本發(fā)明涉及一種生物材料用透明化試劑、及其利用。

背景技術(shù)：

在使用光學(xué)顯微鏡觀察生物材料的深部時(shí)，通常會(huì)利用透明化試劑來(lái)進(jìn)行處理(透明化處理)。

關(guān)于透明化試劑及透明化處理方法，具代表性的例如已有專(zhuān)利文獻(xiàn)1及非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中揭示的由ann-shynchiang提出的focusclear(商品名)溶液、或非專(zhuān)利文獻(xiàn)2中揭示的由hans-ulrichdodt等人提出的組織透明法(tissueclearingmethod)。這些技術(shù)均用以通過(guò)使組織透明化來(lái)觀察組織中所存在的用熒光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)構(gòu)。

由于這些方法需要將有機(jī)溶劑用作透明化處理的有效成分等，因此存在難以用于生物材料以及會(huì)引起作為透明化處理對(duì)象的生物材料收縮的問(wèn)題。

鑒于這些問(wèn)題，本領(lǐng)域開(kāi)發(fā)出了一種使用含尿素的水溶性試劑的透明化技術(shù)(scale)。scale法建立了對(duì)生物材料施以透明化來(lái)三維地觀察生物材料結(jié)構(gòu)的技術(shù)基石。(專(zhuān)利文獻(xiàn)2、非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。

例如，在scale法公開(kāi)后，公開(kāi)了通過(guò)含有果糖的溶液來(lái)調(diào)節(jié)折射率，將生物材料透明化的技術(shù)(seedb)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3、非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。seedb法的目的在于將處理過(guò)程中發(fā)生的生物材料變質(zhì)抑制在最小程度，光學(xué)顯微鏡觀察的結(jié)果表明了膜結(jié)構(gòu)、軸突之類(lèi)的生物材料的形狀能得以維持。但是，由于觀察對(duì)象的折射率變得非常高，因此為了充分發(fā)揮觀察效果，需要使用雙光子顯微鏡及最適合高折射率的透鏡。

非專(zhuān)利文獻(xiàn)5中，公開(kāi)了一種使用電泳裝置，通過(guò)物理化學(xué)性方法進(jìn)行透明化的技術(shù)(clarity)。clarity法中，使用電泳裝置對(duì)用丙烯酰胺聚合物固定后的腦組織進(jìn)行物理化學(xué)性處理來(lái)除去脂質(zhì)成分，并用兩周時(shí)間使腦組織透明化。但其存在需要專(zhuān)用設(shè)備且工序也復(fù)雜的問(wèn)題。另外，電泳會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)熱，因此難以防止生物材料中的蛋白質(zhì)的熱變質(zhì)。

此外，由于clarity法利用高濃度(4％)的離子性表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sds)使脂質(zhì)從組織溶出，由此消除脂質(zhì)膜導(dǎo)致的光散射來(lái)進(jìn)行透明化，因此會(huì)對(duì)細(xì)胞的原生質(zhì)膜、分泌小泡等結(jié)構(gòu)、以及脂質(zhì)膜中浮游的蛋白等造成大幅損傷。

像這樣，雖然繼使用尿素的透明化技術(shù)scale法之后開(kāi)發(fā)了多種多樣的生物材料透明化技術(shù)，但顯然只有scale具有優(yōu)點(diǎn)。

scale法中，例如不存在seedb法中出現(xiàn)的需要使用最適合于高折射率的透鏡及雙光子顯微鏡等這些缺乏通用性的裝置的問(wèn)題、以及clarity法中出現(xiàn)的專(zhuān)用設(shè)備必要性和生物材料熱變質(zhì)的問(wèn)題。不過(guò)，雖然以往的scale法具有工序非常簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但也被要求在保持生物材料原形的同時(shí)能進(jìn)一步迅速提高透明度(透光性)。

最近，還開(kāi)發(fā)出了一種與scale技術(shù)同樣地以利用尿素的透明化為根干，利用進(jìn)一步含有氨基醇及非離子性表面活性劑的透明化試劑來(lái)處理生物材料，從而實(shí)現(xiàn)透明度優(yōu)異的透明化的技術(shù)(cubic)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。

〔現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)〕

專(zhuān)利文獻(xiàn)1：美國(guó)專(zhuān)利第6472216號(hào)公報(bào)(授權(quán)日2002年10月29日)

專(zhuān)利文獻(xiàn)2：國(guó)際公布wo2011/111876(公開(kāi)日2011年9月15日)

專(zhuān)利文獻(xiàn)3：國(guó)際公布wo2013/191274(公開(kāi)日2013年12月27日)

非專(zhuān)利文獻(xiàn)1：ann-shynchiangetal.：insectnmdareceptorsmediatejuvenilehormonebiosynthesis.pnas99(1)，37-42(2002).

非專(zhuān)利文獻(xiàn)2：hans-ulrichdodtetal.：ultramicroscopy：three-dimensionalvisualizationofneuronalnetworksinthewholemousebrain.naturemethods4(4)，331-336(2007).

非專(zhuān)利文獻(xiàn)3：hamaetal.：scale：achemicalapproachforfluorescenceimagingandreconstructionoftransparentmousebrain.natneuroscience14(11)，1481-8(2011).

非專(zhuān)利文獻(xiàn)4：keetal.：seedb：asimpleandmorphology-preservingopticalclearingagentforneuronalcircuitreconstruction.natneuroscience16(8)，1154-61(2013).

非專(zhuān)利文獻(xiàn)5：chungetal.：structuralandmolecularinterrogationofintactbiologicalsystems.nature497(7449)，332-7(2013).

非專(zhuān)利文獻(xiàn)6：susakietal.：whole-brainimagingwithsingle-cellresolutionusingchemicalcocktailsandcomputationalanalysis.cell157(3)，726-39(2014).

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

〔發(fā)明要解決的問(wèn)題〕

迄今為止，在對(duì)生物材料進(jìn)行透明化時(shí)，保持生物材料的原形和縮短透明度(透光性)上升時(shí)間是互斥的課題，兩者未能同時(shí)實(shí)現(xiàn)。

例如，wo2012/147965中公開(kāi)的技術(shù)(scaleb4)能夠縮短生物材料透明度上升的所需時(shí)間。但其著重于快速使作為透明化處理有效成分的尿素等進(jìn)行浸潤(rùn)而用高濃度尿素進(jìn)行處理，因此會(huì)導(dǎo)致生物材料的膨脹(變形)。

wo2011/111876中公開(kāi)的技術(shù)(scaleu2)雖然能有效抑制生物材料的膨脹，但沒(méi)能獲得縮短透明度上升時(shí)間的效果。

像這樣，至今尚未能同時(shí)實(shí)現(xiàn)生物材料的原形維持和透明度(透光性)上升時(shí)間的短縮。

cubic法縮短了透明度上升時(shí)間，但存在因所含的高濃度非離子性表面活性劑的影響而導(dǎo)致細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)被破壞的憂(yōu)患。另外，含有氨基醇的cubic溶液的ph為11.4，該強(qiáng)堿性會(huì)導(dǎo)致構(gòu)成膜的蛋白質(zhì)的變質(zhì)和失活，因此構(gòu)成細(xì)胞中的膜的正常微小結(jié)構(gòu)很可能得不到維持。實(shí)際上，本發(fā)明人使用電子顯微鏡觀察了微小結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用cubic法處理后的生物材料的細(xì)胞中發(fā)生了組織形狀的嚴(yán)重破壞。根據(jù)該見(jiàn)解，本發(fā)明人注意到cubic法中的透明化處理時(shí)間的縮短效果其實(shí)是因生物材料的變質(zhì)和細(xì)胞微小結(jié)構(gòu)的崩潰而使得透明化試劑變?nèi)菀捉?rùn)的結(jié)果。

因此，迄今尚無(wú)能在保持生物材料原形的基礎(chǔ)上不使生物材料中細(xì)胞的微小級(jí)別的結(jié)構(gòu)發(fā)生大幅形狀變化、且可以迅速進(jìn)行透明化的透明化試劑。

本發(fā)明是為了解決所述的課題而完成的，其目的在于，提供一種利用山梨糖醇與作為有效成分的尿素或尿素衍生物的組合所帶來(lái)的相乘效果的新穎生物材料用透明化試劑、及其利用。

〔解決課題的手段〕

為了解決所述的課題，本發(fā)明人進(jìn)行了專(zhuān)心研究。首先，研究了浸潤(rùn)到生物材料中時(shí)可提高透明度的有效成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將單獨(dú)使用時(shí)并無(wú)實(shí)質(zhì)效果的山梨糖醇與尿素或尿素衍生物組合使用，可發(fā)揮出提高透明度的顯著效果。另外，山梨糖醇能使生物材料收縮，因此通過(guò)將山梨糖醇與尿素組合，獲得了可防止scalea2、scaleu2法中出現(xiàn)的生物材料膨脹問(wèn)題的效果。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用該透明化試劑對(duì)表達(dá)了熒光蛋白質(zhì)的生物材料進(jìn)行透明化時(shí)，與現(xiàn)有的透明化試劑相比，熒光蛋白質(zhì)的熒光消失少，因此該透明化試劑還適于用來(lái)觀察使用了熒光蛋白質(zhì)的生物材料。

此外，關(guān)于進(jìn)一步縮短透明度上升時(shí)間的效果性方法，為了在不使生物材料的微小結(jié)構(gòu)崩潰的情況下使透明化試劑有效地浸潤(rùn)，本發(fā)明人萌生了先使生物材料收縮一次，然后在其體積因收縮效應(yīng)消失時(shí)的應(yīng)力而復(fù)原時(shí)使透明化試劑浸潤(rùn)的構(gòu)思。由此，無(wú)需實(shí)施會(huì)引起蛋白質(zhì)變質(zhì)、細(xì)胞微小結(jié)構(gòu)破壞的化學(xué)處理，就能使透明化試劑有效地浸潤(rùn)。

由此，完成了本申請(qǐng)發(fā)明。

即，本發(fā)明為了解決所述的課題，具備以下的方案。

一種生物材料用透明化試劑，其是含有山梨糖醇、濃度為5w/v％以下的表面活性劑、及選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物的溶液。

〔發(fā)明的效果〕

本發(fā)明的效果在于能提供一種將尿素或尿素衍生物與山梨糖醇組合使用的生物材料用透明化試劑及其利用，該生物材料用透明化試劑能在不使生物材料的原形大幅變化的情況下迅速提高透明度。

附圖說(shuō)明

[圖1]圖1示出了涉及光學(xué)性透明化及信號(hào)維持/結(jié)構(gòu)維持的scales的性能。(a)示出了用scales(左)或pbs(右)處理后的小鼠腦半球全體(10周大)，是與網(wǎng)紋背景(畫(huà)有2.5mm見(jiàn)方格子的坐標(biāo)圖用紙)一起拍攝的照片的示圖。(b)、(c)是用scales(左)或pbs(右)對(duì)10周大yfp-h小鼠(b)和10周大chr2-yfp小鼠(c)的腦半球進(jìn)行處理，然后對(duì)透射度(t：transmission)及yfp熒光(fl)維持性進(jìn)行比較的圖。蛋白質(zhì)的外漏情況隨組織固定程度而異，因此蛋白質(zhì)的外漏有時(shí)隨所用動(dòng)物的不同而不同。在此，通過(guò)使用同一小鼠的腦的左半球和右半球，進(jìn)行了scales與pbs的正確比較。a：(前頭部)；p：(后頭部)；比例尺：2.5mm。按照樣本的尺寸，對(duì)透明化的孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。使用與(a)同樣的網(wǎng)紋背景，得到了透射圖像。(d)～(h)示出了經(jīng)scales處理后又被復(fù)原至了該處理前的狀態(tài)的樣本的tem觀察結(jié)果。用4％pfa將yfp-h小鼠(10周大)的腦半球全體固定，并用了scales來(lái)將其完全透明化。以供成像實(shí)驗(yàn)所用為前提，花一晚時(shí)間將透明樣本在封固溶液(scales4)內(nèi)以37℃孵育了14小時(shí)。接著，用pbs將該透明樣本洗滌，從而恢復(fù)至了用scales處理前的狀態(tài)(復(fù)原)。之后從復(fù)原的樣本切下了1mm的立方體，用來(lái)制作超薄切片。(d)是皮質(zhì)層ii/iii的錐體神經(jīng)元的兩個(gè)細(xì)胞體的顯微照片圖。(e)是與(d)中的方框相對(duì)應(yīng)的放大顯微照片圖。(f)是與(e)中的方框相對(duì)應(yīng)的放大顯微照片圖?？招募^表示對(duì)稱(chēng)性突觸。(g)、(h)是存在于神經(jīng)纖維網(wǎng)內(nèi)兩處((d)中所示的方框)上的興奮性非對(duì)稱(chēng)性突觸的圖。實(shí)心箭頭示出了突觸后膜的致密情況。den表示樹(shù)突，ah表示軸丘，ais表示軸突始段，at表示軸突終末。(e)的比例尺為3μm，(f)、(f‘)、(g)、(h)的比例尺為200nm。

