本發(fā)明屬于生化免疫分析領(lǐng)域,具體涉及肺結(jié)核相關(guān)血清標(biāo)識(shí)蛋白timp-1及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
人結(jié)核病是主要由結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis,m.tb)引起的一種慢性消耗性傳染病。盡管結(jié)核分枝桿菌可侵害人體多個(gè)器官組織,但肺結(jié)核是最主要的結(jié)核病類型。據(jù)估計(jì),全球每年有約800萬新發(fā)病例,約200萬死亡病例,80%的病人在發(fā)展中國家。目前國內(nèi)外用于結(jié)核病預(yù)防的唯一疫苗是卡介苗(bcg)。該疫苗對(duì)兒童具有一定的保護(hù)作用,但對(duì)成人的保護(hù)效果極差。而且對(duì)兒童的保護(hù)效果世界各地報(bào)道不一,波動(dòng)很大。因此,早診斷早治療仍然是結(jié)核病防控的重要手段。
目前用于結(jié)核病診斷的方法除了臨床上常用的胸部x光透視、氣管內(nèi)窺鏡結(jié)合活檢取樣檢測、痰液涂片鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)等檢測方法之外,還有免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法。細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測通常對(duì)生物安全水平的要求很高,且該菌生長慢,分離和純化鑒定需1月以上,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,分菌率低,因此,不適合作常規(guī)檢測;分子生物學(xué)方法對(duì)儀器設(shè)備和操作人員均有較高要求;因此,免疫學(xué)方法在結(jié)核病診斷方面的應(yīng)用比較普遍。
一般認(rèn)為,結(jié)核病的免疫反應(yīng)特點(diǎn)表現(xiàn)為細(xì)胞免疫和體液免疫分離,在感染初期表現(xiàn)為細(xì)胞免疫占優(yōu)勢,發(fā)病后期則表現(xiàn)為體液免疫占優(yōu)勢。傳統(tǒng)的結(jié)核菌素(ppd)皮內(nèi)變態(tài)方法主要是基于細(xì)胞免疫原理,該方法靈敏性高,已沿用百余年,但是特異性較差,環(huán)境分枝桿菌感染者具有交叉反應(yīng),免疫低下個(gè)體可能不出現(xiàn)反應(yīng);由于bcg與結(jié)核菌素具有交叉反應(yīng),發(fā)展中國家兒童普遍接種bcg,疫苗免疫反應(yīng)干擾皮試檢測。目前市場上以外周血淋巴細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌抗原體外刺激下釋放ifn-γ為原理設(shè)計(jì)的檢測方法靈敏度高,但檢測的是感染狀態(tài),與結(jié)核病的病理過程無直接聯(lián)系。結(jié)核病是一高感染率、低發(fā)病率的慢性疾病,只有5%-10%的感染者將發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病,而其中絕大多數(shù)病人為肺結(jié)核。因此,尋找與發(fā)病相關(guān)、尤其是與肺結(jié)核相關(guān)的診斷標(biāo)識(shí)分子對(duì)結(jié)核病治療和控制具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,利用細(xì)胞因子和全蛋白芯片對(duì)結(jié)核病人的宿主蛋白進(jìn)行篩選,提供一種與檢測肺結(jié)核相關(guān)的血清生物標(biāo)識(shí)蛋白,該標(biāo)識(shí)蛋白可用于肺結(jié)核患者血清蛋白生物標(biāo)識(shí)物,建立肺結(jié)核患者基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子((metalloproteinaseinhibitor1,簡稱timp-1)表達(dá)的檢測方法,為活動(dòng)性和原發(fā)性肺結(jié)核的及時(shí)診斷和治療提供支持。
本發(fā)明利用結(jié)核分枝桿菌特異蛋白cfp10/esat6模擬結(jié)核分枝桿菌對(duì)全血進(jìn)行刺激,利用細(xì)胞因子芯片(raybiotech516點(diǎn))對(duì)刺激后的上清液進(jìn)行檢測,共分析了510種細(xì)胞因子。經(jīng)ce蛋白刺激后,有67種細(xì)胞因子表達(dá)量增高了1.9倍以上,43種下調(diào)了至少2.0倍。其中包括炎性因子,免疫調(diào)節(jié)因子,趨化因子,生長因子,血管原性因子,可溶性受體,粘附因子等。同時(shí),利用蛋白芯片分析(springbio芯片656點(diǎn)),對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病人、潛伏感染者、肺癌病人和健康對(duì)照人血漿中651種蛋白進(jìn)行了直接檢測,結(jié)果僅在活動(dòng)性結(jié)核病人血漿中表達(dá)升高1.9倍以上的蛋白有21種,下調(diào)2.0倍以上的蛋白有72種。在上調(diào)的蛋白中包括角蛋白,神經(jīng)絲蛋白,與基因修復(fù)相關(guān)蛋白,熱休克蛋白等。
