本發(fā)明涉及原發(fā)性免疫缺陷(pid)領(lǐng)域，更具體地涉及用于診斷淋巴系統(tǒng)的pid的手段和方法。pid是免疫系統(tǒng)的遺傳性疾病。pid患者通常存在復(fù)發(fā)性、嚴重性和有時會威脅生命的感染。迄今為止，已經(jīng)鑒定出可以在pid患者中突變的200多種基因(alherz，frontimmunol2014；5:162)。根據(jù)遺傳缺陷，免疫系統(tǒng)的一部分或一種細胞類型可能不存在或功能失調(diào)。大多數(shù)具有pid的患者具有獲得性免疫系統(tǒng)的缺陷，即涉及b和/或t細胞中的缺陷。流式細胞術(shù)免疫分型在pid患者的逐步診斷過程中起關(guān)鍵作用。正確的診斷是至關(guān)重要的，因為它決定了治療策略，其包括抗生素、免疫球蛋白替代，或在某些情況下，造血干細胞移植或基因治療。

許多診斷和研究中心已經(jīng)開發(fā)了用于診斷和分類pid的多色流式細胞術(shù)方案，但抗體組、樣品處理、儀器設(shè)置和數(shù)據(jù)分析中的差異妨礙了中心之間的數(shù)據(jù)再現(xiàn)性或交換。特別是對于pid，需要在中心之間交換數(shù)據(jù)，這是因為不同pid數(shù)量眾多、pid發(fā)生率低以及pid的臨床和免疫異質(zhì)性。

已經(jīng)提出了幾種單克隆抗體(moab)組用于淋巴系統(tǒng)pid的流式細胞術(shù)分析。這些moab組中的大多數(shù)專門用于鑒定b和t淋巴細胞以及nk細胞中的主要缺陷，和/或用于特定遺傳性疾病的診斷篩查。這種疾病特異性定向流式細胞術(shù)moab組的實例是：基于用cd3、cd19和cd56單獨定量的或與cd16組合的b，t和nk細胞定量的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(scid)的診斷篩選和分類的組；基于循環(huán)性(例如，cd19+)b-淋巴細胞計數(shù)的先天性無丙種球蛋白血癥的診斷篩查；根據(jù)未成熟/過渡、非轉(zhuǎn)換/邊緣區(qū)樣(smigmd⁺)和分類轉(zhuǎn)換(smigmd^-)和cd21dimb淋巴細胞的比例對常見可變免疫缺陷(cvid)的分類；根據(jù)外周血中早期胸腺遷入(rte)cd4+t細胞的相對計數(shù)來診斷篩查digeorge綜合征患者，和；用于篩選自身免疫淋巴增生綜合征(alps)的cd4和cd8雙重陰性tcrαβ⁺t細胞(dnt)的定量(oliveira等，curropinallergyclinimmunol2008；8：499)。這樣的moab組通常僅關(guān)注疾病相關(guān)淋巴細胞亞群的檢測和計數(shù)。因此，這些方法中沒有一個允許對循環(huán)白細胞的不同子集的分布進行完整概述和詳細描述。

同時，已經(jīng)提出了綜合免疫表型組，用于研究多種不同的外周血白細胞亞群，如所謂的euroflow抗體組(參見wo2010/140885a1)、綜合白細胞免疫表型分型組(clip；biancottoetal，jimmunolmeth2011；363：245)、用于協(xié)調(diào)臨床試驗中流式細胞術(shù)的抗體組(maecker等，natimmunol2012；12：191)、one研究moab組(streitz等，transplantres2013；2：17)、和巴斯德免疫表型分析組(duffy等，immunity2014；40：436)。這些已知的組允許鑒定b，t和nk細胞的幾個亞群(例如，原初與記憶、活化的細胞，tcrγδ與tcrαβ)以及單核細胞、樹突狀細胞和粒細胞的鑒定。然而，這些moab組中提出的組合特別側(cè)重于使用多重moab管(tube)來對白血病/淋巴瘤細胞群體進行鑒別和計數(shù)或者監(jiān)測特異性t，b和nk細胞分類，其僅提供與特定條件(例如移植后免疫監(jiān)測)相關(guān)的信息，但不提供其他條件如pid下的信息。

最近，已經(jīng)提出了一種特定的moab組用于分析外周血淋巴細胞亞群，其目的是診斷pid患者。該組要求包含用于鑒定總t、b和nk細胞的“總體淋巴細胞概述”moab組合，以及七種其他moab組合，用于使用標記物對這些細胞進行免疫表型表征，所述標記已被證明與pid患者的診斷和分類在臨床上相關(guān)(bolt等，cytometrybclincytometry2014；86：191；o'gorman等methodsmolbiol2011；699：317)。這些moab組合中的大多數(shù)(七分之六)針對t細胞和nk細胞，允許對這些子集的廣泛描述，包括功能亞組(例如輔助性與細胞毒性)、成熟階段(例如原初、記憶、效應(yīng)子和效應(yīng)子記憶)和其他與疾病相關(guān)的亞群(例如，rte、dnt細胞)的鑒別。相反，僅實現(xiàn)b細胞分類(compartment)的更有限的分類，因為其仍限于對未成熟/過渡、原初、非轉(zhuǎn)換和類轉(zhuǎn)換記憶b細胞和漿母細胞/漿細胞的成熟階段相關(guān)細胞類別的描繪；這些方法不能將這些b細胞亞組進一步分類到其他專門參與pid的類別，如ig同種型亞組。實際上，盡管在大多數(shù)pid患者中強制進行血清免疫球蛋白水平的定量，但所公布的方法都沒有能夠在最多兩個管(tube)中的b-細胞分類中鑒定這些免疫球蛋白(igm，igd，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)的細胞對應(yīng)物。此外，所提議的組不提供關(guān)于循環(huán)白細胞的其他亞類的信息，例如：樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞或嗜酸性粒細胞等細胞。

該方法的另一個限制是，僅提供了來自同一中心的pid患者的應(yīng)用的兩個示例，并且沒有關(guān)于在多中心設(shè)置中pid患者的代表系列中該方法的性能的信息。最后，由于樣品可用性有限，在具有非常低的t細胞計數(shù)的患者(例如經(jīng)常是兒童)中需要染色的相當(dāng)多的管導(dǎo)致需要大樣品體積或隨意決定對特定患者中哪一個亞組染色。