[圖2]圖2示出了為了將aβ淀粉樣變病可視化而對(duì)高齡app基因敲入小鼠app^nl-f/nl-f(20個(gè)月大)的腦左半球應(yīng)用了abscale后的結(jié)果。腦半球的最大尺寸為長(zhǎng)6mm、寬4mm、高4mm。(a)示出了三重染色免疫組織化學(xué)的流程圖。使用抗aβ單克隆抗體(alexa488-6e10，以青色標(biāo)示)和抗neun單克隆抗體(cy5-a60，以品紅色標(biāo)示)來(lái)進(jìn)行了對(duì)腦半球全體的切斷前(pre-cut)染色。使用抗neun多克隆抗體(cy3-αneun，以黃色標(biāo)示)來(lái)進(jìn)行了對(duì)腦切除部分的切斷后(post-cut)染色。為了便于看清，圖中強(qiáng)調(diào)顯示了海馬區(qū)細(xì)胞層；切斷前染色完成后的該細(xì)胞層以品紅色標(biāo)示，切斷后染色完成后的該細(xì)胞層以黃色與品紅色的混合色來(lái)標(biāo)示。(b)～(d)是用以下的顏色所染色了的熒光發(fā)光圖像圖。(b)示出了用cy3-βneun(以黃色標(biāo)示)染色了的切斷后樣本，(c)示出了用cy5-a60(以品紅色標(biāo)示)染色了的切斷前樣本，(d)示出了用alexa488-6e10(以青色標(biāo)示)染色了的切斷前樣本。cy5-a60與neun的c末端反應(yīng)，而cy3-αneun與蛋白質(zhì)全體反應(yīng)，因此這兩個(gè)抗體間不發(fā)生沖突。如(c)所示，與從腦表面及正中面起的距離無(wú)關(guān)，切片內(nèi)的各神經(jīng)元細(xì)胞核的熒光信號(hào)強(qiáng)度大致相同，這說(shuō)明cy5-a60高效浸透在了腦半球內(nèi)。(e)是將(b)與(c)合成后的圖像。(f)是將(c)與(d)合成后的圖像。(g)、(h)表示的是(f)的高倍放大圖像。scx：軀體感覺(jué)皮質(zhì)。各圖的比例尺均為1mm。

[圖3]圖3表示的是應(yīng)用了chemscale和abscale的復(fù)合方式的aβ斑的3d可視化結(jié)果。(a)、(b)是對(duì)18個(gè)月大(a)和9個(gè)月大(b)的app^nl-f/nl-f小鼠的腦半球全體中的aβ斑進(jìn)行了3d可視化而得到的圖。腦半球?yàn)榻?jīng)pp-bta-1(紅)和alexa488-6e10(綠)染色后的狀態(tài)。為了觀察透明化后的腦半球的外側(cè)面及中央平面的體繪制(volumerendering)圖像，使用了具備10倍物鏡的olympusfv1000系統(tǒng)。雖然(a)圖中可以看見(jiàn)斑點(diǎn)散布于腦半球全體，但根據(jù)不同角度(未顯示數(shù)據(jù))的觀察結(jié)果，斑點(diǎn)主要是存在于大腦皮質(zhì)。a表示前頭部，p表示后頭部。(a)中的插圖為典型性老年斑的高倍率體繪制圖像。(c)是對(duì)20個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠的大腦皮質(zhì)內(nèi)的一部分aβ斑(alexa488-6e10，綠色)及血管(texasredlectin，紅色)進(jìn)行了3d可視化而得到的圖。在其觀察中，使用了具備20倍物鏡的zeisslightsheetz.1。從后方和前方看的透視圖像是由以不同深度和角度拍攝的多個(gè)圖像所制成的。

[圖4]圖4是對(duì)aβ斑與小神經(jīng)膠質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了3d可視化而得到的圖，其中應(yīng)用了二重染色abscale。將用alexa488-6e10和alexa546-iba1(兔抗iba1多克隆抗體+被alexa546標(biāo)記了的抗兔igg抗體)實(shí)施了免疫染色后的高齡app^nl-f/nl-f小鼠腦切片用作材料，進(jìn)行了3d-ihc并得到了全部數(shù)據(jù)。6e10陽(yáng)性aβ斑和ibal陽(yáng)性小神經(jīng)膠質(zhì)分別呈綠色和紅色。(a)是厚2mm的腦切片內(nèi)的aβ斑和小神經(jīng)膠質(zhì)如何被免疫染色，以及如何在spim系統(tǒng)下被觀察/被成像的概略圖。aβ斑和小神經(jīng)膠質(zhì)分別表示成綠色斑點(diǎn)和紅點(diǎn)。青綠色和橙色的箭頭分別表示spim系統(tǒng)的照明光和檢測(cè)方向。實(shí)際的觀察區(qū)域用四邊形框出。對(duì)象體以xyz坐標(biāo)來(lái)定義。(b)～(i)為使用20個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠而得到的數(shù)據(jù)。(b)、(c)為根據(jù)觀察區(qū)域所生成的2個(gè)體繪制圖像(參照(b)的xy面、(c)的xz面、(a)的xyz面)。(d)為在觀察區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到的37個(gè)aβ斑和小神經(jīng)膠質(zhì)的高倍率體繪制圖像。(e)示出了在以斑為中心的3d空間上測(cè)出的距離，示出了自動(dòng)算出的從斑邊緣到各小神經(jīng)膠質(zhì)中心部的距離(黃色箭頭)。(f)～(h)示出了表現(xiàn)出不同的小神經(jīng)膠質(zhì)相互作用的兩個(gè)aβ斑。(h)是針對(duì)兩個(gè)斑所示出的、從斑邊緣到小神經(jīng)膠質(zhì)中心的距離的直方圖。坐標(biāo)圖中示出了活化了的小神經(jīng)膠質(zhì)(粉紅色)的數(shù)量、以及休眠狀態(tài)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(紫羅蘭色)的數(shù)量。(i)的直方圖中，針對(duì)全部37個(gè)斑，示出了從斑邊緣到附近的小神經(jīng)膠質(zhì)的中心部的距離。(j)～(1)是使用10個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠而得到的數(shù)據(jù)。(j)是根據(jù)觀察區(qū)域所生成的體繪制圖像(xy面)。(k)是在觀察區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到的27個(gè)aβ斑和小神經(jīng)膠質(zhì)的高倍率體繪制圖像。(1)的直方圖中，針對(duì)全部27個(gè)斑，示出了從斑邊緣到附近的小神經(jīng)膠質(zhì)的中心部的距離。

[圖5]圖5是使用多色abscale來(lái)對(duì)存在于ad患者(2人)死后腦樣本內(nèi)的aβ斑與小神經(jīng)膠質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行3d可視化而得到的圖。使用alexa488-6e10、alexa546-iba1及cy5-c60來(lái)進(jìn)行了3d-ihc，并得到了數(shù)據(jù)。(a)～(c)是從84歲女性(標(biāo)識(shí)號(hào)#1617)的樣本得到的數(shù)據(jù)。(a)是從觀察區(qū)域得到的體繪制圖像(xz面)。該區(qū)域中觀察到了11個(gè)有芯斑，其中3個(gè)與小神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)，8個(gè)與小神經(jīng)膠質(zhì)分開(kāi)(參照?qǐng)D19)。另外，(b)是強(qiáng)調(diào)顯示了2個(gè)獨(dú)立斑(在(a)中表示為§及)的高倍率體繪制圖像(xy面)。另一方面，(c)是強(qiáng)調(diào)顯示了與小神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)的斑當(dāng)中的1個(gè)斑(在(a)中表示為縱向排列的“++”)的高倍率體繪制圖像(xy面)。(d)～(i)是從82歲男性(標(biāo)識(shí)號(hào)#1523)的樣本得到的數(shù)據(jù)。(d)是根據(jù)觀察區(qū)域所生成的體繪制圖像(xz面)。(e)是示范出為了制作各種部位及各種厚度的z-堆棧圖像(2維投影圖像)而如何對(duì)由110枚xy圖像構(gòu)成的觀察域的3d重建圖像進(jìn)行體系性再分割的圖表。根據(jù)經(jīng)z-堆?；玫膸讉€(gè)xy圖像，可以看到比大量的明亮物體(細(xì)胞內(nèi)的6e10信號(hào))較大且不清晰的物體(擴(kuò)散斑)。(f)是由圖像編號(hào)為28～33的xy圖像所構(gòu)成的z-堆棧圖像，其表明了與聚成一團(tuán)的小神經(jīng)膠質(zhì)在空間上發(fā)生相互作用的擴(kuò)散斑的存在。(g)是由圖像編號(hào)為53-63的xy圖像所構(gòu)成的z-堆棧圖像，其表明了與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)相互作用的擴(kuò)散斑的存在。通過(guò)這樣的體系性再分割，清晰發(fā)現(xiàn)了在(d)所示的觀察域內(nèi)共存在26個(gè)擴(kuò)散斑，這可參照?qǐng)D19。(h)、(i)是對(duì)(f)、(g)所示的擴(kuò)散斑進(jìn)行了強(qiáng)調(diào)顯示的體繪制圖像。比例尺：f、g均為100μm。vr：體繪制圖像。zst：z-堆棧圖像。

[圖6]圖6示出了scalesq方式下的情況，scalesq方式是用于腦切片的scales方式的快速版。供顯微觀察的裝片(mount)均用scales4(0)在室溫下經(jīng)過(guò)了2小時(shí)以下的處理。(a)～(f)是使用scalesq(0)處理后的結(jié)果圖。(a)～(c)是在scalesq(0)內(nèi)分別將8周大yfp-h小鼠的1mm厚腦切片在37℃下孵育(a)0小時(shí)、(b)1小時(shí)、(c)2小時(shí)后的透射圖像。(d)是用scalesq(0)處理后的腦切片的熒光圖像。(e)是皮質(zhì)區(qū)內(nèi)((d)中以白色方框線(xiàn)來(lái)表示)的表達(dá)了yfp的神經(jīng)細(xì)胞的3d繪圖。得到了723個(gè)spim圖像，并進(jìn)行了3d重建(用白線(xiàn)所框圍的區(qū)域)。藍(lán)色箭頭表示照明光方向，綠色箭頭表示熒光檢測(cè)方向。(f)是對(duì)經(jīng)scalesq(0)處理后又被復(fù)原至了該處理前的狀態(tài)的小鼠腦樣本內(nèi)的興奮性突觸進(jìn)行em觀察而得到的結(jié)果圖。(g)～(1)是使用scalesq(5)進(jìn)行處理后的結(jié)果圖。(g)～(i)是在scalesq(5)內(nèi)分別將8周大yfp-h小鼠的1mm厚腦切片在37℃下孵育(a)0小時(shí)、(b)1小時(shí)、(c)2小時(shí)后的透射圖像。(j)是用scalesq(5)處理后的腦切片的熒光發(fā)光圖像。(k)是皮質(zhì)區(qū)內(nèi)((j)中以白色方框線(xiàn)來(lái)表示)的表達(dá)了yfp的神經(jīng)細(xì)胞的3d繪圖。得到了769個(gè)用于制作3d重建圖像(用白線(xiàn)所框圍的區(qū)域)的spim圖像。(1)示出了經(jīng)scalesq(5)處理后又用pbs進(jìn)行置換而被復(fù)原至了該處理前的狀態(tài)的小鼠腦樣本內(nèi)的、用em觀察到的興奮性突觸。(e)、(k)內(nèi)的藍(lán)色及綠色的箭頭分別表示照明光方向和熒光檢測(cè)方向。at表示軸突終末，den表示樹(shù)突(f、1)。實(shí)心箭頭示出了突觸后膜的致密情況。(d)、(j)的比例尺為2.5mm，(f)、(1)的比例尺為200nm。更詳細(xì)信息示于圖20。