對(duì)timp-1實(shí)施進(jìn)一步驗(yàn)證,利用基于timp-1抗原的elisa檢測了125份活動(dòng)性結(jié)核病例和90份健康對(duì)照者血清驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)timp-1對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核病人的檢測敏感性可達(dá)100%,特異性可達(dá)92%。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)timp-1可以作為一個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo),在肺結(jié)核病臨床診斷、鑒別診斷和有效觀察中具有標(biāo)識(shí)蛋白的作用,為以后結(jié)核病患者血清蛋白的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ),并為從分子水平診斷結(jié)核提供新的技術(shù)思路,具有重大的理論意義和潛在的使用價(jià)值。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種與肺結(jié)核病相關(guān)的血清蛋白的篩選和檢測,包括以下步驟:
1.利用細(xì)胞因子芯片檢測外周血刺激表達(dá)蛋白
利用raybiotech細(xì)胞因子抗體芯片(raybiotech516點(diǎn))對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原cfp10/esat6刺激后的結(jié)核病人和健康對(duì)照者外周血血漿進(jìn)行芯片檢測,包括510種細(xì)胞因子。獲得上調(diào)與下調(diào)的細(xì)胞因子。
2.蛋白芯片檢測血漿蛋白
利用蛋白芯片(springbio芯片656點(diǎn))直接檢測結(jié)核病人和對(duì)照者血漿蛋白:對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病人、潛伏感染者、肺癌病人和健康對(duì)照人血漿中651種蛋白進(jìn)行了直接檢測,獲得僅在活動(dòng)性結(jié)核病人血漿中表達(dá)顯著升高或降低的蛋白質(zhì)。
3.timp-1的鑒別檢測肺結(jié)核中的應(yīng)用
兩種芯片的檢測結(jié)果均表明,timp-1表達(dá)與肺結(jié)核相關(guān)。因此建立了timp-1檢測的elisa方法,進(jìn)一步對(duì)125份活動(dòng)性結(jié)核病例和90份健康對(duì)照者血清進(jìn)行驗(yàn)證檢測,發(fā)現(xiàn)timp-1對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的敏感性可達(dá)100%,特異性可達(dá)92%;且能夠區(qū)分原發(fā)性結(jié)核病及繼發(fā)性結(jié)核病例。因此確定timp-1可用于肺結(jié)核病患者診斷的血清標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)。
生物功能驗(yàn)證表明,本發(fā)明的肺結(jié)核病相關(guān)血清蛋白生物標(biāo)識(shí)物timp-1可在制備肺結(jié)核病血清液檢測試劑盒中應(yīng)用。
本發(fā)明的效果在于:首次發(fā)現(xiàn)并篩選到一種血清蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子timp-1作為一個(gè)重要的血清液生物學(xué)檢測指標(biāo),在肺結(jié)核病的診斷、鑒別診斷和有效觀察中發(fā)揮作用,為今后肺結(jié)核病血清蛋白的研究提供了依據(jù),并從血清液蛋白分子水平診斷肺結(jié)核病提供新方向,具有重要的理論價(jià)值和潛在實(shí)用意義。
附圖說明
序列表seqidno:1是本發(fā)明克隆的血清蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子timp-1的蛋白質(zhì)序列。
圖1:血清蛋白timp-1在肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者中的差異表達(dá)。
圖2:血清蛋白timp-1在肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者全血esat6/cfp10刺激后上清中的差異表達(dá)。
圖3:血清蛋白timp-1在m.bovis和bcg感染的人巨噬細(xì)胞系thp-1中的表達(dá)水平差異。
圖4:springbio抗體高通量芯片主要原理圖。附圖標(biāo)記說明:用biotin標(biāo)記的蛋白樣品,與芯片進(jìn)行雜交,加入鏈霉親和素與樣品中蛋白結(jié)合后被熒光標(biāo)記的抗體識(shí)別。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
以下通過肺結(jié)核相關(guān)標(biāo)識(shí)蛋白的發(fā)現(xiàn)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