總之，目前用于pid流式細胞術(shù)診斷的moab方案和技術(shù)有幾個主要的局限性。這些方案并未設(shè)計用于逐步篩選和分類pid患者。相反，它們通常集中在一類且相對均一的疾病亞組上，不提供關(guān)于如何將推薦的moab標記物與特定熒光染料組合的信息，僅允許同時評估所有相關(guān)細胞亞組的一部分(而沒有不同免疫細胞分類的完整描述)，且不根據(jù)產(chǎn)生的免疫球蛋白同種型對b細胞進行分類。最后，這些方案僅在非常有限數(shù)量的pid樣本中進行了評估，和/或尚未被證明足夠標準化以在多中心設(shè)置中工作。

因此，本發(fā)明人旨在提供手段和方法，用于對淋巴細胞的成熟和功能性亞組以及顯示不同pid患者的不同變化模式的其他白細胞亞群進行明確識別和完全分類。為此，設(shè)計了多色管中明確定義的抗體的適當(dāng)組合，且在多重多中心測試輪中進行了評估和優(yōu)化。此外，基于對亮度、補償、穩(wěn)定性等的需要，選擇與抗體試劑結(jié)合的熒光染料的特定組合，以開發(fā)可以逐步用于pid診斷和分類的一組抗體試劑(參見圖1所示的逐步診斷算法)。

通過分析健康對照樣本和來自不同診斷組的pid患者樣本，如scid，cvid，digeorge綜合征，alps，wiskottaldrich綜合征，選擇性iga缺陷，btk缺乏癥和cd40l缺乏患者，在多中心研究中對提出的本發(fā)明moab組進行了廣泛評估。多中心評估提供的信息用于重塑組，以實現(xiàn)不同實驗室之間的最佳效率和高再現(xiàn)性。

在一個方面，本發(fā)明提供一種用于流式細胞術(shù)免疫分型白細胞的試劑組合物，其包含針對以下標記物組合之一的熒光染料偶聯(lián)的抗體：

(a)cd27，cd45ra，cd8，igd，cd16，cd56，cd4，igm，cd19，cd3，cd45和tcrαβ或tcrγδ，其中cd8/igd，cd16/cd56，cd4/igm和cd19/tcrαβ或cd19/tcrγδ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的(稱為“pid篩管”)；

(b)cd27，igm，cd38，cd5，igd，cd19，cd21和cd24(稱為“前gcb細胞管”)；

(c)cd27，igm，iga，igg，igd，cd19，cd21，cd38和任選的ige；優(yōu)選cd27，igm，iga，ige，igg，igd，cd19，cd21和cd38，其中所述組合物包含兩個明顯標記的針對iga的抗體，其中ige/iga和igg/iga對中的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的(稱為“后gcb細胞管”)；

(d)cd27，igm，igg3，igg2，igg1，igd，cd19，cd21和cd38；該組合物包含兩種不同標記的針對igg2的抗體，并且其中igg3/igg2和igg1/igg2對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的(稱為“ig-同種型b細胞管-1”)；

(e)cd27，igm，iga2，iga1，igg4，igd，cd19，cd21和cd38；該組合物包含兩種不同標記的針對iga1的抗體，并且其中iga1/igg4和iga1/iga2對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的(稱為“ig-同種型b細胞管-2”)；

(f)cd62l，cd4，cd45ro，cd31，hla-dr，cd3，cd8和tcrαβ或tcrγδ(稱為“scid/rte管”)；

(g)cd27，cd4，cd45ro，ccr7，cd28，cd3，cd8和tcrαβ或tcrγδ(稱為“t細胞亞組管”)；或

(h)cd27，cd45ra，cd45，cd16，cd3，cd8，igd，cd4，igm，cd56，cd19，ccr7，cd38，hla-dr或cd31，以及trcαβ或tcrγδ。其中cd8/igd，cd4/igm和cd19/tcrαβ或cd19/tcrγδ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的(12色pid篩選管)。

因此，本發(fā)明在一個方面提供用于白細胞的流式細胞術(shù)免疫分型的試劑組合物，包含12種不同的熒光染料偶聯(lián)的抗體，其與8種不同熒光染料偶聯(lián)，稱為euroflowpid篩選管。該euroflowpid篩選管包括本文提供的試劑組合物，其包含針對以下標記物組合的抗體組：cd27，cd45ra，cd8，igd，cd16，cd56，cd4，igm，cd19，cd3，cd45和tcrαβ或tcrγδ，其中cd8/igd，cd16/cd56，cd4/igm和cd19/tcrαβ或cd19/tcrγδ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的(稱為“pid篩管”)。在一個實施方式中，試劑組合物包含針對以下標記物組合之一的抗體組：cd27，cd45ra，cd8，igd，cd16，cd56，cd4，igm，cd19，cd3，cd45和trcαβ，其中cd8/igd，cd16/cd56，cd4/igm和cd19/tcrαβ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)。在另一個實施方式中，其包含針對以下標志物組合的抗體組：cd27，cd45ra，cd8，igd，cd16，cd56，cd4，igm，cd19，cd3，cd45和trcγδ，其中cd8/igd，cd16/cd56，cd4/igm和cd19/tcrγδ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)。因此，euroflowpid篩管可以由8色14參數(shù)篩選管(包括散射)組成，其允許檢測主要的淋巴細胞亞組，其提供足夠的信息用于指導(dǎo)進一步的遺傳測試或保證進一步分析b和/或t細胞亞組。發(fā)明人還設(shè)計了包括10或12種不同的熒光染料偶聯(lián)的抗體的替代實施方式，包括針對上述所有標記物的抗體。例如，還提供如上所述的試劑組合物，其還包含針對標記物ccr7和/或cd38的熒光染料偶聯(lián)的抗體。優(yōu)選地，其包含針對標記物ccr7和cd38的抗體(稱為“10色pid篩選管”)。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物，其包含針對以下標記物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，igm，cd38，cd5，igd，cd19，cd21和cd24(前gcb-細胞管)。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物(后gcb-細胞管)，其包含針對以下標記物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，igm，iga，igg，igd，cd19，cd21，cd38和任選的ige。優(yōu)選地，其包含針對cd27，igm，iga，ige，igg，igd，cd19，cd21和cd38的抗體，其中所述組合物包含兩種不同標記的針對iga的抗體，并且其中ige/iga和igg/iga對內(nèi)的抗體偶聯(lián)至相同的熒光染料，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的。可以添加抗其他標記物的抗體。優(yōu)選地，試劑組合物還包含針對標記物cd24和cd5的熒光染料偶聯(lián)的抗體(稱為“10-色前+后-gc管”)。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物(ig-同種型b-細胞管-1)，其包含針對以下標志物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，igm，igg3，igg2，igg1，igd，cd19，cd21和cd38；并且其中所述組合物包含針對igg2的兩種不同標記的抗體，并且其中igg3/igg2和igg1/igg2對中的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，所述熒光染料是可區(qū)分的。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物(ig-同種型b-細胞管-2)，其包含針對以下標志物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，igm，iga2,iga1,igg4，igd，cd19，cd21和cd38；并且其中所述組合物包含針對iga1的兩種不同標記的抗體，并且其中iga1/igg4和iga1/iga2對中的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中在不同對之間，所述熒光染料是可區(qū)分的。