[圖7]是含山梨糖醇的生物材料用透明化試劑以及含赤蘚醇的比較用試劑所引起的小鼠大腦半球透明化的比較圖。

[圖8]示出了實(shí)施例中使用的試劑的組分。

[圖9](a)示出了scalea2處理的一例規(guī)程(protocol)。關(guān)于該規(guī)程，可以參照美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利2013-0045503號(hào)。(b)示出了scales處理的一例規(guī)程。圖8中示出了scales處理中采用的溶液的組分。首先，通過(guò)使用scales0溶液進(jìn)行孵育這樣極簡(jiǎn)單的處理，使生物材料(特別是經(jīng)固定了的生物材料)物質(zhì)的透過(guò)性大幅提高。接著，依次用scales1溶液、scales2溶液及scales3溶液，對(duì)透過(guò)性提高后的生物材料進(jìn)行孵育。最后，用pbs清洗生物材料(descaling)來(lái)使生物材料恢復(fù)至了原狀態(tài)，接著，在觀察前用scales4溶液進(jìn)行孵育。scales4溶液也可用作裝片用溶液。各階段的孵育也可以在4℃左右的低溫下進(jìn)行，但如圖示那樣地在更高溫度(例如37℃)下進(jìn)行，則可以得到透明化處理速度加快的效果。孵育是用能控制溫度的回旋振蕩器來(lái)進(jìn)行的。

[圖10]圖10示出了abscale處理的一例規(guī)程。這里，圖中所示的scaleb4(0)為8m濃度的尿素水溶液。

[圖11]圖11示出了chemscale處理的一例規(guī)程。這里，圖中所示的scaleb4(0)的組分與圖10相同。

[圖12]圖12示出了經(jīng)scales處理了的生物材料的體積變化，(a)是就體積變動(dòng)情況而對(duì)處理開(kāi)始前(0小時(shí))和處理后(72小時(shí))進(jìn)行比較的坐標(biāo)圖(其對(duì)照組是pbs處理)，(b)示出了經(jīng)scales處理、scalea2處理、pbs處理(對(duì)照組)后的生物材料的外觀。

[圖13]圖13示出了在使用來(lái)自?xún)煞N小鼠的試樣的實(shí)驗(yàn)中，基于cubic法的處理對(duì)yfp熒光造成的不良影響。比起pbs處理(對(duì)照組)，基于cubic法的處理造成了yfp熒光的減弱。

[圖14]圖14示出了經(jīng)scales處理(左側(cè))及cubic處理(右側(cè))后又被復(fù)原至了原狀態(tài)的切片的免疫組織化學(xué)情況。將取自c57bl6/j野生型小鼠(10周大)的腦樣本分割為兩個(gè)半球。右半球及左半球分別經(jīng)scales處理及cubic處理而透明化后，用pbs清洗而復(fù)原至了原狀態(tài)。在20％蔗糖/pbs中進(jìn)行冷凍保存后，將復(fù)原了的腦樣本包埋于oct包埋劑(octcompound)中。使用低溫恒溫器，切割出了50μm厚的冠狀面。將得到的切片在0.1(wt/vol)％tritonx-100/1％封閉試劑(roche)/pbs中進(jìn)行了通透處理/封閉處理1小時(shí)。之后，運(yùn)用懸浮(freefloating)免疫組織化學(xué)進(jìn)行了處理。使用的2次抗體為與alexafluor546共軛了的山羊抗兔igg抗體(molecularprobes)、與alexafluor546共軛了的山羊抗小鼠igg抗體(molecularprobes)、與alexafluor488共軛了的山羊抗兔igg抗體(molecularprobes)。dg表示齒狀回，gcl表示顆粒層，mf表示苔蘚纖維，sgz表示顆粒下層，so表示起始層，sr表示放射層。比例尺為100μm。

[圖15]示出了經(jīng)scales處理(左側(cè))及cubic處理(右側(cè))后又被復(fù)原至了原狀態(tài)的腦樣本的tem觀察結(jié)果。用4％pfa固定了c57bl6/j小鼠(9周大)的全腦。用固定后的腦制備了含有海馬區(qū)的切片(1mm厚)，并將其割半。對(duì)于左半邊，依照?qǐng)D9的b所示的方法，經(jīng)scales處理而進(jìn)行了透明化。右半邊通過(guò)cubic法進(jìn)行了透明化，但考慮到切片厚度，將使用cubic試劑1進(jìn)行的孵育的時(shí)間減半。用pbs(-)在4℃下清洗兩個(gè)透明化后的試樣12小時(shí)，由此復(fù)原至了原狀態(tài)。將兩個(gè)復(fù)原后的切片制備成超薄切片，并用1200ex-ii(jeol)進(jìn)行了tem觀察。

[圖16]是與圖15所示情況同樣地，對(duì)經(jīng)scales處理(左側(cè))及cubic處理(右側(cè))后又被復(fù)原至了原狀態(tài)的腦樣本進(jìn)行tem觀察的另一結(jié)果圖。

[圖17]圖17示出了多色成像實(shí)驗(yàn)中的光學(xué)成分。alexa488、alexa546、cy3、cy5及pp-bta-1的激發(fā)光光譜(虛線(xiàn))及發(fā)射光光譜(實(shí)線(xiàn))經(jīng)過(guò)了標(biāo)準(zhǔn)化，顯示成與對(duì)應(yīng)的圖2、圖3、圖4、圖5相同的顏色。(a)與立體顯微鏡下的觀察相對(duì)應(yīng)(與圖2對(duì)應(yīng))。圖中的方框表示激發(fā)光濾色片及發(fā)射光濾色片下的透射特性(立體顯微鏡用)。(b)、(c)、(d)與共聚焦顯微鏡下的觀察(與圖3a、圖3b對(duì)應(yīng))、以及spim下的觀察相對(duì)應(yīng)(圖3c、圖4及圖5)。圖中，箭頭表示激光線(xiàn)。發(fā)射光濾色片下的透射特性用綠色及紅色的方框來(lái)表示。

[圖18]圖18是每個(gè)斑所對(duì)應(yīng)的柱狀圖，示出了活化了的小神經(jīng)膠質(zhì)與斑端部間的距離以及休眠的小神經(jīng)膠質(zhì)與斑端部間的距離的分布情況。圖的左側(cè)對(duì)應(yīng)于20個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠腦區(qū)域中的37個(gè)斑。圖的右側(cè)對(duì)應(yīng)于10個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠腦區(qū)域中的27個(gè)斑。淺色的謄體字代表未與這些斑附近(＜21μm)的任意的活化小神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生締合的退化斑的編號(hào)。紅色字代表其他斑(可能是急性或亞急性)的編號(hào)。為了能區(qū)別近距離相鄰的小神經(jīng)膠質(zhì)和遠(yuǎn)距離相鄰的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，坐標(biāo)圖內(nèi)的縱虛線(xiàn)位于21μm處。

[圖19]圖19示出了阿爾茨海默病患者的死后腦樣本中2個(gè)免疫信號(hào)(6e10(綠)及a60(青))的三維重建圖。就每個(gè)樣本，對(duì)與神經(jīng)膠質(zhì)締合了的有芯斑、及未與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞締合的擴(kuò)散斑進(jìn)行了計(jì)數(shù)，并測(cè)定了它們的體積。另外，全部樣本的小神經(jīng)膠質(zhì)均經(jīng)過(guò)了免疫染色。#1617及#1523的6e10信號(hào)(綠)及ibal信號(hào)(紅)分別示于圖5的(a)及圖5的(b)中。

[圖20]圖20是用scalesq(0)(a～h)及scalesq(5)(i～p)進(jìn)行處理后的結(jié)果圖。(a)～(h)是將由8周大yfp-h小鼠制得的1mm厚腦切片在37℃的scalesq(0)中孵育之前(a)、孵育0小時(shí)后(b)、孵育1小時(shí)后(c)及孵育2小時(shí)后(d、e)的熒光圖像(a、e)及透射圖像(b～d)。(f)～(h)示出了繼scalesq(0)處理后又復(fù)原了的腦樣本的tem觀察結(jié)果。與圖1的方案同樣地制作了超薄切片并進(jìn)行了成像。(f)是映現(xiàn)有神經(jīng)細(xì)胞體的顯微鏡觀察結(jié)果圖。(g)是(f)中的顯示有興奮性非對(duì)稱(chēng)突觸的方框部的放大顯微圖像。(h)是(f)中的顯示有髓軸突的方框部的放大顯微圖像。(i)～(m)是將由8周大yfp-h小鼠制得的1mm厚腦切片在37℃的scalesq(5)中孵育之前(i)、孵育0小時(shí)后(j)、孵育1小時(shí)后(k)及孵育2小時(shí)后(1、m)的熒光圖像(i、m)及透射圖像(j～1)。(n)～(p)示出了繼scalesq(5)處理后又復(fù)原了的腦樣本的tem觀察結(jié)果。與圖1的方案同樣地制作了超薄切片并進(jìn)行了成像。(n)是映現(xiàn)有神經(jīng)細(xì)胞體的顯微圖像。(o)是(n)中的顯示有興奮性非對(duì)稱(chēng)突觸的方框部的放大顯微圖像。(p)是(n)中的顯示有髓軸突的方框部的放大顯微圖像。箭頭示出了致密化了的突觸后膜的密集度。den：樹(shù)突；at：軸突終末；my：髓磷脂；比例尺：(a)～(e)、(i)～(m)為5mm，(f)、(n)為4μm，(g)、(h)、(o)、(p)為200μm。

[圖21]圖21是對(duì)經(jīng)scaless20及scaless40處理后的yfp-h小鼠腦半球的透光性、yfp熒光信號(hào)強(qiáng)度、及體積變動(dòng)進(jìn)行觀測(cè)后的結(jié)果圖。(a)～(c)是透光性、yfp熒光信號(hào)強(qiáng)度、及體積變動(dòng)的坐標(biāo)圖。(d)～(e)是運(yùn)用scaless20及scaless40而獲得的透明化結(jié)果的照片圖。(d)是顯微照片圖，(e)表示的是與(d)對(duì)應(yīng)的熒光圖像。(l)：左半球；(r)：右半球。

[圖22]圖22是將經(jīng)scaless40處理后的yfp-h小鼠全腦與網(wǎng)紋背景一同拍攝的照片圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

〔1.生物材料用透明化試劑〕

(生物材料用透明化試劑的有效成分)

本發(fā)明的一個(gè)方案中的“生物材料用透明化試劑”是含有“尿素”作為必需有效成分的溶液。

本發(fā)明的其他方案中的“生物材料用透明化試劑”是含有“尿素衍生物”作為必需有效成分的溶液。

所述尿素衍生物的種類(lèi)并無(wú)特別限定，具體例如有各種烷基脲、或下述通式(1)所示的化合物。在此，通式(1)所示的化合物包括一部分種類(lèi)的烷基脲。本發(fā)明的生物材料用透明化試劑只要含有選自尿素及尿素衍生物中的至少1種化合物來(lái)作為有效成分即可，這其中更優(yōu)選含有尿素。

[化1]

通式(1)所示的尿素衍生物中，r1、r2、r3、r4各自獨(dú)立地為氫原子(但r1～r4全部為氫原子時(shí)，則就是尿素，因此該情況除外)、鹵素原子或烴基，其中當(dāng)構(gòu)成烴基的碳原子有多個(gè)時(shí)，這些碳原子的一部分碳原子也可經(jīng)過(guò)了氮原子、氧原子、硫原子等雜原子的取代。烴基包括鏈狀烴基及環(huán)狀烴基。

作為所述鏈狀烴基，例如可例示鏈烷基、鏈烯基及鏈炔基等。構(gòu)成鏈狀烴基的碳的數(shù)量并無(wú)特別限定，例如可舉出碳數(shù)6以下的直鏈狀或分支狀的烴基，優(yōu)選碳數(shù)為1～3的烷基。鏈狀烴基上也可以具有例如鹵素原子等取代基。作為鏈狀烷基的例子，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、己基、辛基等。

作為所述環(huán)狀烴基，例如可例示環(huán)烷基及環(huán)烯基等。環(huán)狀烴基上也可具有例如鹵素原子等取代基。作為環(huán)烷基的例子，可舉出環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等這些碳數(shù)3以上的環(huán)烷基，優(yōu)選碳數(shù)6以下的環(huán)烷基。作為環(huán)烯基的例子，可舉出環(huán)己烯基等碳數(shù)3以上的環(huán)烯基，優(yōu)選碳數(shù)6以下的環(huán)烯基。