1.血液樣本的搜集與制備
(1)樣本收集
結(jié)核病人血液樣本(抗凝全血或血清)樣本來自于武漢市醫(yī)療救治中心,根據(jù)臨床診斷、x影像、痰菌培養(yǎng)等各種手段,確定為活動(dòng)性肺結(jié)核病,存在有明顯結(jié)核病灶或空洞,且排除掉愛滋病、泌尿道疾病等并發(fā)癥的新收治病人。111個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病人中,男性71人,女性40人;痰涂片陽性病例58份,陰性20份,其余病例沒有對(duì)應(yīng)結(jié)果;痰菌培養(yǎng)陽性病例13份,陰性23份,其余為沒有對(duì)應(yīng)結(jié)果;ppd皮試陽性病例46份,陰性12份,其余為沒有對(duì)應(yīng)結(jié)果;74例病人有明顯病灶。
284個(gè)健康對(duì)照為大學(xué)生志愿者。所有志愿者均經(jīng)過x射線胸透檢測,均未見病灶或空洞。經(jīng)專業(yè)醫(yī)師對(duì)志愿者對(duì)其中46人進(jìn)行ppd皮試反應(yīng)檢測,陽性35人,陰性11人,其中包括男性30人,女性16人。
(2)血液樣本處理
抽取肝素抗凝全血5ml,將全血與rpmi-1640完全培養(yǎng)基(購自hyclone公司)以體積比為1:1混合,按總體積2ml/每孔的量分別轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。于第1個(gè)孔中加入20μg的植物血凝素(pha),作為陽性對(duì)照;在第2個(gè)孔中加入20μg結(jié)核分枝桿菌特異蛋白cfp10/esat6融合蛋白),作為測試孔,于第3孔中加入10μl生理鹽水,作為陰性對(duì)照。將孔中各試劑與血液輕輕混合,放于37℃含5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~16h。cfp10/esat6融合蛋白基因來自于人結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)h37rv菌株基因組(genban序列號(hào):genbank:al123456.3),該菌株由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所李傳友教授惠贈(zèng)??寺『痛竽c桿菌表達(dá)和融合蛋白純化按常規(guī)方法進(jìn)行[1]。
2.細(xì)胞因子芯片檢測
(1)樣本準(zhǔn)備
用ifn-γ體外釋放方法[2]檢測樣本后,在111份活動(dòng)性肺結(jié)核病例中篩選出ifn-γ釋放法陽性值最高的5份刺激液上清,將結(jié)核分枝桿菌特異蛋白esat6/cfp10刺激后上清和生理鹽水刺激上清(陰性對(duì)照)每份各吸取20μl充分混合后進(jìn)行raybiotech細(xì)胞因子抗體芯片檢測。
(2)芯片檢測
raybiotech細(xì)胞因子抗體芯片由上??党缮锕こ逃邢薰局苽浜屯瓿蓹z測,檢測所需試劑均由該公司提供。主要檢測步驟如下:
1)將細(xì)胞因子抗體芯片膜于封閉液(raybio)中封閉。
2)加入100μl處理好的樣本,4℃作用過夜。
3)加入標(biāo)記好的抗體(來源于芯片配套試劑),在室溫下作用1h。
4)加入化學(xué)發(fā)光底物后,將芯片進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測,將x射線膠片曝光在膠片上顯示檢測結(jié)果。
利用raybiotech細(xì)胞因子抗體芯片共檢測了esat6/cfp10刺激后上清及陰性對(duì)照各510種細(xì)胞因子。膠片曝光后得到2組結(jié)果,每組結(jié)果各516點(diǎn)信號(hào)(包括6個(gè)對(duì)照點(diǎn))。esat6/cfp10刺激后上清中細(xì)胞因子與陰性對(duì)照相比差異較為顯著。67種細(xì)胞因子的表達(dá)量增高了1.9倍以上,其中包括炎性因子,免疫調(diào)節(jié)因子,趨化因子,生長因子,血管原性因子,可溶性受體,粘附因子等。相反的,43種細(xì)胞因子經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異蛋白esat6/cfp10刺激后下調(diào)了至少2.0倍。其它細(xì)胞因子的變化倍數(shù)介于0.6~1.0或1.0~1.8倍之間。
3.蛋白芯片檢測
(1)樣本準(zhǔn)備
ifn-γ體外釋放方法檢測后,在111份活動(dòng)性肺結(jié)核病例中篩選出ifn-γ釋放法陽性值最高的5份血漿,每份吸取20μl后充分混合備用。選取5份ifn-γ檢測最低,同時(shí)抗體檢測最低,ppd反應(yīng)為陰性的健康志愿者血漿,每份吸取20μl后充分混合備用。選取5份ifn-γ檢測為陽性的健康志愿者血漿作為潛伏感染者血漿,每份吸取20μl后充分混合備用。選取5份肺癌病人血漿,每份吸取20μl后充分混合備用。每份混合血漿分別進(jìn)行springbio抗體高通量芯片檢測。
(2)芯片檢測
springbio抗體高通量芯片(656點(diǎn),其中651個(gè)蛋白點(diǎn),4個(gè)對(duì)照點(diǎn))由上??党缮锕こ逃邢薰局苽浜屯瓿蓹z測,檢測所需試劑均由該公司提供。主要檢測步驟如下:
1)將抗體芯片膜至于封閉液(springbio)中封閉。