還提供用于檢測所有ig-同種型的單管試劑組合物。該試劑組合物包含針對以下標記物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，igm，igg3，igg2，igg1，igd，cd19，cd21，cd38，iga1，iga2和igg4；其中所述組合物包含針對igg2的兩種不同標記的抗體和針對iga1的兩種不同標記的抗體，并且其中所述igg3/igg2，igg1/igg2，iga1/igg4和iga1/iga2對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)，并且其中不同對之間的熒光染料是可區(qū)分的(稱為“10色ig同種型管”)。通過進一步添加針對標記物cd5和cd21(稱為“12色b-細胞管”)的熒光染料偶聯(lián)的抗體，該試劑組合物可適用于12色試劑組合物。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物(scid/rte管)，其包含針對以下標志物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd62l，cd4，gd45ro，cd31，hla-dr，tcrγδ或tcrαβ，cds和cd8。該試管具有分析從scid篩選試驗中陽性檢測的受試者獲得的樣品等用途。例如，對(s)cid的懷疑可以基于使用所謂的t細胞受體刪除環(huán)(trec)的常規(guī)新生兒篩選，所述t細胞受體刪除環(huán)是在t細胞受體重排期間產(chǎn)生的環(huán)狀dna片段。在健康的新生兒中大量產(chǎn)生trec，而在scid的嬰兒中幾乎無法檢測到。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物(t細胞亞組管)，其包含針對以下標記物組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，cd4，cd45ro，ccr7，cd28，tcrγδ或tcrαβ，cd3和cd8，或標志物cd27，cd4，cd45ro，ccr7，hla-dr，tcrγδ或tcrαβ，cd3和cd8。

在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑組合物(12色pid篩選管)，其包含針對以下標記組合的熒光染料偶聯(lián)的抗體組：cd27，cd45ra，cd45，cd16，cd3，cd8，igd，cd4，igm，cd56，cd19，ccr7，cd38，hla-dr或cd31，以及tcrαβ或tcrγδ，其中cd8/igd，cd4/igm和cd19/tcrαβ或cd19/tcrγδ對內(nèi)的抗體偶聯(lián)至相同的熒光染料，并且其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的。在一個實施方式中，試劑組合物包含針對cd27，cd45ra，cd45，cd16，cd3，cd8，igd，cd4，igm，cd56，hla-dr，cd19，ccr7，cd38和tcrαβ的抗體，其中cd8/igd，cd4/igm和cd19/tcrαβ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)。在另一實施方式中，試劑組合物包含針對cd27，cd45ra，cd45，cd16，cd3，cd8，igd，cd4，igm，cd56，hla-dr，cd19，ccr7，cd38和tcrγδ的抗體，其中cd8/igd，cd4/igm和cd19/tcrγδ對內(nèi)的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的試劑組合物包含單克隆抗體。cd代表簇命名，是用于鑒定由單克隆抗體定義的特異細胞表面抗原的命名。針對所示標記物的(單克隆)抗體可以從各種公司商購獲得，包括bectondickinson(bd)生物科技公司、大科(dako)公司、貝克曼庫爾特(beckmancoulter)公司、cytognos公司、卡爾塔(caltag)公司、法敏進(pharmingen)公司、exbio公司、傘奎(sanquin)公司、英杰(invitrogen)公司等。

表述“其中在不同對之間，熒光染料是可區(qū)分的，其中任一對中的抗體與相同的熒光染料偶聯(lián)”意味著第一對的兩個抗體與熒光染料a偶聯(lián)，并且第二個的兩個抗體對與熒光染料b偶聯(lián)。因此，在每對中熒光染料是相同的，但在不同的對之間熒光染料是可區(qū)分的。每種試劑組合物可以如此使用，例如用于篩選免疫缺陷病。

因此，本發(fā)明還涉及包含一種或多種試劑組合物的診斷試劑盒。然而，組合物還有利地與一種或多種其它試劑組合物組合使用，特別是用于進一步篩選和分類疾病而設(shè)計的試劑組合物。術(shù)語“與……組合”不是指試劑組合物的物理組合或混合，而是指在分離(連續(xù)或平行)分析步驟中的應(yīng)用和由此獲得的數(shù)據(jù)的組合。

因此，本發(fā)明還涉及至少兩種試劑組合物的組，其包含不同的熒光染料偶聯(lián)的抗體，所述組包含如上所述的第一試劑組合物和如上所述的至少一種其它試劑組合物。因此，兩種試劑組合物都包含不同的抗體組，盡管一些抗體可能在兩種組合物中都存在。