作為所述鹵素原子，可列舉氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。

另外，關(guān)于通式(1)所示尿素衍生物的更優(yōu)選的具體例，例如有滿(mǎn)足以下條件1)～2)的尿素衍生物。

條件1)：選自r1～r4的任意3個(gè)基為氫原子，剩余的1個(gè)基是鹵素原子或碳數(shù)1～6的鏈狀烴基，更優(yōu)選為剩余的1個(gè)基為碳數(shù)1～3或碳數(shù)1～2的烷基。

條件2)：選自r1～r4的任意2個(gè)基為氫原子，剩余的2個(gè)基各自獨(dú)立地是鹵素原子或碳數(shù)1～6的鏈狀烴基，更優(yōu)選剩余的2個(gè)基均是碳數(shù)1～3或碳數(shù)1～2的烷基，關(guān)于作為氫原子的2個(gè)基，優(yōu)選這2個(gè)基中的一方是r1或r2，另一方是r3或r4。

上述選自尿素及尿素衍生物中的至少1種化合物的含量只要能發(fā)揮生物材料的透明化效果，則沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選以1.0m以上且9.5m以下的濃度范圍含有該化合物。該化合物的濃度更優(yōu)選處在1.5m以上且8.0m以下的范圍內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選處在1.8m以上且6.0m以下的范圍內(nèi)。作為一例，該化合物的濃度的可以處在3m以上且5m以下的范圍內(nèi)。另外，“尿素及尿素衍生物”的含量上限取決于尿素在所使用的溶劑中的溶解度。雖然也視對(duì)象生物材料的種類(lèi)而言，但例如可以在“生物材料用透明化試劑”中的尿素及尿素衍生物的含量較少時(shí)增加處理時(shí)間，而在尿素及尿素衍生物的含量較多時(shí)縮短處理時(shí)間，由此進(jìn)行必要的透明化處理。

(山梨糖醇)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”除了含有選自尿素及尿素衍生物中的至少1種化合物以外，還含有“山梨糖醇”作為必需有效成分?！吧锊牧嫌猛该骰噭眱?yōu)選以15(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇。山梨糖醇的濃度更優(yōu)選處于18(w/v)％以上且48(w/v)％以下的范圍內(nèi)。作為一例，山梨糖醇的濃度可以處于30(w/v)％以上且50(w/v)％以下的范圍內(nèi)。本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”中，當(dāng)山梨糖醇處于以上濃度范圍時(shí)，所述選自尿素及尿素衍生物中的至少1種化合物的濃度優(yōu)選處于1.0m以上且9.5m以下的濃度范圍。該化合物的濃度更優(yōu)選處于1.5m以上的范圍內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選處于1.5m以上且8.0m以下的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選處于1.8m以上且6.0m以下的范圍內(nèi)。作為一例，該化合物的濃度可以處于3m以上且5m以下的范圍內(nèi)。山梨糖醇的濃度和尿素等的濃度都處于以上范圍內(nèi)時(shí)，尤其能同時(shí)獲得透明化處理的時(shí)間短縮效果和生物材料的變形抑制效果。

(使用尿素或尿素衍生物和山梨糖醇作為有效成分時(shí)的優(yōu)點(diǎn))

關(guān)于將尿素或尿素衍生物和山梨糖醇組合使用時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，可以舉出下述的優(yōu)點(diǎn)：與僅將尿素或尿素衍生物用作透明化處理的有效成分的情況相比，可以不使生物材料的原形大幅變化的情況下迅速提高透明度。山梨糖醇不與尿素或尿素衍生物組合使用時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的效果。但是，其與尿素或尿素衍生物組合使用時(shí)，同時(shí)表現(xiàn)出了不使生物材料的原形大幅變化的效果和迅速地進(jìn)行透明化的效果。其結(jié)果是，即使生物材料為例如極脆弱的組織(胚等)，也能在抑制其損傷及變形的同時(shí)迅速地進(jìn)行透明化處理。另外，對(duì)于到迄今被認(rèn)為難以透明化的來(lái)自老齡生物的生物體試樣，也能在抑制其損傷及變形的同時(shí)迅速地進(jìn)行透明化處理。

另外，尿素、尿素衍生物及山梨糖醇可以說(shuō)都具有下述特性：毒性極低，特別是尿素及山梨糖醇是來(lái)自生物體的成分，因此本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”對(duì)熒光蛋白質(zhì)的損傷小且熒光蛋白質(zhì)的熒光消失情況少，還能應(yīng)用于使用了熒光蛋白質(zhì)的生物材料的觀察；3)極廉價(jià)而容易獲得，且處理性?xún)?yōu)異，因此以極低成本且簡(jiǎn)單的步驟就能進(jìn)行透明化處理。

另外，除上述的優(yōu)點(diǎn)以外，還具有如下優(yōu)點(diǎn)：與現(xiàn)有技術(shù)中的生物材料用透明化試劑相比，可明顯提高光散射性高而不透明的生物材料的透明性，從而能觀察存在于超深部組織中的各種熒光蛋白質(zhì)及熒光物質(zhì)。特別是就腦組織而言，能使目前還是深部觀察中的一個(gè)屏障的白質(zhì)層得以透明化，從而能觀察比白質(zhì)層更位于深部的區(qū)域(例如胼胝體)。用本發(fā)明的試劑來(lái)進(jìn)行的透明化處理是可逆的。具體而言，能僅通過(guò)將透明化處理后的生物材料浸漬到平衡鹽類(lèi)溶液中，來(lái)恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。透明化處理前后的蛋白質(zhì)等的抗原性也實(shí)質(zhì)上保持不變，所以能運(yùn)用通常的組織染色法及免疫染色法來(lái)進(jìn)行分析。

(甘油)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”根據(jù)需要含有“甘油”。甘油的含量并無(wú)特別限定，但優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且35.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以3.0(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，特別優(yōu)選以5.0(w/v)％以上且25.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油。這里，單位(w/v)％是指，使用的甘油的重量(w(公克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

甘油對(duì)免疫應(yīng)答所造成的排斥相對(duì)較低，且甘油比較不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲，因此甘油蓄積在肝臟以及腎臟等中的憂(yōu)患相對(duì)較低。因此甘油的優(yōu)點(diǎn)在于有助于將所述“生物材料用透明化試劑”用于作為生物材料的生物體。另外，甘油也有比較廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。

(表面活性劑)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”也可以視需要而含有表面活性劑。表面活性劑優(yōu)選是非離子性的表面活性劑，其理由在于能緩慢地提升本試劑向生物組織的滲入。作為非離子性的表面活性劑，可列舉：聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯、及聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯等脂肪酸系表面活性劑；聚乙烯醇等高級(jí)醇系表面活性劑；聚氧乙烯辛基苯基醚等烷酚系表面活性劑。具體而言，例如可列舉選自由下述產(chǎn)品所組成的群中的至少一種：tritonx-100及tritonx-140等tritonx(注冊(cè)商標(biāo))系列；tween-20、tween-40、tween-60及tween-80等tween(注冊(cè)商標(biāo))系列；np-40(商品名)。表面活性劑也可以視需要而混合兩種以上來(lái)使用。

這些表面活性劑可提高尿素向生物材料的滲透性，提高透明化處理的效率。特別是若需要對(duì)腦組織白質(zhì)層、脊髓、末梢神經(jīng)纖維束等這類(lèi)透明化處理相對(duì)困難的生物材料進(jìn)行透明化，則“生物材料用透明化試劑”中優(yōu)選含有表面活性劑。

另外，與采用尿素時(shí)的情況同樣，所述表面活性劑也能提高尿素衍生物向生物材料的滲透性。

使用表面活性劑時(shí)，為了防止生物體材料中的細(xì)胞的微小結(jié)構(gòu)的變質(zhì)，其含量需要抑制成5.0(w/v)％以下的濃度。只要表面活性劑的濃度為5.0(w/v)％以下，則無(wú)特別限定，但優(yōu)選以0.025(w/v)％以上且2.5(w/v)％以下的濃度范圍含有表面活性劑，更優(yōu)選以0.05(w/v)％以上且0.5(w/v)％以下的濃度范圍含有表面活性劑，特別優(yōu)選以0.05(w/v)％以上且0.2(w/v)％以下的濃度范圍含有表面活性劑。這里，單位(w/v)％是指，所使用的表面活性劑的重量(w(公克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

(水溶性的高分子化合物)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”也可視需要而進(jìn)而含有水溶性的高分子化合物。在此，所謂高分子化合物是指，分子量例如高達(dá)5萬(wàn)～6萬(wàn)以上而實(shí)質(zhì)上不會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)的化合物。另外，高分子化合物優(yōu)選是不會(huì)引起生物材料的變質(zhì)等的化合物。作為水溶性的高分子化合物，具體例如可舉出交聯(lián)型蔗糖高分子物質(zhì)、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、或percoll(商品名；以聚乙烯基吡咯烷酮皮膜來(lái)包覆膠體狀二氧化硅而得的高分子物質(zhì))等。作為交聯(lián)型蔗糖高分子物質(zhì)，具體例如可舉出ficollpm70(商品名))這樣的用表氯醇使蔗糖進(jìn)行交聯(lián)(共聚)而成的重均分子量約7萬(wàn)的高分子物質(zhì)等。

與尿素及尿素衍生物不同的是，這些水溶性的高分子化合物實(shí)質(zhì)上不會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)且為水溶性，因此有助于調(diào)整細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差。因此，有助于維持作為透明化處理對(duì)象的生物材料的原形，特別是有助于防止生物材料的膨脹。雖無(wú)特別限定，但本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的滲透壓若相對(duì)較高，則優(yōu)選該試劑含有這些水溶性的高分子化合物。

使用“水溶性的高分子化合物”時(shí)，其含量并無(wú)特別限定，但優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且40.0(w/v)％以下的濃度范圍含有該水溶性高分子化合物。另外，關(guān)于該含量，從生物材料膨脹抑制效果與透明化處理后的折射率之間的平衡性觀點(diǎn)考慮，更優(yōu)選以5.0(w/v)％以上且25.0(w/v)％以下的濃度范圍含有該水溶性高分子化合物，進(jìn)而優(yōu)選以10.0(w/v)％以上且20.0(w/v)％以下的濃度范圍含有該水溶性高分子化合物，特別優(yōu)選以10.0(w/v)％以上且15.0(w/v)％以下的濃度范圍含有該水溶性高分子化合物。這里，單位(w/v)％是指，所使用的“水溶性的高分子化合物”的重量(w(公克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

(其他成分1)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”可以視需要而含有選自羧基乙烯聚合物、羥丙基甲基纖維素、丙二醇、以及聚乙二醇(macrogol)中的至少一種化合物來(lái)作為“干燥抑制成分”。干燥抑制成分可防止作為透明化處理對(duì)象的生物材料發(fā)生干燥。特別是當(dāng)從透明化處理完時(shí)到提供給光學(xué)顯微鏡做觀察時(shí)為止的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)，或當(dāng)提供給光學(xué)顯微鏡做長(zhǎng)時(shí)間觀察時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的試劑含有所述干燥抑制成分。另外，上述甘油也具有干燥抑制作用。

使用上述“干燥抑制成分”時(shí)，其含量并無(wú)特別限定，優(yōu)選以超過(guò)0(w/v)％且10.0(w/v)％以下的濃度范圍含有干燥抑制成分，更優(yōu)選以1.0(w/v)％以上且7.0(w/v)％以下的濃度范圍含有干燥抑制成分，尤其優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且5.0(w/v)％以下的濃度范圍含有干燥抑制成分。這里，單位(w/v)％是指，所用的“干燥抑制成分”的重量(w(公克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

(其他成分2)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”還可視需要而進(jìn)一步含有從除山梨糖醇以外的糖及糖醇中選擇的化合物來(lái)作為“透明度提升成分”。關(guān)于從除山梨糖醇以外的糖及糖醇中選擇的化合物，可舉出赤蘚醇、果糖、甘油、甘露醇、蔗糖及木糖醇，但并不限定于此。如果單獨(dú)使用透明度提升成分來(lái)代替本發(fā)明生物材料用透明化試劑中的作為必需有效成分的山梨糖醇，則透明化處理的性能會(huì)變差。但通過(guò)將透明度提升成分和尿素或尿素衍生物及山梨糖醇一同使用，則與不使用“透明度提升成分”的情況相比，可有助于進(jìn)一步提升作為透明化處理對(duì)象的生物材料的透明度。