2)加入用biotin標(biāo)記的樣品,與芯片進(jìn)行雜交,4℃作用過夜。
3)加入鏈霉親和素,與樣品中蛋白結(jié)合。
4)加入熒光標(biāo)記的抗體,在室溫下作用1h。
5)掃描儀掃描熒光信號(hào)。(見圖4)
springbio抗體高通量芯片檢測了不同樣品中各651種蛋白,掃描熒光信號(hào),得到三組結(jié)果。與健康對(duì)照相比,活動(dòng)性結(jié)核病人血漿中53種蛋白表達(dá)量上調(diào)1.9倍以上,其中包括角蛋白,神經(jīng)絲蛋白,與基因修復(fù)相關(guān)蛋白,熱休克蛋白等。116種蛋白表達(dá)量下調(diào)2.0倍以上。在肺癌病人血漿中,上調(diào)1.9倍以上的蛋白有132種,下調(diào)2.0倍以上蛋白有119種。3.timp-1蛋白在鑒別診斷肺結(jié)核的驗(yàn)證
兩種芯片的檢測結(jié)果均表明,timp-1表達(dá)與肺結(jié)核相關(guān)。因此申請(qǐng)人建立了timp-1檢測elisa方法,進(jìn)一步確定其在建立肺結(jié)核血液檢測方法中的應(yīng)用。
(1)timp-1在肺結(jié)核患者血液中的差異表達(dá)驗(yàn)證
新收集125例肺結(jié)核病患者和166例健康對(duì)照者血清。收集標(biāo)準(zhǔn)同前。檢測timp-1的elisa操作步驟如下:
如圖1和圖2所示,本發(fā)明利用商購的timp-1elisa試劑盒(購自raybiotech公司,usa)對(duì)125例肺結(jié)核病患者和90例健康對(duì)照者血清和全血esat6/cfp10刺激后上清驗(yàn)證timp-1蛋白的表達(dá)差異,靈敏度為100.0%(95%ci:97,100),特異性為92%(95%ci:86,96),曲線下面積(auc)是0.782(p<0.0001,95%ci,0.688-0.876)。
(2)timp-1在感染巨噬細(xì)胞中的差異表達(dá)驗(yàn)證
受本實(shí)驗(yàn)室生物安全的限制,本發(fā)明在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病毒分室的實(shí)驗(yàn)室中以牛分枝桿菌(m.bovis)af2122/97(由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所李傳友教授惠贈(zèng))模式菌檢測了timp-1表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌感染的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)所用的人源巨噬細(xì)胞系thp-1細(xì)胞(atcctib-202)(由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所李傳友教授惠贈(zèng))感染牛分枝桿菌和疫苗株牛分枝桿菌bcgtokyostrain(atcc35737)(由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所李傳友教授惠贈(zèng))為模式菌。將thp-1細(xì)胞接種于145mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,加入pma(巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑),終濃度為40ng/ml,混合,放于co2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)12h。去除培養(yǎng)基(含pma),用溫育的培養(yǎng)基洗滌兩遍,備用。細(xì)胞由原來的懸浮狀態(tài)變成貼壁,伸出偽足,開始行使巨噬細(xì)胞的作用。將已經(jīng)分散好的細(xì)菌加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中,感染比為:10:1,互作12小時(shí),將上清(含細(xì)菌)收集作為胞外菌對(duì)照,用新鮮培養(yǎng)基洗滌兩遍,徹底去除未進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)菌,再過12小時(shí),24小時(shí)收集胞內(nèi)菌和細(xì)胞樣本。然后進(jìn)行感染前后巨噬細(xì)胞總rna的提取與質(zhì)量檢測(為常規(guī)方法),利用熒光定量pcr(為常規(guī)方法)檢測timp-1在不同組別中的差異表達(dá)(p<0.05)(參見圖3)。
本發(fā)明獲得timp-1具有潛在標(biāo)識(shí)意義的宿主蛋白,同時(shí)對(duì)timp-1蛋白進(jìn)行了差異分析。結(jié)果顯示timp-1血清蛋白的表達(dá)水平在兩組之間均存在差異。
主要參考文獻(xiàn):
[1]張書環(huán),吳波,顏邦芬,曹莎,陳穎鈺,晁彥杰,凌潔玉,譚亞娣,陳煥春,郭愛珍.牛分枝桿菌抗原mpb70、mpb83、cfp-10和esat-6的融合表達(dá)及相關(guān)特性分析.中國人獸共患病雜志,2007,23(12):38-43.
[2]陳穎鈺.人ifn-γ體外釋放檢測法的建立及其在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[j].生物工程學(xué)報(bào).2008,24(9):1-6。