例如，euroflowpid篩管與表征管組合使用可以涉及相同生物樣品的分離等分試樣的兩個單獨分析步驟，每個使用一種試劑組合物，隨后進行數(shù)據(jù)記錄和評估(參見圖1)。在一個實施方式中，pid診斷算法包括篩選管和分類管的后續(xù)組(圖1)。pid篩選管旨在識別、表征和計數(shù)初級和次級淋巴和造血組織中的淋巴細胞和其他白細胞，如b，t和nk細胞，抗原呈遞細胞，吞噬細胞和漿細胞；這包括前和后生發(fā)中心(gc)b細胞。根據(jù)pid篩選管的結(jié)果，為b細胞和t細胞亞組的更詳細分析而設(shè)計的附加管可用于進一步pid分類前gc、后gc和ig同種型b細胞管旨在鑒定、表征和計數(shù)b細胞亞組，用于評估與一個或幾個免疫球蛋白亞類(例如，cvid)的生產(chǎn)中的特定缺陷和成熟區(qū)相關(guān)的b細胞分化缺陷。最后，t細胞記憶/效應(yīng)亞組管和scid/rte抗體管旨在鑒定、表征和計數(shù)t細胞亞組，用于評估t細胞產(chǎn)生、分化和/或激活(例如，scid)。

如果不同熒光染料的組對于每種試劑組合物基本相同，從而總共使用多達8個、10種或12種不同的熒光染料，則非常方便。

在一個實施方式中，每種試劑組合物包含與下述偶聯(lián)的抗體：(1)太平洋藍(pacb)，亮紫421(bv421)或horizonv450；(2)太平洋橙(paco)，horizonv500(hv500)，bv510，khrome橙(ko)或oc515，(3)horizonbb515，異硫氰酸熒光素(fitc)或alexa488，(4)藻紅蛋白(pe)(5)多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(percp-cy5.5)，percp或pe-texasred，(6)藻紅蛋白/花青7(pe-cy7)，(7)別藻藍素(apc)或alexa647和(8)別藻藍素/海力達7(apc-h7)，apc-cy7，alexa680，apc-a750，apc-c750或alexa700。

在另一個實施方式中，每種試劑組合物包含與下述偶聯(lián)的抗體：(1)亮紫421，(2)亮紫510(bv510)，(3)亮紫650(bv650)，(4)亮紫786(bv786)，(5)異硫氰酸熒光素(fitc)，(6)多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(percp-cy5.5)，(7)藻紅蛋白(pe)，(8)藻紅蛋白/花青7(pe-cy7)，(9)別藻藍素(apc)和(10)別藻藍素/h7(apc-h7)、apc-c750或apc-alexa750。

本發(fā)明的另一方面涉及用于白細胞的流式細胞術(shù)免疫分型的診斷試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的試劑組合物或至少一組試劑組合物，任選地和使用說明書、緩沖液和/或?qū)φ諛悠?。例如，提供用于診斷原發(fā)性免疫缺陷(pid)的診斷試劑盒，優(yōu)選為淋巴系統(tǒng)的pid。在另一個實施方式中，試劑盒用于鑒定免疫疾病中白細胞亞組的改變，優(yōu)選用于免疫監(jiān)測具有下述的患者：感染、自身免疫性疾病、過敏、移植后、疫苗接種或其他類型的免疫治療，包括抗體治療。

用于本發(fā)明試劑盒的試劑的優(yōu)選組合包括以下(參見表1,2和3中每種試管中抗體的組合)：

·管#2和#3

·管#4和#5

·管#2,#3,#4和#5

·管#1,#2和#3

·管#1,#4和#5

·管#1,#2,#3,#4和#5

·管#6和#7

·管#1和#7

·管#1,#6和#7

·管#9和#10

·管#8,#9和#10

·管#8和#11

·管#12和#13

·管#1,#2,#3,#4,#5,#6,#7

·其任何組合

還提供一種用于白細胞免疫分型的多色流式細胞術(shù)方法，包括以下步驟：

(a)提供包含白細胞的生物樣品；

(b)使所述樣品的第一等分試樣與根據(jù)本發(fā)明的組的第一試劑組合物接觸，并使所述樣品的至少第二等分試樣與所述組的其他試劑組合物接觸；

(c)在流式細胞儀中分析所述等分試樣中的白細胞；和

(d)存儲和評估所獲得的數(shù)據(jù)。

樣品可以是任何懷疑含有白細胞的樣品。示例性生物樣品包括外周血，骨髓，組織樣品如淋巴結(jié)，腺樣體，脾臟或肝臟，或其它類型的體液，例如腦脊液，玻璃體液，滑液，細針抽吸物，胸腔積液和腹水。在優(yōu)選的實施方式中，樣品是外周血樣品。在具體方面，生物樣品從具有scid的個體獲得，優(yōu)選來自使用所謂的trec試驗在常規(guī)新生兒篩選中檢測陽性的個體，所述trec試驗基于檢測t細胞受體重排期間產(chǎn)生的環(huán)狀dna片段。因此，還提供一種用于白細胞免疫分型的多色流式細胞術(shù)方法，包括以下步驟：

(a)使用trec試驗鑒定scid檢測陽性的個體；

(b)從所述scid陽性個體獲得包含白細胞的生物樣品；

(c)將所述樣品的等分試樣與本發(fā)明的試劑組合物，特別是scid/rte管和/或篩管接觸，并使所述樣品的至少第二等分試樣與所述組的其他試劑組合物接觸；

(d)在流式細胞儀中分析所述等分試樣中的白細胞；和

(e)存儲和評估所獲得的數(shù)據(jù)。

該方法有利地包括將根據(jù)所謂的最近鄰計算的來自多個管的所選細胞群的免疫表型信息組合，其中來自樣品的一個等分試樣的個體細胞與來自相同樣品的另一等分試樣的相應(yīng)個體細胞相匹配，根據(jù)到他們的標記物和分散概況。

優(yōu)選地，該方法包括使用用于流式細胞術(shù)文件的數(shù)據(jù)整合和多維分析的軟件。例如，根據(jù)本發(fā)明的抗體組可以與可商購的infinicyt軟件工具或任何其它軟件程序組合使用。infinicyt軟件基于最近描述的程序，其用于通過合并數(shù)據(jù)文件生成具有無限數(shù)量參數(shù)的文件，并且計算從一個樣品等分試樣中的測量向在相同樣品的其他等分試樣中測量的各個細胞衍生的信息，使用只有部分重疊的抗體試劑的不同的組合(orfao等，美國專利7,321,843)以及用于不同樣品或不同樣品組之間的比較(orfao等，美國專利7,507,548)。