使用上述“透明度提升成分”時(shí)，其含量并無(wú)特別限定，優(yōu)選以超過(guò)0(w/v)％且50.0(w/v)％以下的濃度范圍含有透明度提升成分，更優(yōu)選以10.0(w/v)％以上且45.0(w/v)％以下的濃度范圍含有透明度提升成分，尤其優(yōu)選以20.0(w/v)％以上且40.0(w/v)％以下的濃度范圍含有透明度提升成分。這里，單位(w/v)％是指，所用的“透明度提升成分”的重量(w(公克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

另外，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”除了含有上述的“尿素及/或尿素衍生物”、“表面活性劑”及“水溶性的高分子化合物”以外，還可視需要而含有諸如ph調(diào)整劑、及滲透壓調(diào)整劑等的添加劑。

另外，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”還可視需要而進(jìn)一步含有環(huán)糊精類(lèi)、及/或、n-乙?；?l-羥基脯氨酸等這類(lèi)與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物。環(huán)糊精類(lèi)是具有由多個(gè)葡萄糖環(huán)狀鍵合而成的環(huán)糊精骨架的化合物的總稱(chēng)，更具體而言，例如可舉出α-環(huán)糊精及其衍生物、β-環(huán)糊精及其衍生物(例如甲基-β-環(huán)糊精等)、以及γ-環(huán)糊精及其衍生物，等等。生物材料用透明化試劑中的環(huán)糊精類(lèi)含量并無(wú)特別限定，例如優(yōu)選以1mm以上且5mm以下的濃度范圍含有環(huán)糊精。另外，生物材料用透明化試劑中，上述與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物的含量并無(wú)特別限定，優(yōu)選以1mm以上且3mm以下的濃度范圍含有該化合物。通過(guò)進(jìn)而含有環(huán)糊精類(lèi)、及/或、與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物，試劑向生物材料的滲透性可大幅提高。

(溶劑)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”是含有能溶解尿素的溶劑的溶液。關(guān)于溶劑的種類(lèi)，只要能溶解尿素，則無(wú)特別限定，優(yōu)選將水用作主溶劑，尤其優(yōu)選僅將水用作溶劑。這里，本發(fā)明中所謂“將水用作主溶劑”是指：水在所用的全部溶劑中所占的體積比率相比于其他溶劑而言為最多，即，水的用量?jī)?yōu)選超過(guò)所用的全部溶劑的合計(jì)體積的50％且100％以下。另外，將水用作主溶劑而制得的“生物材料用透明化試劑”在此稱(chēng)為水溶液型的“生物材料用透明化試劑”。

另外，若將水用作主溶劑，則對(duì)于經(jīng)固定的標(biāo)本，例如可以將二甲基亞砜(dmso)與水混合使用。對(duì)經(jīng)固定的標(biāo)本來(lái)例如混合使用dmso，則在效果上可期待提高試劑向生物材料的滲透性以及促進(jìn)具有角質(zhì)表面的組織的透明化處理等。這里，二甲基亞砜的用量并無(wú)特別限定，在設(shè)溶劑全體為100體積％時(shí)，二甲基亞砜的比率范圍優(yōu)選為0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下，更優(yōu)選為1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下，尤其優(yōu)選為1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下。

將水用作溶劑時(shí)的主要優(yōu)點(diǎn)如下。1)由于本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”中的作為有效成分的尿素及山梨糖醇相對(duì)于水的溶解性?xún)?yōu)異，因此可容易地制備生物材料用透明化試劑并可降低成本。2)與將有機(jī)溶劑用作主溶劑的方案相比，作為處理對(duì)象的生物材料不會(huì)在透明化處理中發(fā)生脫水，因此能抑制生物材料收縮的問(wèn)題。3)與將有機(jī)溶劑用作主溶劑的方案相比，可顯著降低熒光蛋白質(zhì)的損傷可能性，因此能利用熒光蛋白質(zhì)來(lái)觀察經(jīng)過(guò)了透明化處理的生物材料。4)并不局限于經(jīng)固定的材料，因此能適用于原始材料的透明化處理。5)能如后述那樣實(shí)現(xiàn)透明化處理的可逆性，因此能視需要而將透明化處理后的生物體試樣恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。6)與將有機(jī)溶劑用作主溶劑的方案相比，操作安全性更高。

另外，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”也可以是：ph能維持在對(duì)作為透明化處理對(duì)象的生物材料而言較佳的值的緩沖液?！吧锊牧嫌猛该骰噭钡膒h值并無(wú)特別限定，優(yōu)選處于6.0～9.0的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于6.5～8.5的范圍內(nèi)，進(jìn)而優(yōu)選處于6.8～8.0的范圍內(nèi)。本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的滲透壓也可以經(jīng)過(guò)調(diào)整，以進(jìn)一步抑制作為透明化處理對(duì)象的生物材料的變形并使尿素能充分向生物材料內(nèi)滲透。

另外，對(duì)于尿素衍生物也能采用與尿素的上述方案同樣的溶劑。

(作為處理對(duì)象的生物材料)

在用本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”來(lái)進(jìn)行的透明化處理中，作為處理對(duì)象的生物材料的種類(lèi)并無(wú)特別限定，優(yōu)選是來(lái)自植物的材料或來(lái)自動(dòng)物的材料，更優(yōu)選是來(lái)自魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬蟲(chóng)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳類(lèi)(哺乳動(dòng)物)等動(dòng)物的材料，特別優(yōu)選是來(lái)自哺乳動(dòng)物的材料。另外，哺乳動(dòng)物的種類(lèi)并無(wú)特別限定，可列舉：小鼠、大鼠、兔、土撥鼠、狨等、除人類(lèi)以外的靈長(zhǎng)類(lèi)，等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；狗、貓、白鼬等玩賞動(dòng)物(寵物)；豬、牛、馬等家畜；人類(lèi)。

另外，生物材料可以是生物個(gè)體本身(活著的人類(lèi)個(gè)體除外)，也可以是從多細(xì)胞生物個(gè)體獲取的器官、組織或細(xì)胞。由于本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”具有優(yōu)異的透明化處理能力，因此即使生物材料是來(lái)自多細(xì)胞動(dòng)物的組織或器官(例如全腦或其一部分)、或除人類(lèi)以外的多細(xì)胞動(dòng)物個(gè)體(例如胚胎等)本身，透明化處理也能適用于其。由于本發(fā)明的“生物材料透明化試劑”對(duì)生物材料變形的抑制效果極大，所以特別適于脆弱生物材料的透明化。在此，所謂脆弱生物材料，可舉出將植物細(xì)胞胚芽、胼胝體、初期形成階段的動(dòng)物胚體、干細(xì)胞、初代培養(yǎng)細(xì)胞、株化細(xì)胞在特殊培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行三維培育而獲得的塊狀物(球狀體(spheroid)、神經(jīng)球(neurosphere)、細(xì)胞團(tuán)塊(cellaggregates)等)等。

另外，上述的生物材料既可以是供進(jìn)行顯微鏡觀察的經(jīng)固定(fixed)處理了的材料，也可以是未經(jīng)固定的材料。這里，若使用經(jīng)固定了的材料，則優(yōu)選在固定處理后進(jìn)行在例如pbs溶液、或20(v/w)％蔗糖-pbs溶液中充分(例如24小時(shí)以上)浸漬的處理。進(jìn)而優(yōu)選進(jìn)行如下處理：將該材料包埋于oct包埋劑中并用液氮冷凍，之后在pbs中解凍，接著用4(v/w)％pfa(多聚甲醛)-pbs液再次固定。

上述生物材料具體例如可以是被注入了熒光性化學(xué)物質(zhì)的生物體組織、經(jīng)熒光性化學(xué)物質(zhì)染色了的生物體組織、被植入有表達(dá)了熒光蛋白質(zhì)的細(xì)胞的生物體組織、或表達(dá)了熒光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生體組織等。

(生物材料用透明化試劑的尤其佳選的組分例)

以下是本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的尤其佳選的組分例。

·生物材料用透明化試劑(1)：

在水中加入1.5m以上且8.0m以下的濃度范圍的尿素、以及15(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇而成的水溶液；若進(jìn)而含甘油，則優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且35.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以3.0(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，進(jìn)而優(yōu)選以5.0(w/v)％以上且15.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

·生物材料用透明化試劑(2)：

在水中加入3m以上且8m以下的濃度范圍的尿素、15(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇、以及甘油及/或二甲基亞砜而成的水溶液；優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且35.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以3.0(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，進(jìn)而優(yōu)選以5.0(w/v)％以上且15.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

·生物材料用透明化試劑(3)：

在水中加入2m以上且4m以下的濃度范圍的尿素、以及15(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇而成的水溶液；若進(jìn)而含甘油，則優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且35.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以3.0(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，進(jìn)而優(yōu)選以5.0(w/v)％以上且15.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

·生物材料用透明化試劑(4)：

在水中加入3m以上且5m以下的濃度范圍的尿素、30(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇、以及甘油及/或二甲基亞砜而成的水溶液；若含甘油，則優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且35.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以3.0(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，進(jìn)而優(yōu)選以5.0(w/v)％以上且15.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

·生物材料用透明化試劑(5)：

在水中加入1.5m以上且4.0m以下的濃度范圍的尿素、40(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇、以及甘油及/或二甲基亞砜而成的水溶液；若含甘油，則優(yōu)選以20(w/v)％以上且35(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以22.5(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

·生物材料用透明化試劑(6)：

在水中加入5.0m以上且9.5m以下的濃度范圍的尿素、以及15(w/v)％以上且40(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇而成的水溶液；若含甘油，則優(yōu)選以20(w/v)％以上且35(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以22.5(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

·生物材料用透明化試劑(7)：

在水中加入3m以上且5m以下的濃度范圍的尿素、以及35(w/v)％以上且45(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇而成的水溶液；若含甘油，則優(yōu)選以20(w/v)％以上且35(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，更優(yōu)選以22.5(w/v)％以上且30.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油；若含二甲基亞砜，則在設(shè)溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的范圍內(nèi)，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的范圍內(nèi)。

上述的生物材料用透明化試劑(1)～(7)均優(yōu)選以0.025(w/v)％以上且5(w/v)％以下的濃度范圍、進(jìn)而0.05(w/v)％以上且0.5(w/v)％以下的濃度范圍、尤其0.05(w/v)％以上且0.2(w/v)％以下的濃度范圍含有tritonx-100等非離子性表面活性劑。

另外，上述的生物材料用透明化試劑(1)～(7)在需要含蔗糖等透明度提升成分的情況下，均均優(yōu)選以10.0(w/v)％以上且50.0(w/v)％以下的濃度范圍、進(jìn)而20.0(w/v)％以上且40.0(w/v)％以下的濃度范圍含有該透明度提升成分。

另外，上述的生物材料用透明化試劑(1)～(7)均可以進(jìn)而含有環(huán)糊精類(lèi)、及/或、n-乙?；?l-羥基脯氨酸等這類(lèi)與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物。關(guān)于環(huán)糊精，優(yōu)選以1mm以上且5mm以下的濃度范圍含環(huán)糊精。另外，關(guān)于上述與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物，優(yōu)選以1mm以上且3mm以下的濃度范圍含有該化合物。含有與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物、及/或環(huán)糊精類(lèi)的生物材料用透明化試劑尤其適合用來(lái)進(jìn)行含白質(zhì)的生物材料的透明化，其中更適合于脊髓的透明化。

這里，若是采用尿素衍生物(或尿素與尿素衍生物的混合物)來(lái)代替尿素，則使用濃度與上述尿素的情況相同的尿素衍生物等來(lái)制備生物材料用透明化試劑(1)～(7)即可。

(生物材料用透明化試劑的制備)

關(guān)于本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的制備方法，可以將“尿素及/或尿素衍生物”、“山梨糖醇”、以及視需要所用的“甘油”、“表面活性劑”、“水溶性的高分子化合物”、“干燥抑制成分”及“透明度提升成分”等溶解于溶劑中來(lái)進(jìn)行制備。在溶劑中進(jìn)行溶解或混合的手法并無(wú)特別限定。

〔2.使用生物材料用透明化試劑的透明化處理法的例子〕

(透明化處理步驟)

