實施例3所述，結(jié)果如表1所示。表1.Br-PPD用于牛IFN-γ體外釋放試驗結(jié)果與布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒結(jié)果對比(單位：頭)“+”代表陽性，“-”代表陰性。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，基于Br-PPD進行的牛IFN-γ體外釋放試驗與布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒結(jié)果的陽性符合率為70.8％(17/24)，陰性符合率為88.9％(112/126)，總符合率為86.0％(129/150)，具有良好的檢測效果，顯示其在牛布病診斷中具有較好的診斷價值。實施例5：基于Br-PPD的牛布病ELISPOT檢測試劑盒用于布魯菌感染的早期檢測地點：江蘇某牛場。時間：2015年4月。試驗頭數(shù)：12頭。所有實驗?zāi)膛＞鶠樾猿墒烨椅丛心膛?，無布魯菌疫苗免疫史，無相關(guān)疾病感染。共計12頭，6頭免疫實驗組(每頭奶牛注射4.4×109CFU的S19疫苗)和6頭實驗對照組(僅注射生理鹽水)。自免疫起48h內(nèi)對牛嚴格觀察奶牛是否有過激反應(yīng)。血清樣品用布魯菌間接酶聯(lián)免疫吸附(iELISA)試驗抗體檢測試劑盒(SVANOVIR)檢測?？鼓獦悠吠绞褂门２疾LISPOT檢測試劑盒進行檢測。S19疫苗免疫后，在第0、3、7、15、30等天分別對免疫組奶牛和對照組奶牛采集血清樣品進行抗體水平的檢測，免疫組部分奶牛的抗體分泌水平在一周后開始逐步上升，15天左右奶牛抗體維持在一個較高水平，且會持續(xù)較長時間。而對照組奶牛的抗體分泌水平則一直保持較低水平。S19株免疫后，分別在第0、3、7、15、30等天采全血樣品，并同步進行基于Br-PPD的牛布病ELISPOT檢測試劑盒檢測。在S19疫苗免疫后第3天，Br-PPD刺激全血后的T淋巴細胞斑點數(shù)無論是與第一次試驗(第0天)檢測結(jié)果相比，還是與對照組的試驗結(jié)果相比，均有顯著提高。實驗結(jié)果顯示，在布魯菌感染過程中，γ干擾素的產(chǎn)生比抗體更早，牛布病ELISPOT檢測試劑盒可彌補基于抗體的檢測方法，如ELISA檢測試劑盒的缺陷，用于布魯菌感染的早期檢測。實施例6：基于Br-PPD的牛布病ELISPOT檢測試劑盒檢測無布病牛群地點：江蘇某牛場。時間：2015年6月。試驗頭數(shù)：100頭。所有實驗?zāi)膛＞鶠樾挛魈m進口荷斯坦牛，為布病凈化牛群。血清樣品用布魯菌iELISA抗體檢測試劑盒(SVANOVIR)、布魯菌cELISA抗體檢測試劑盒(SVANOVIR)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)抗原(青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心)進行檢測?？鼓獦悠吠绞褂没贐r-PPD的牛布病ELISPOT檢測試劑盒進行檢測。結(jié)果如表2所示。表2.不同檢測方法在布病凈化牛群中檢測效果比較檢測方法檢測樣品數(shù)(頭)陽性數(shù)(頭)陽性率iELISA10022％cELISA10011％RBPT10033％ELISPOT10000％結(jié)果顯示，在布病凈化牛群中，牛布病外周血γ干擾素ELISPOT檢測試劑盒的特異性為100％，而其它三種基于抗體的檢測方法都存在一定比例的假陽性。由于耶爾森氏菌09和大腸桿菌O517等革蘭氏陰性細菌中的脂多糖(LPS)與布魯菌的LPS具有極高的同源性，抗原結(jié)構(gòu)幾乎一致，血清學(xué)檢測時經(jīng)常出現(xiàn)交叉反應(yīng)，從而使基于抗體的檢測方法的特異性受到一定程度影響。而基于Br-PPD的牛布病外周血γ干擾素ELISPOT檢測試劑盒排除了該方面的干擾，顯示其具有良好的特異性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。