這些多色免疫染色可以根據(jù)vandongen等(leukemia2012；26:1908)和kalina等(leukemia2012；26:1986)描述的或euroflow網(wǎng)頁(www.euroflow.org)可得的所謂euroflow方案進行。

發(fā)明詳述

1.8種，10種或12種不同熒光染料中抗體組的流式細胞儀分析和示例組合

本文提出的包含8種不同的熒光染料偶聯(lián)的抗體的組可以被減少到較少數(shù)量的管，其提供與10種或12種不同的熒光染料偶聯(lián)的抗體的組合相當(dāng)?shù)男畔?，如下所述?/p>

1.1.包含與8種不同熒光染料偶聯(lián)的抗體的組的流式細胞儀分析和示例組合

euroflowpid篩選試劑組合物被設(shè)計和批準用于評估幾種疑似臨床病癥，例如復(fù)發(fā)或持續(xù)感染，發(fā)育遲緩，低血清免疫球蛋白水平，以及暴露于抗原后的抗體發(fā)生失敗。這些試劑旨在詳細分析循環(huán)白細胞亞組，包括b細胞，t細胞，nk細胞，單核細胞，樹突細胞，嗜堿性粒細胞，嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。另外b細胞和t細胞可分為不同的功能/成熟亞組。因此，將b細胞分為前gcb細胞(包括未成熟/過渡和原初b細胞)、未轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)換的記憶b細胞和漿母細胞/漿細胞。t細胞分類可以根據(jù)tcrγδ或tcrαβ、cd4和cd8的表達而分為不同的功能亞組。這些t細胞亞組可以根據(jù)其在原初、記憶、效應(yīng)子和效應(yīng)子ra⁺細胞中的成熟期而進一步細分。

示例性pid篩管的組成如表1所示。該試劑組合物檢測b細胞，t細胞和nk細胞生產(chǎn)中的缺陷，以及單核細胞，樹突狀細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞生產(chǎn)中的變化(有缺陷但生產(chǎn)增加)。然而，在大多數(shù)情況下，該管不能進行t細胞和b細胞檢測的缺陷的精確分類。這通常需要用額外的管進一步表征(圖1)。

前gc、后gc和ig-同種型b細胞抗體組由專門用于對與血清和/或其他組織(例如粘膜)中免疫球蛋白水平降低或缺失的相關(guān)的缺陷進行深度表征的組合組成。對于某些pid，特別是具有b細胞系統(tǒng)中缺陷的抗體缺失，需要更詳細的分析來詳細研究b細胞亞群。b細胞起源于骨髓干細胞，并通過多個分化階段分化為離開骨髓并進入外周的未成熟b細胞，外周包括用流式細胞分析法在pid診斷中分析的血液。在外周，b細胞遇到抗原，然后可以進行生發(fā)中心(gc)反應(yīng)。因此，在血液中存在尚未經(jīng)歷生發(fā)中心反應(yīng)的b細胞(前gcb細胞)或已經(jīng)進行生發(fā)中心反應(yīng)的b細胞(后gc-b細胞)。

這些后gc亞組可以根據(jù)其ig同種型進一步細分：igm，igd，ige，igg(包括igg1，igg2，igg3，igg4)和iga(包括iga1，iga2)或igm，igd，igg(包括igg1，igg2，igg3，igg4)和iga(包括iga1，iga2)。這些組包括下述標記物：用于鑒定與不同的前gcb細胞亞組(包括未成熟/過渡、原初cd5+和原初cd5-b細胞)的生產(chǎn)相關(guān)的、與后gc亞組(包括記憶b細胞和漿母細胞/漿細胞)的生產(chǎn)相關(guān)的缺陷的標記物，和根據(jù)單管中的總同種型(igm，igd，igg，iga，ige，或在另一個實施方式中，igm，igd，igg和iga)分類記憶b細胞和漿母細胞/漿細胞的標記物，和/或與兩管(igm，igd，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)的組合表達的特異性免疫球蛋白亞類。

對于淋巴系統(tǒng)的pid，t細胞亞組的詳細分析也是進行正確診斷的優(yōu)選。對于嚴重的聯(lián)合免疫缺陷(scid)，存在于外周血中的t細胞可能不是自體的，但可能是來自胎盤的衍生的母體t細胞。重要的是區(qū)分母親t細胞和最近從胸腺遷入的自體t細胞，稱為最近的胸腺遷入物(rte)。這需要額外的流式細胞術(shù)分析，這只有在懷疑scid時才是必需的，例如根據(jù)基于所謂t細胞受體刪除環(huán)(trec)檢測的常規(guī)(新生兒)篩查。因此，本發(fā)明涉及用于鑒定這些和其它t細胞亞組的兩種管：一個用于分析t細胞亞組和一個特異scid/rte管。

本發(fā)明中用于針對所述標記物偶聯(lián)抗體的合適熒光染料是本領(lǐng)域已知的。應(yīng)當(dāng)理解，試劑組合物中使用的熒光染料應(yīng)通過流式細胞術(shù)彼此區(qū)分。優(yōu)選就亮度、有限的光譜重疊和有限的補償需求、穩(wěn)定性等選擇熒光染料(參見：kalina等，leukemia2012；26：1986)。

在本申請的表1中，下列熒光染料組是特別有用的：(1)太平洋藍(pacb)，亮紫421(bv421)或horizonv450；(2)太平洋橙(paco)，horizonv500(hv500)，bv510，khrome橙(ko)或oc515，(3)horizonbb515，異硫氰酸熒光素(fitc)或alexa488，(4)藻紅蛋白(pe)(5)多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(percp-cy5.5)，percp或pe-texasred，(6)藻紅蛋白/花青7(pe-cy7)，(7)別藻藍素(apc)或alexa647和(8)別藻藍素/海力達7(apc-h7)、apc-cy7、alexa680、apc-a750、apc-c750或alexa700。