使用本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”來(lái)對(duì)生物材料進(jìn)行透明化處理的方法包含使“生物材料用透明化試劑”向上述“生物材料”浸潤(rùn)的步驟(透明化處理步驟)。更具體而言，是在透明化處理用容器內(nèi)使“生物材料用透明化試劑”向上述“生物材料”浸潤(rùn)。

上述透明化處理步驟中，將“生物材料用透明化試劑”和“生物材料”裝入透明化處理用容器內(nèi)的順序并無(wú)特別限定，優(yōu)選先裝入“生物材料用透明化試劑”，后裝入“生物材料”(即，將生物材料投入生物材料用透明化試劑中)。

上述透明化處理步驟的處理溫度并無(wú)特別限定，但優(yōu)選處于15℃以上且45℃以下的范圍內(nèi)。另外，透明化處理的合計(jì)處理時(shí)間并無(wú)特別限定，但優(yōu)選處于2小時(shí)以上且120小時(shí)以下的范圍內(nèi)。另外，進(jìn)行透明化處理時(shí)的壓力也無(wú)特別限定。

也能使用多種類(lèi)的本發(fā)明的生物材料透明化試劑來(lái)分階段地進(jìn)行透明化處理步驟。例如，1)若分n次(n為2以上的整數(shù))來(lái)進(jìn)行透明化處理步驟，則優(yōu)選每進(jìn)行一次處理，就使用山梨糖醇濃度更高的生物材料透明化試劑，這樣山梨糖醇可有效地向生物材料浸潤(rùn)。

或者，2)若分n次(n為3以上的整數(shù))來(lái)進(jìn)行透明化處理步驟，則可以至少在第1次和第n次時(shí)使用含甘油的生物材料透明化試劑，并且在第2次～第(n-1)次之間的階段使用不含甘油的生物材料透明化試劑至少1次。該方案中，對(duì)于第1次至第(n-1)次之間的階段，優(yōu)選每進(jìn)行一次處理，就使用山梨糖醇含量更多且尿素含量為前一次處理的尿素含量以下的生物材料透明化試劑，這樣，尿素引起的生物材料膨脹可逐漸緩和。但在第n次時(shí)，優(yōu)選使用含有3m以上且5m以下的濃度范圍的尿素、30(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇、以及甘油及/或二甲基亞砜的生物材料透明化試劑來(lái)進(jìn)行處理。

另外，3)若分n次(n為2以上的整數(shù))來(lái)進(jìn)行透明化處理步驟，則可以在第1次處理時(shí)用含有1.5m以上且4.0m以下的濃度范圍的尿素、40(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇、以及甘油及/或二甲基亞砜的生物材料透明化試劑來(lái)進(jìn)行處理，之后，用尿素濃度比第1次處理時(shí)的生物材料透明化試劑高且山梨糖醇濃度比第1次處理時(shí)的生物材料透明化試劑低的生物材料透明化試劑來(lái)進(jìn)行處理。該方案中，生物材料會(huì)在第1次處理中發(fā)生較強(qiáng)收縮，但在該處理之后因收縮效應(yīng)得到緩和而體積恢復(fù)時(shí)，第1次以后的生物材料透明化試劑可較容易地浸潤(rùn)。這里，若n為3以上，則優(yōu)選在第n次時(shí)，用含有3m以上且5m以下的濃度范圍的尿素、30(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍的山梨糖醇、以及甘油及/或二甲基亞砜的生物材料透明化試劑來(lái)進(jìn)行處理。

無(wú)論以上哪種方案，均可以在各透明化處理步驟之間增設(shè)用pbs進(jìn)行一次處理的步驟，這樣可以保持生物材料的原形，因此優(yōu)選。

容納有經(jīng)上述透明化處理步驟而完成了透明化處理的生物材料的處理容器可以保存在例如室溫或低溫環(huán)境下，直至該生物材料被用至觀察步驟(透明化試樣保存步驟)。

(預(yù)處理步驟)

為了順利進(jìn)行透明化處理，也可視需要而在透明化處理步驟前使用預(yù)處理液來(lái)對(duì)生物材料進(jìn)行預(yù)處理。作為預(yù)處理液，優(yōu)選采用含山梨糖醇進(jìn)而還含甘油及/或二甲基亞砜的、不含尿素及上述尿素衍生物的水溶液。例如優(yōu)選含有用以降低生物材料中膽甾醇量的成分、及/或、用以降低生物材料中膠原蛋白量的成分。關(guān)于預(yù)處理液的詳細(xì)組分，將在后述“〔3.生物材料用透明化處理試劑盒〕”欄目中說(shuō)明。

上述預(yù)處理步驟的處理溫度并無(wú)特別限定，但優(yōu)選處于15℃以上且45℃以下的范圍內(nèi)。另外，預(yù)處理的合計(jì)處理時(shí)間并無(wú)特別限定，但優(yōu)選處于1小時(shí)以上且120小時(shí)以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選處于2小時(shí)以上且48小時(shí)以下的范圍內(nèi)。另外，進(jìn)行預(yù)處理時(shí)壓力也無(wú)特別限定。

通過(guò)借助預(yù)處理步驟來(lái)降低生物材料中的膽甾醇量及/或膠原蛋白量，可大幅提高生物材料用透明化試劑在透明化處理步驟中的滲透性。其結(jié)果是，可獲得如下效果：即使是例如未經(jīng)過(guò)液氮等下的冷凍處理和室溫下的解凍處理的生物材料等，生物材料用透明化試劑也能快速向其滲透。

(經(jīng)透明化處理后的生物材料的觀察步驟)

經(jīng)透明化處理后的生物材料將繼而被提供給例如用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行的觀察步驟。對(duì)于被提供至觀察步驟的生物材料，可視需要而在上述透明化處理步驟之前，或在透明化處理步驟之后但尚未進(jìn)行觀察步驟之前，施以染色或作標(biāo)記等可視化處理步驟。

例如，可視化處理步驟中若使用熒光蛋白質(zhì)，則可以在透明化處理步驟前向有活性的生物材料導(dǎo)入熒光蛋白質(zhì)基因，以使其表達(dá)熒光蛋白質(zhì)。

另外，若要在可視化處理步驟中將熒光性化學(xué)物質(zhì)(熒光蛋白質(zhì)除外)注入生物材料或使用熒光性化學(xué)物質(zhì)來(lái)將生物材料染色，則可視化處理步驟優(yōu)選在上述透明化處理步驟前進(jìn)行，但也可在上述透明化處理步驟后進(jìn)行。此外，作為可視化處理步驟，也能使用除熒光性化學(xué)物質(zhì)以外的化學(xué)物質(zhì)來(lái)進(jìn)行染色。

觀察步驟能夠使用任何種類(lèi)的光學(xué)顯微鏡來(lái)進(jìn)行。例如能夠運(yùn)用三維超分辨顯微鏡技術(shù)(例如sted、3dpalm、fpalm、3dstorm、及sim)來(lái)實(shí)施觀察步驟。另外，也能夠運(yùn)用多光子激發(fā)型(通常為雙光子激發(fā)型)光學(xué)顯微鏡技術(shù)來(lái)進(jìn)行觀察步驟。不過(guò)，由于透明化處理中出現(xiàn)的生物材料膨脹能得到抑制，因此單光子激發(fā)型的光學(xué)顯微鏡技術(shù)就足能用來(lái)觀察。

這里，在本發(fā)明中的透明化(處理)以如下事項(xiàng)為一指標(biāo)：在對(duì)處理前的生物材料和處理后的生物材料進(jìn)行比較時(shí)，處理后的生物材料的光(尤其可視光)透射性有所提高。

〔2a.其他運(yùn)用〕

(生物材料用透明化試劑成分的去除步驟)

用本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”來(lái)進(jìn)行的透明化處理是可逆的。因此，對(duì)于經(jīng)透明化處理后的生物材料，例如可以將其浸漬到平衡鹽類(lèi)溶液中來(lái)去除生物材料透明化試劑的成分，使該生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。在此，所謂平衡鹽類(lèi)溶液，具體例如可舉出：pbs、hbss等這些通過(guò)磷酸鹽而成為緩沖液的平衡鹽類(lèi)溶液；通過(guò)三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽而成為緩沖液的平衡鹽類(lèi)溶液(tbs)；人造腦脊液(acsf)；mem、dmem、及ham′sf-12等用于培養(yǎng)細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，等等。

在使用了上述“生物材料用透明化試劑”的情況下，不會(huì)在透明化處理的前后時(shí)，或在將透明化處理后的狀態(tài)恢復(fù)至透明化處理前的狀態(tài)時(shí)引起生物材料中蛋白質(zhì)等的變質(zhì)等。因此，生物材料中所含的蛋白質(zhì)等的抗原性也能保持不變。因此，例如還能夠在對(duì)生物材料進(jìn)行透明化處理并用光學(xué)顯微鏡觀察完之后，將該生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)，然后運(yùn)用通用的組織染色手法或免疫染色手法來(lái)進(jìn)行詳細(xì)分析等。

即，從另一觀點(diǎn)看，本發(fā)明是包含如下步驟的生物材料復(fù)原方法：使平衡鹽類(lèi)溶液浸潤(rùn)至用上述“生物材料用透明化試劑”施以透明化處理而得以了透明化的生物材料，從而將上述生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。

(提供至觀察步驟的生物材料的可視化處理步驟例)

這里，若是采用免疫染色手法來(lái)對(duì)正在用本發(fā)明的生物材料用透明化試劑實(shí)施透明化處理的生物材料、或完成了透明化處理的生物材料進(jìn)行可視化處理，則優(yōu)選采用例如國(guó)際公布wo2014/010633a1中記載的抗體組合物及免疫方法，但并不限定于此。國(guó)際公布wo2014/010633a1的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)參照而成為本說(shuō)明書(shū)的一部分。

這里，如國(guó)際公布wo2014/010633a1中所記載的，上述抗體組合物是含有抗體和選自尿素及尿素衍生物中的至少1種化合物的溶液，且該溶液以0.1m以上且低于1.0m的濃度范圍含有該化合物?？贵w組合物中優(yōu)選以0.2m以上且0.5m以下的濃度范圍含有上述化合物。另外，抗體組合物優(yōu)選含表面活性劑，更優(yōu)選含非離子性的表面活性劑。含表面活性劑時(shí)，優(yōu)選以0.025(w/v)％以上且0.2(w/v)％以下的濃度范圍含有表面活性劑。

以下披露使用國(guó)際公布wo2014/010633a1中記載的抗體組合物來(lái)進(jìn)行的免疫染色及觀察方法的一例概略流程。其中，以下的各步驟均能在與公知的免疫染色方法同樣的條件下實(shí)施。

步驟1)：其是免疫染色用試樣(生物材料)的制備步驟。

步驟2)：其是視需要而采用的、針對(duì)步驟1)中制備的免疫染色用試樣的抗原性活化處理步驟。例如可通過(guò)進(jìn)行加熱處理或蛋白質(zhì)分解處理等來(lái)實(shí)施該步驟。

步驟3)：其是視需要而采用的、抑制背景干擾(backgroundnoise)的處理步驟。例如可通過(guò)進(jìn)行防止混入不要的rna的rna分解處理、或使用血清及脫脂乳等封閉處理試劑的封閉處理來(lái)實(shí)施該步驟。

步驟4)：其是使用經(jīng)過(guò)了上述步驟1)～3)的免疫染色用試樣、和含有免疫染色用1次抗體的抗體組合物來(lái)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)處理步驟。這里，抗原抗體反應(yīng)處理步驟的孵育條件可根據(jù)抗體性能及試樣大小等來(lái)決定，例如可處理6小時(shí)～5天，優(yōu)選在振蕩下處理2天～3天。另外，孵育溫度優(yōu)選例如為4℃左右?？贵w組合物中的上述1次抗體的濃度具體例如可以處于4μg/ml以上且40μg/ml以下的濃度范圍。

步驟5)：其是對(duì)經(jīng)過(guò)了上述步驟4)的免疫染色用試樣進(jìn)行清洗的清洗步驟。清洗步驟中，例如可以使用以0.1m以上且低于1m的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物(衍生物的定義在本說(shuō)明書(shū)中共通)中的至少1種化合物的溶液，來(lái)洗脫試樣。該溶液的用量并無(wú)特別限定，例如約為9～15ml/0.3g試樣，優(yōu)選約為12ml/0.3g試樣。清洗步驟的溫度及時(shí)間并無(wú)特別限定，但優(yōu)選在室溫下振蕩洗脫約1小時(shí)。

步驟6)：其是視需要而采用的、使用含有免疫染色用2次以上抗體的抗體組合物、和經(jīng)過(guò)了上述步驟5)的免疫染色用試樣來(lái)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)處理步驟。這里，抗原抗體反應(yīng)處理步驟的孵育條件可根據(jù)抗體性能及試樣大小等來(lái)決定，例如可處理6小時(shí)～5天，優(yōu)選在振蕩下處理2天～3天。另外，孵育溫度優(yōu)選例如為4℃左右?？贵w組合物中的上述2次以上抗體的濃度具體例如可以處于1μg/ml以上且10μg/ml以下的濃度范圍。

步驟7)：其是對(duì)經(jīng)過(guò)了上述步驟6)的免疫染色用試樣進(jìn)行清洗的清洗步驟。具體操作可以與上述步驟5)同樣。

步驟8)：其是視需要而采用的、使經(jīng)過(guò)了上述步驟1)～7)的免疫染色用試樣中的抗原抗體反應(yīng)結(jié)果變得可視的步驟。例如，若上述1次抗體或2次以上抗體已被堿性磷酸酶等酶所標(biāo)記，則可以使試樣在該酶的底物中進(jìn)行反應(yīng)并使生成的色素定著，由此實(shí)現(xiàn)可視化。另外，若上述1次抗體或2次以上抗體已被熒光素及若丹明(rhodamine)等熒光色素所標(biāo)記，則可以在后述步驟9)中直接利用熒光顯微鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)可視化并加以觀察。

步驟9)：其是用光學(xué)顯微鏡對(duì)經(jīng)上述步驟1)～8)而被免疫染色后的免疫染色用試樣進(jìn)行觀察的觀察步驟。

上述概略流程中，若進(jìn)行步驟4)但不進(jìn)行步驟6)，則步驟4)中所用的抗體組合物為國(guó)際公布wo2014/010633a1中記載的抗體組合物。若既進(jìn)行步驟4)又進(jìn)行步驟6)，則步驟4)及6)的至少一方步驟中所用的抗體組合物為國(guó)際公布wo2014/010633a1中記載的抗體組合物，優(yōu)選該兩方步驟中所用的抗體組合物均為國(guó)際公布wo2014/010633a1中記載的抗體組合物。

〔3.生物材料用透明化處理試劑盒〕

(生物材料用透明化處理試劑盒)

本發(fā)明的“生物材料用透明化處理試劑盒”具備上述各種“生物材料用透明化試劑”當(dāng)中的至少1種。生物材料用透明化處理試劑盒也可以具備上述各種生物材料用透明化試劑當(dāng)中的多種。例如在具備多種生物材料用透明化試劑的情況下，試劑所含的成分及/或該成分的含量可以彼此不同。例如可舉出滿(mǎn)足以下條件1)～7)中至少1種條件的透明化試劑組合方案，其中典型的有滿(mǎn)足以下條件1)的透明化試劑組合方案。

1)山梨糖醇的含量彼此不同；

2)含或不含甘油，且若含甘油則甘油含量彼此不同；

3)尿素或尿素衍生物的含量彼此不同；

4)含或不含表面活性劑，且若含表面活性劑則表面活性劑含量彼此不同；

5)含或不含二甲基亞砜(dmso)，且若含二甲基亞砜則二甲基亞砜含量彼此不同；

6)含或不含環(huán)糊精類(lèi)，且若含環(huán)糊精類(lèi)則環(huán)糊精類(lèi)的含量彼此不同；

7)含或不含n-乙酰基-l-羥基脯氨酸等這類(lèi)與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物，且若含該化合物則該化合物的含量彼此不同。

“生物材料用透明化處理試劑盒”優(yōu)選含有選自以下生物材料透明化試劑a)和b)中的1種以上生物材料透明化試劑：a)以3m以上且5m以下的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物并以30(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇的生物材料透明化試劑；b)以5m以上且9.5m以下的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物并以20(w/v)％以上且40(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇的生物材料透明化試劑?！吧锊牧嫌猛该骰幚碓噭┖小备鼉?yōu)選含有選自以下生物材料透明化試劑a1)和b)中的1種以上生物材料透明化試劑：a1)以3m以上且5m以下的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物并以35(w/v)％以上且45(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇的生物材料透明化試劑；b)以5m以上且9.5m以下的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物并以20(w/v)％以上且40(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇的生物材料透明化試劑。

“生物材料用透明化處理試劑盒”也可以進(jìn)而具備以下中的至少一方：上述透明化處理步驟中所用的“處理容器”、“生物材料夾持器具(鑷子等)”、將透明化處理后的生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)的“平衡鹽類(lèi)溶液”、“預(yù)處理液”、生物材料的可視化處理步驟中所用的“免疫染色用抗體”、生物材料的可視化處理步驟中所用的“熒光性化學(xué)物質(zhì)”、以及“試劑盒操作說(shuō)明書(shū)”。其中，試劑盒操作說(shuō)明書(shū)中例如可以記載有上述“〔2.使用生物材料用透明化試劑的透明化處理法的例子〕”欄目中所披露的透明化處理方法的流程等。

上述預(yù)處理液是為了順利進(jìn)行透明化處理而在透明化處理前對(duì)生物材料進(jìn)行處理的液體。作為預(yù)處理液，優(yōu)選采用含山梨糖醇進(jìn)而還含甘油及/或二甲基亞砜的、不含尿素的水溶液。例如，預(yù)處理液更優(yōu)選含有用以降低生物材料中膽甾醇量的成分、及/或、用以降低生物材料中膠原蛋白量的成分。作為降低膽甾醇量的成分，例如可舉出環(huán)糊精類(lèi)，更具體而言，例如可舉出α-環(huán)糊精及其衍生物、β-環(huán)糊精及其衍生物(例如甲基-β-環(huán)糊精等)、以及γ-環(huán)糊精及其衍生物，等等。預(yù)處理液中的環(huán)糊精類(lèi)的含量并無(wú)特別限定，優(yōu)選以1mm以上且5mm以下的濃度范圍含有環(huán)糊精類(lèi)。另外，作為降低膠原蛋白量的成分，例如可舉出選自n-乙?；?l-羥基脯氨酸等的至少1種化合物。優(yōu)選以1mm以上且3mm以下的濃度范圍含有上述與膠原蛋白具有結(jié)合性的化合物。

在預(yù)處理液中，除了可含有用以降低生物材料中膽甾醇量的成分、及/或、用以降低生物材料中膠原蛋白量的成分以外，還可以視需要，按照與生物材料用透明化試劑同樣的含量來(lái)含有本發(fā)明的生物材料用透明化試劑中所含的各種成分。其中，預(yù)處理液中優(yōu)選含有山梨糖醇，更優(yōu)選以15(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇，進(jìn)而優(yōu)選以15(w/v)％以上且25(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇，進(jìn)而優(yōu)選以17(w/v)％以上且23(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇。甘油也是優(yōu)選包含在預(yù)處理液中的成分，優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且35.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，進(jìn)而優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且15.0(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油，尤其優(yōu)選以2.5(w/v)％以上且7.5(w/v)％以下的濃度范圍含有甘油。若含二甲基亞砜，則在設(shè)預(yù)處理液中的溶劑全體為100體積％的情況下，二甲基亞砜的含量?jī)?yōu)選處于0.5(v/v)％以上且35.0(v/v)％以下的濃度范圍，更優(yōu)選處于1.0(v/v)％以上且27.5(v/v)％以下的濃度范圍，尤其優(yōu)選處于1.5(v/v)％以上且25.0(v/v)％以下的濃度范圍。這里，關(guān)于預(yù)處理液的溶劑，優(yōu)選與本發(fā)明的生物材料用透明化試劑同樣地將水用作主溶劑。

〔4.生物材料用透明化處理試劑盒〕

(生物材料透明化處理體系)

本發(fā)明的生物材料透明化處理體系包含本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”和經(jīng)單離了的上述“生物材料”，其中，“生物材料用透明化試劑”浸潤(rùn)到了該“生物材料”的內(nèi)部，以使該“生物材料”透明化。即，該處理體系在概念上例如包括：含有處于透明化處理途中階段的生物材料的處理體系、或含有完成了透明化處理的生物材料的處理體系。

〔5.其他〕

本發(fā)明也包括例如以下任意方案。

(1)一種生物材料用透明化試劑，其是含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物、山梨糖醇、和濃度為5(w/v)％以下的表面活性劑的溶液。

(2)根據(jù)上述(1)所述的生物材料用透明化試劑，其是含有尿素來(lái)作為上述化合物的溶液。

(3)根據(jù)上述(1)或(2)所述的生物材料用透明化試劑，其以15(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇。

(4)根據(jù)上述(1)至(3)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑，其以1.0m以上且9.5m以下的濃度范圍含有尿素。

(5)根據(jù)上述(4)所述的生物材料用透明化試劑，其中，表面活性劑為非離子性的表面活性劑。

(6)根據(jù)上述(5)所述的生物材料用透明化試劑，其中，上述非離子性的表面活性劑是選自tritonx(注冊(cè)商標(biāo))、tween(注冊(cè)商標(biāo))、及np-40(商品名)中的至少一者。

(7)根據(jù)上述(1)至(6)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑，其含有甘油。

(8)根據(jù)上述(1)至(7)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑，其含有環(huán)糊精類(lèi)。

(9)根據(jù)上述(1)至(8)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑，其使來(lái)自多細(xì)胞動(dòng)物的組織或器官、或除人類(lèi)以外的多細(xì)胞動(dòng)物透明化。

(10)一種生物材料透明化處理體系，其包含上述(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑、以及經(jīng)單離了的生物材料，其中，生物材料用透明化試劑浸潤(rùn)到生物材料的內(nèi)部，以使該生物材料透明化。

(11)一種生物材料的透明化方法，其包含使上述(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑浸潤(rùn)到經(jīng)單離了的生物材料內(nèi)來(lái)使該生物材料透明化的步驟。

(12)一種生物材料用透明化處理試劑盒，其含有上述(1)至(9)中任一項(xiàng)所述的生物材料用透明化試劑。

(13)根據(jù)上述(12)所述的生物材料用透明化處理試劑盒，其包含多種上述生物材料用透明化試劑，其中，多種上述生物材料用透明化試劑所含有的山梨糖醇的濃度彼此不同。

(14)根據(jù)上述(12)或(13)所述的生物材料用透明化處理試劑盒，其包含選自以下生物材料透明化試劑a)和b)中的1種以上生物材料透明化試劑：a)以3m以上且5m以下的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物并以30(w/v)％以上且50(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇的生物材料透明化試劑；b)以5m以上且9.5m以下的濃度范圍含有選自尿素及尿素衍生物的至少1種化合物并以20(w/v)％以上且40(w/v)％以下的濃度范圍含有山梨糖醇的生物材料透明化試劑。

(15)根據(jù)上述(13)或(14)所述的生物材料用透明化處理試劑盒，其還包含作為透明化步驟預(yù)處理液的水溶液，該水溶液含有山梨糖醇，還含有甘油及/或二甲基亞砜，并且無(wú)尿素(不含尿素)。

〔實(shí)施例〕

以下，基于實(shí)施例及比較例等來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。

〔實(shí)驗(yàn)方法〕

<scales溶液>

為制備scales溶液，購(gòu)買(mǎi)了以下試劑：尿素結(jié)晶(和光純藥株式會(huì)社)、tritonx-100(和光純藥株式會(huì)社)、d(-)-山梨糖醇(和光純藥株式會(huì)社)、甲基-β-環(huán)糊精(東京化成株式會(huì)社)、γ-環(huán)糊精(和光純藥株式會(huì)社)、n-乙?；?l-羥基脯氨酸(協(xié)和發(fā)酵bio株式會(huì)社)、二甲基亞砜(dmso)(和光純藥株式會(huì)社)、甘油(sigma公司)、及tritonx-100(nacalaitesque株式會(huì)社)。將這些試劑分別溶解于水中或向其添加水(參見(jiàn)圖8)，并攪拌以使之充分混合(其中，scales4、scales4(0)、scalesq(0)及scalesq(5)的制備時(shí)，用微波爐進(jìn)行了加熱)。在制造scales0時(shí)，使用了磷酸鹽緩沖生理鹽水的庫(kù)存液(10×pbs(-))。用水對(duì)混合而得的該溶液進(jìn)行稀釋來(lái)調(diào)整了溶液中各成分的最終濃度。這里，scales4(0)是除了不含tritonx-100外，其他組分均與scales4相同的溶液。另外，實(shí)施例及比較例中，除特別指明以外，山梨糖醇的濃度單位均為(w/v)％，甘油的濃度單位均為(w/v)％，蔗糖的濃度單位均為(w/v)％，n-乙?；?l-羥基脯氨酸的濃度單位均為(w/v)％，dmso的濃度單位均為(v/v)％，tritonx-100的濃度單位均為(w/v)％。