表1.8色試劑組合物示例

星號*表示該組合物可含有針對ige的抗體和針對iga的第二抗體。

本發(fā)明還涉及一種用于pid流式細胞術(shù)診斷的方法，包括以下步驟：從人對象提供生物樣品，并使樣品的至少一部分(等分試樣)與本文提供的試劑組合物接觸。已知或懷疑含有白細胞的任何類型的樣品可以直接使用，或在裂解非成核紅細胞后、或密度離心后、或細胞分選程序后使用。

1.2.包含與10種不同熒光染料偶聯(lián)的抗體的組的流式細胞儀分析和組合

已經(jīng)設(shè)計了包含與十個不同熒光染料偶聯(lián)的抗體的替代組，其提供與來自第1.1節(jié)的管相當(dāng)?shù)男畔?。包含在?.1節(jié)的前gc和后gcb細胞管中的所有信息此處都包含在單管(前gc+后gc-b-細胞管)中。此外，根據(jù)表達的免疫球蛋白亞類(來自1.1組的兩個ig同種型b細胞管中的igm，igd，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)的記憶b細胞和漿母細胞/漿細胞的分類可以在單管(ig-同種型b細胞管)中進行。此外，scid/rte管和t細胞亞組管現(xiàn)在組合成一個t細胞亞組管，其包含cd31和cd61l標記物。最后，euroflow篩選管提供基于ccr7表達對t細胞成熟亞組的更好區(qū)分(例如中樞與外周記憶)，同時cd38的納入允許鑒別未成熟/過渡與原初b細胞，有助于實現(xiàn)更準確的漿母細胞/漿細胞的鑒定。

在本申請的表2中，熒光染料1號對應(yīng)于亮紫421(bv421)，2號對應(yīng)于亮紫510(bv510)，3號對應(yīng)于亮紫650(bv650)，4號對應(yīng)于亮紫786(bv786)，5號對應(yīng)于熒光素異硫氰酸熒光素(fitc)，6號對應(yīng)于多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(percp-cy5.5)，7號對應(yīng)于藻紅蛋白(pe)，8號對應(yīng)于藻紅蛋白/花青7(pe-cyt)，9號對應(yīng)于別藻藍素(apc)，和10號對應(yīng)于別藻藍蛋白/h7(apc-h7)，apc-c750或apc-alexa750。這種熒光染料組合僅作為示例使用，并且不應(yīng)限制本發(fā)明中也包含的相容熒光染料的其它組合的使用。

表2.10色試劑組合物示例

1.3.包含與12種不同熒光染料偶聯(lián)的抗體的組的流式細胞儀分析和組合

已經(jīng)設(shè)計了包含與12種不同熒光染料偶聯(lián)的抗體的替代試劑組合物，提供與上述1.1組管相當(dāng)?shù)男畔ⅰ碜?.1和1.2組的前gc、后gc和ig同種型管中包含的所有信息都包含在單管(b-細胞管)。此外，連同來自1.3組的euroflowpid篩選管提供的額外信息，12色euroflowpid管可用于鑒定rtet細胞，改善scid患者的分析，以及允許基于cd16對cd56表達鑒別nk細胞亞組。

在本申請的表3中，熒光染料1號對應(yīng)于亮紫421(bv421)，2號對應(yīng)于亮紫510(bv510)，3號對應(yīng)于亮紫650(bv650)，4號對應(yīng)于亮紫711(bv711)，5號對應(yīng)于亮紫786(bv786)，6號對應(yīng)于熒光素異硫氰酸熒光素(fitc)，7號對應(yīng)于多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(percp-cy5.5)，8號對應(yīng)于藻紅蛋白(pe)，9號對應(yīng)于pe-cf594，10號對應(yīng)于藻紅蛋白/花青7(pe-cyt)，11號對應(yīng)于別藻藍素(apc)，和12號對應(yīng)于別藻藍蛋白/h7(apc-h7)，apc-c750或apc-alexa750。這種熒光染料組合僅作為示例使用，并且不應(yīng)限制本發(fā)明中也包含的相容熒光染料的其它組合的使用。

表3.12色試劑組合物示例

附圖說明

圖1：流式細胞術(shù)免疫分型策略篩選和分類原發(fā)性免疫缺陷(pid)的算法。a.根據(jù)數(shù)條臨床和實驗室參數(shù)輸入，將懷疑患有pid的患者的血樣用8或10色pid篩選管進行篩選?；讷@得的結(jié)果，以逐步的方式應(yīng)用額外的8色或10色t和/或b細胞分級管。在懷疑(s)cid的情況下，pid篩管和兩個t細胞管(scid/rte和t細胞亞組管)都可以一起應(yīng)用(左側(cè)的“t細胞分支”)。在懷疑pad的情況下，pid篩管和前gc+后gc管可以一起應(yīng)用，然后任選使用ig-同種型管(右側(cè)的“b細胞分支”)。如果臨床癥狀足夠清楚，可以省略pid篩管。b.euroflow診斷算法的12色變體，由兩種12色管組成：pid篩選管，其還包括t細胞亞組分析，和b細胞分級管，其結(jié)合了前gc、后gc和ig同種型分析。應(yīng)注意，本專利申請中不包含前體b細胞管，因為已經(jīng)提出了幾種信息≥8色的管(vandongen等，leukemia2012；26：1986)?？s寫：gc，生發(fā)中心；pad，一抗缺陷；rte，近期胸腺遷入；scid，嚴重聯(lián)合免疫缺陷。

圖2：參考主成分分析1(pci)的生成相對n維空間中的pca2表現(xiàn)，用于鑒別用pid篩選標記物組合識別的淋巴細胞亞組。

將來自5個健康供體的數(shù)據(jù)文件合并，并使用雙變量圖識別感興趣的淋巴細胞亞組。該分析用于在n維空間中定義最佳主成分分析1(pcl)相對pca2表現(xiàn)來區(qū)分這些亞組。在2x標準偏差(sd)曲線中重現(xiàn)數(shù)據(jù)的pca表現(xiàn)，用作樣本的監(jiān)督自動分析的參考。

圖3：來自參考數(shù)據(jù)文件(上圖)的外周血(pb)中存在的不同白細胞亞組的主成分分析(pca)表現(xiàn)用于通過pid篩選標記物組合分析的來自健康供體和原發(fā)性免疫缺陷病人的pb樣品的監(jiān)督分析。

參考主成分分析1(pcl)與pca2表現(xiàn)由euroflowpid篩選標記物組合分析得到的5個健康供體數(shù)據(jù)文件(上圖)生成用。基于五個健康供體染色的外周血液亞組的分布，分析不同樣品的參考pc1與pc2原型表現(xiàn)，所述供體包括：一個健康供體，一個具有突變stat3的患者和兩個具有不同遺傳缺陷的scid患者：il2受體γ鏈(il2rg)和重組激活基因2(rag2)，所有樣品經(jīng)染色并在相同/相較的條件下獲得。

圖4：使用2-維圖對n維主成分分析(pca)，通過前gc管的標記物組合鑒定循環(huán)外周血(pb)b細胞的主要亞組。

分析在2×10⁶pb細胞內(nèi)鑒定的循環(huán)b細胞(fs/ss^locd19⁺)成熟亞組，使用來自pre-gc管的標記物：未成熟(cd5⁺cd27^-cd38⁺⁺smigm⁺⁺smigd⁺)、cd5⁺和cd5^-原初b細胞(cd27^-cd38^+dsmigm⁺smigd⁺⁺)、ig非轉(zhuǎn)換的和ig轉(zhuǎn)換的記憶b細胞(分別為cd5^-cd27⁺cd38^-smigm⁺smigd⁺⁺和cd5^-cd27^+/-cd38^-smigm^-smigd^-)和漿細胞(cd5^-cd27⁺⁺cd38⁺⁺⁺)。圖a顯示使用5個標記物組合所需的最小數(shù)量的雙變量圖(三個雙變量圖/細胞群)鑒定的b細胞生物相關(guān)亞組，與b)5維空間的主成分1(pcl)對pc2表現(xiàn)。

圖5：來自正常/參考樣品的外周血(pb)中存在的b細胞的不同亞組的主成分分析(pca)表現(xiàn)(圖a)和用前gc管分析的具有改變的分布的來自原發(fā)性免疫缺陷患者的pb樣品。

針對基于來自六個健康供體的pbb細胞亞組(用前gc管染色并在相同/相較條件下獲得)的分布定義的參照pc1對pc2原型表現(xiàn)，顯示診斷為普通變應(yīng)性免疫缺陷(cvid)和無丙種球蛋白血癥的患者中外周血b細胞分布的分析。

圖6：同種型管用于分類來自健康供體和原發(fā)性免疫缺陷患者的外周血中的轉(zhuǎn)換記憶b細胞和漿母細胞/漿細胞的應(yīng)用。

用來自健康成年人(上圖)，來自選擇性iga缺陷個體(中圖)和cvid患者(下圖)的樣品中的經(jīng)同種型管分析的5×10⁶外周血白細胞中，根據(jù)免疫球蛋白重鏈的不同亞類(igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)的表面膜(sm)表達，轉(zhuǎn)換的記憶b細胞(smigmd^-cd19⁺cd38^-)和漿母細胞/漿細胞(cd19+cd27+cd38++)iga2)的分布。在來自cvid患者的外周血中，無法檢測到高于0.001細胞/μl的頻率的漿母細胞/漿細胞。

圖7：用12色b細胞類型(包括igh同種型檢測)分類血液b細胞分類，得到約25種不同b細胞亞組(原初b細胞亞組、記憶b細胞亞組和漿細胞亞組)的檢測和定量。

實驗部分

本文公開的多色流式細胞術(shù)方法的功能基于標記物組的組合和使用多變量分析來鑒定正常細胞(例如正常前體b細胞，正常b淋巴細胞和正常漿細胞)，以及懷疑患有pid的患者樣品中的細胞群體與來自健康對照樣品的細胞群體的比較。為此目的，使用強大的多變量分析來評估組中每個單獨標記對組合中所有其他標記物分離白細胞群體的貢獻。該策略用于在多次連續(xù)的實驗測試中選擇最具辨別性的標記物的組合。由于在健康對照樣品和定義明確的pid患者樣品上進行了多輪測試，因此當(dāng)與主成分分析或規(guī)范分析結(jié)合使用時，最終提出的抗體組合變得非常強，特別是與infinicyt軟件的自動化群體分離(aps)工具一起使用時，使得每個標記物的添加(獨立)值用于單步分析。

下面的實驗部分提供euroflowpid篩選管(實施例1)、euroflowpid前gcb細胞管(實施例2)、euroflowpidig-同種型b-細胞管(實施例3)和euroflowt細胞亞組管(實施例4)的應(yīng)用的廣泛實驗研究結(jié)果的代表性實例。

以下實施例證明了根據(jù)本發(fā)明的euroflow管(例如與主要成分分析，特別是與aps工具一起)分析時的功能?；诙噍啘y試，最終抗體組合看來能夠分離不同的白細胞，淋巴細胞，b細胞亞組和t細胞亞組(圖3，圖4和圖6)?；谕耆珮藴驶姆椒?，不同健康對照的白細胞和淋巴細胞亞組的模式在不同的中心之間是完全可比的(圖2，圖4和圖6)。通過針對從健康對照獲得的模板繪制pid患者的結(jié)果，健康對照的結(jié)果為pid患者的篩查和分類提供獨特的模板(見圖3，圖5和圖6)。

重要的是，用aps軟件工具分析的pid管被設(shè)計為提供相關(guān)白細胞群體的模板。這對于各種b細胞和t細胞亞組特別明顯，其在成熟途徑中顯示出密切的關(guān)系(圖2和圖3)。針對健康對照的aps模板進行繪制的患者樣本的結(jié)果容易顯示pid患者中白細胞和淋巴細胞亞組的變化的分布。事實上，圖3，圖5和圖6清楚地根據(jù)缺陷的類型顯示了pid患者中哪些亞組不存在或(顯著)減少和特定患者存在什么成熟障礙。

本文提供的8色，10色和12色管(表1，表2和表3)不僅適用于pid患者的診斷和分類。它們也優(yōu)選適用于感染、自身免疫性疾病、過敏、移植后、接種疫苗或其他類型的免疫治療(包括抗體治療)的患者的免疫監(jiān)測。與其他免疫分型方法相反，本發(fā)明提供的試劑和方法是更深入和更綜合的方法，能實現(xiàn)在病情和恢復(fù)過程的監(jiān)測期間，患者和對照之間以及患者之間隨時間變化的分布的有力可視化。

實施例

實施例1.euroflowpip篩選抗體組

篩選管可用于檢測與原發(fā)性淋巴組織缺陷(bm和thymus)(如stats，il2rg和rag2缺陷)相關(guān)的白細胞亞組的變化(圖3)，盡管與次級淋巴組織中的反應(yīng)相關(guān)的其他缺陷也可檢測到(如cd40l缺陷)。另一個應(yīng)用示例可為造血干細胞移植后的結(jié)果監(jiān)測。這些管可以單獨使用或與b-eell管和/或t細胞管組合使用，用于每當(dāng)需要時更詳細地描述這些亞組，例如用于免疫監(jiān)測。

在來自15名健康兒童和5名復(fù)發(fā)性感染兒童的20份血樣上測試euroflowpid篩選管。根據(jù)為15名健康兒童建立的初步參考值，5名患者的血液中淋巴細胞數(shù)量發(fā)生改變，具有不同的概況：1)在具有增加的血清ige的一位患者中發(fā)現(xiàn)原初/記憶b細胞和t細胞的改變的分布，該患者后來被證實有stat3缺陷；2)在兩個確認有il2rg基因突變的患者中發(fā)現(xiàn)t和nk細胞數(shù)減少，b淋巴細胞計數(shù)正常；和3)其余2例血液中b和t淋巴細胞數(shù)量顯著減少，其進一步證明與rag2基因缺陷相關(guān)。這些患者的例子如圖3所示。

實施例2.euroflowb細胞管

在其它應(yīng)用中，這些管可用于檢測骨髓中的成熟阻斷(例如無丙種球蛋白血癥；圖5)，淋巴結(jié)和/或其他淋巴組織中b細胞應(yīng)答的缺陷(例如，cvid；圖5)和同種型特異性缺陷(例如選擇性iga缺陷；圖6)。這些管也可用于監(jiān)測誘導(dǎo)的次級免疫缺陷，例如被血液腫瘤中的抗體治療所誘導(dǎo)。

用euroflowb-細胞管染色10個骨髓樣品(來自5個不同健康供體的5個正常骨髓樣品和來自5個不同感染患者的5個骨髓樣品，其在用euroflow篩選管染色血液樣品后顯示出顯著降低的b細胞數(shù))。為此目的，使用裂解-染色-然后裂解/固定樣品制備技術(shù)，其由下述步驟組成：順序應(yīng)用euroflow體裂解方法，然后在室溫下抗體染色30分鐘，最后用在室溫下用蒸餾水稀釋1/10(體積/體積)的10mlfacslyse溶液(bectondickinson生物科技公司，美國加利福尼亞州圣何塞)裂解/固定10分鐘。在3例中發(fā)現(xiàn)了成熟早期階段的完全b細胞成熟阻斷，其中2例與btk基因缺陷的惡性非球蛋白血癥患者相對應(yīng)，而第3例在用利妥昔單抗抗cd20單克隆抗體治療)。在另外兩名患者中，b細胞的骨髓生產(chǎn)正常而不存在漿細胞，并且轉(zhuǎn)換的iga+和lgg+記憶b細胞數(shù)量明顯減少，兩名患者最終被診斷為cvid。

實施例3.用于分析健康供體和cvid患者的ig-同種型b細胞管。

已經(jīng)對來自10名健康成年人，5名選擇性iga缺陷個體和5名cvid患者的血液樣品商測試了euroflowig同種型管(圖6)。已經(jīng)就igm⁺d^-/+,igg1⁺,igg2⁺,igg3⁺,igg4⁺,iga1⁺,iga2⁺,igm^-d⁺記憶b細胞(8-55,21-33,4-20,3-10,<0.01-2,8-25,2-11,和<0.01-2細胞/μl)和漿母細胞/漿細胞(0.5-4.6,0.3-1.0,0.2-1.2,<0.01-0.2,<0.01-0.3,0.4-3.8,0.4-0.9,和<0.01-0.1細胞/μl)計算了初步參考值。對cvid患者中相同抗體組合的評估顯示，盡管缺乏循環(huán)漿母細胞/漿細胞(<0.01)似乎是所有研究的患者的共同特征，但記憶b細胞分類中的ig-同種型表達的b細胞亞組在不同的患者中受到不同的影響，表明記憶b細胞分類的狀態(tài)可能與這些患者中不同抗原的免疫能力水平直接相關(guān)。已經(jīng)觀察到具有選擇性iga缺陷的個體的相當(dāng)?shù)母淖儯抻谟洃沚細胞和漿母細胞/漿細胞的iga1和iga2分類。

實施例4.t細胞抗體組

t細胞抗體組由抗體組組成，其目的在于更詳細地描述t細胞亞組，包括鑒定中樞與效應(yīng)記憶b細胞、鑒定終末分化的t細胞和近期胸腺遷入(rte)cd4⁺t細胞的定量。這些組特別推薦用于scid患者的診斷分類，但它們也有興趣用于鑒定與t細胞生產(chǎn)相關(guān)的其他變化(例如，迪喬治綜合征)。

通過使用利用truecount管的常規(guī)多色直接免疫熒光方法的euroflowt細胞抗體組，研究了總共5份血液樣品，所述樣品來自呈現(xiàn)面部改變、心臟病和低鈣血癥的新生兒；染色后，立即在facscantoii流式細胞儀(becton/dickinson生物科技公司，美國加利福尼亞州圣何塞)中測量染色的血液樣品。檢測到兩例顯示正常的t細胞計數(shù)，以及不同t細胞亞組的正常分布，而在其他三例中t細胞計數(shù)減少，特別是cd4⁺t細胞計數(shù)減少(低于400cd4+t細胞/微升血)；此外，所有這三個病例顯示非常低數(shù)量的cd31+cd4+t細胞(近期胸腺遷入)，表明胸腺中t細胞的產(chǎn)生減少。所有3例在染色體22q11.2處都具有遺傳缺失，與digeorge綜合征的診斷相符。

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