<使用scales溶液進(jìn)行的透明化處理>

關(guān)于對(duì)小鼠腦半球進(jìn)行的透明化，目前其最佳規(guī)程如下。

首先，在含有20％的山梨糖醇、5％的甘油、1mm的甲基-β-環(huán)糊精、1mm的γ-環(huán)糊精、1％的n-乙?；?l-羥基脯氨酸、以及3％的dmso的scales0溶液中進(jìn)行了12小時(shí)的孵育，由此提升了樣本的透過(guò)性(第1步驟)。

接著，將經(jīng)過(guò)了上述第1步驟的樣本，依次在scales1、scales2及scales3中進(jìn)行了孵育(第2步驟)。

接著，用pbs，將經(jīng)過(guò)了第2步驟的樣本清洗6小時(shí)，由此用pbs進(jìn)行置換，從而將樣本恢復(fù)成了處理前的狀態(tài)(descale處理：第3步驟)。

接著，作為觀察前的步驟，將經(jīng)過(guò)了第3步驟的樣本在scales4中孵育了12小時(shí)。其中，scales4還用作了載片用介質(zhì)。

上述規(guī)程中，孵育溫度均為37℃，但僅pbs清洗時(shí)為4℃。孵育基本上是使用能控制溫度的軌道式振蕩機(jī)來(lái)進(jìn)行的(70～80rpm/分鐘)。

<用于abscale的抗體>

采用了以下抗體：從covance公司購(gòu)買(mǎi)的與alexafluor488共軛了的小鼠抗淀粉樣蛋白β單克隆抗體alexa488-6e10(sig-39347)；用二官能性熒光染料cy5(gehealthcare公司的pa25500)對(duì)小鼠抗neun單克隆抗體(a60)(millipore公司的mab377)進(jìn)行處理而得的cy5-a60；從millipore公司購(gòu)買(mǎi)的與cy3共軛了的兔抗neun多克隆抗體cy3-aneun(abn78c3；)；從和光純藥株式會(huì)社購(gòu)買(mǎi)的兔抗iba1多克隆抗體；以及從molecularprobes公司購(gòu)買(mǎi)的與alexafluor546共軛了的山羊抗兔igg多克隆抗體。將這些抗體以抗體濃度成為5μg/ml的方式混入抗體處理溶液(abscalesolution，參見(jiàn)圖1)，并提供至abscale處理所用。這里，抗體處理溶液是含以下組分的水溶液：0.33m的尿素、0.1％(w/v)的tritonx-100、以及×1倍的pbs。洗脫溶液(abscale洗脫溶液，參見(jiàn)圖10)是含以下組分的水溶液：2.5％的bsa、0.05％(wt/vol)的tween-20、以及×0.1倍的pbs。

<樣本的制備(小鼠)>

用戊巴比妥(商標(biāo)名somnopentyl)，將成體小鼠及老齡小鼠(8～80周大)充分麻醉，然后從小鼠心室灌注了4％pfa/pbs(-)。摘出小鼠的全腦，在4％pfa/pbs(一)中以4℃進(jìn)行了10小時(shí)或3天的后期固定。接著，對(duì)從全腦取得的腦半球和含海馬區(qū)的切片，用scales直接進(jìn)行了透明化(clear)或者在經(jīng)abscale處理或chemscale處理后進(jìn)行了透明化。動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)手法及飼養(yǎng)條件獲得了相應(yīng)實(shí)驗(yàn)機(jī)關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的認(rèn)可，并遵照認(rèn)可的內(nèi)容進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

<樣本的制備(人類(lèi))>

將美國(guó)費(fèi)城大學(xué)提供的阿爾茨海默病患者(60歲至80歲)的死后冷凍腦塊(從前額葉皮質(zhì)到顳葉的區(qū)域)解凍，并在4％pfa/pbs(-)中以4℃進(jìn)行了8小時(shí)的固定。從每個(gè)腦塊上分別切下邊長(zhǎng)3～4mm的正方體塊，對(duì)其用alexa488-6e10(稀釋率1∶200)、cy5-a60(稀釋率1∶200)、及兔抗iba1多克隆抗體(稀釋率1∶200)進(jìn)行了abscale處理。然后進(jìn)一步使該試樣與和alexafluor546共軛了的山羊抗兔igg多克隆抗體(稀釋率1∶500)進(jìn)行了反應(yīng)。

<圖像的分段(segmentaiton)>

通過(guò)spim系統(tǒng)(lightsheetz.1程序軟件及zen程序軟件；zeiss公司)獲取了經(jīng)abscale處理后的腦樣本的圖像數(shù)據(jù)，并將其以tiff格式保存。由于要大量提取作為目標(biāo)物的小神經(jīng)膠質(zhì)(alexa546-iba1的信號(hào))及淀粉樣蛋白β斑(alexa488-6e10的信號(hào))的圖像，因此創(chuàng)建了一種半自動(dòng)圖像分段法。該方法中，首先手動(dòng)地分配對(duì)象物，并手動(dòng)地將各細(xì)胞或斑完全掩蓋。這里，二進(jìn)制掩蓋數(shù)據(jù)是通過(guò)imagej程序軟件(64位，版本10.7)制作的。之后，按照otsu法，自動(dòng)對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行了分割。對(duì)于信號(hào)及背景等級(jí)的多階段變化而言，該方法尤其有助于選擇每個(gè)掩蓋區(qū)域的圖像分段最佳閾值。圖像分段的全部處理流程均是運(yùn)用以c++語(yǔ)言及opencvlibrary記述的常規(guī)程序來(lái)進(jìn)行的。最后，通過(guò)對(duì)該圖像運(yùn)用概算中值濾波處理(radius2.0)，得到了鮮明圖像。

<距離的測(cè)定>

用市售的程序軟件volocity版本6.3(perkinelmer公司)對(duì)上述二進(jìn)制掩蓋數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)組進(jìn)行處理，由此測(cè)定了從各小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的中心至最接近的淀粉樣蛋白β斑(其表面及其中心這兩方)的距離。運(yùn)用以c++語(yǔ)言記述的常規(guī)程序和市售的程序軟件(igorpro版本6.3.4.1)，計(jì)算了自淀粉樣蛋白β斑表面起50μm范圍內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)的數(shù)量，并將該小神經(jīng)膠質(zhì)的數(shù)量繪制成了坐標(biāo)圖。

<圖像的再分割(re-slice)>

為了根據(jù)純粹的三維數(shù)據(jù)組來(lái)得出各種二維的堆棧圖像群，本發(fā)明人研發(fā)了一種再分割執(zhí)行程序。該程序中，體系性地對(duì)全部的編號(hào)的xy像平面進(jìn)行統(tǒng)合，由此提供沿z方向得以堆?；木卟煌穸鹊膱D像群的序列。該程序還能夠用來(lái)對(duì)三維重建數(shù)據(jù)進(jìn)行再分割，從而作成沿x方向或y方向得以堆?；膱D像群。該程序是以c++語(yǔ)言記述的。

〔實(shí)驗(yàn)結(jié)果〕

(1)山梨糖醇與尿素的組合

本發(fā)明人首先從包括赤蘚醇、果糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖及木糖醇在內(nèi)的糖及糖醇類(lèi)中，篩選了在與尿素組合使用的情況下能使經(jīng)固定的腦樣本變透明的化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山梨糖醇與尿素的組合最能有效地使小鼠大腦皮質(zhì)變透明。

通過(guò)將尿素與山梨糖醇組合使用，能在維持樣本原體積不變的情況下實(shí)現(xiàn)透明化。雖尚未明確其原因，但推測(cè)原因之一在于：尿素及山梨糖醇均具有使組織變透明的能力，但其中尿素會(huì)引起水和效應(yīng)(組織的膨脹)，而山梨糖醇會(huì)引起縮水效應(yīng)(組織的縮小)的緣故。另外，為了期待引起組織的縮水，在山梨糖醇的基礎(chǔ)上還使用了甘油。山梨糖醇為親水性，而甘油為水酯兩親性，因此通過(guò)添加甘油來(lái)進(jìn)一步提高了腦內(nèi)親脂區(qū)域中的縮水效應(yīng)。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)山梨糖醇的添加對(duì)整體性能而言很重要，因此將含有山梨糖醇且以尿素為基本成分的透明化溶液命名為“scales”。為了組合使用含有山梨糖醇的溶液，本發(fā)明人嘗試設(shè)計(jì)了一種針對(duì)成體(高齡)哺乳類(lèi)大腦的scales操作規(guī)程。目前最佳的規(guī)程是，在以pbs為基本成分的多種溶液scales0～scales4中培養(yǎng)經(jīng)固定后的腦樣本(圖9的b)。圖8示出了全部scales溶液的制法。在達(dá)到平衡后，使用了scales4的樣本變得實(shí)質(zhì)透明(圖1的a)，且其體積值也為近乎原體積的100％(圖12的(a))。與用現(xiàn)有技術(shù)的生物材料用透明化試劑scalea2(hamaetal.，natneuroscience14(11)，1481-8(2011))進(jìn)行處理的情況相比，確認(rèn)到了顯著的生物材料原形維持効果(圖12的(a)、圖12的(b))。這里，使用scalea2的處理步驟概況見(jiàn)圖9的a。

(2)scales對(duì)信號(hào)及構(gòu)造的高維持能力

cubic法是近年提出的一種使用由尿素、戊醇及tritonx-100夠成的混合物的方法。該方法中需在含有15％的tritonx-100的試劑(cubic試劑1)中培養(yǎng)樣本約7天。由于tritonx-100的濃度較高，因此cubic法以透明化能力強(qiáng)為其特征，從而對(duì)樣本施以簡(jiǎn)單的處理后就能利用單光子激發(fā)顯微鏡、例如光片顯微鏡(lsfm)或選擇性平面照明顯微鏡(spim)來(lái)快速進(jìn)行全腦的成像。然而正因?yàn)槿绱耍琧ubic法無(wú)法保證信號(hào)及構(gòu)造的維持。

與此相對(duì)照地，本實(shí)施例的scales法在其全部流程中均將tritonx-100的濃度限制在低濃度(例如低于0.2％)(圖8)。如此降低tritonx-100的濃度，則能期待生物學(xué)上的構(gòu)造不受到有害影響。因此，scale技術(shù)能夠在從光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡這兩個(gè)等級(jí)上，實(shí)現(xiàn)在一舉完成3d圖像重建后的、突觸等特定微小構(gòu)造的可視化。該技術(shù)還能保證fp(熒光蛋白質(zhì))信號(hào)的恰當(dāng)維持。本發(fā)明人就scales的透明化能夠及維持能力進(jìn)行了試驗(yàn)。將yfp-h小鼠(20周大)的經(jīng)固定后的腦分割成2個(gè)半球，對(duì)于左腦半球用scales實(shí)施了透明化，而對(duì)于右腦半球用pbs實(shí)施了透明化。為了比較2個(gè)腦半球，利用透射性及yfp熒光進(jìn)行了成像(圖1的b)。用scales處理了的腦半球變得實(shí)質(zhì)透明，其顯現(xiàn)出比用pbs處理了的腦半球強(qiáng)的yfp熒光?？梢?jiàn)透明化顯然有利于對(duì)熒光的觀察。用chr2-yfp小鼠制備的腦半球也得出了相同的結(jié)果(圖1的c)。與此相對(duì)照地，用cubic處理了樣本顯現(xiàn)出比用pbs處理了的樣本弱的yfp熒光(圖13)。關(guān)于使用cubic時(shí)的熒光衰減，其原因正如用改組yfp進(jìn)行的消失實(shí)驗(yàn)結(jié)果那樣，是由于cubic試劑1導(dǎo)致了一部分yfp消失的緣故。cubic試劑1為強(qiáng)堿性(ph11.3)，因此在處理中會(huì)引起yfp的不可逆變質(zhì)。但需要注意的是，yfp的外漏有時(shí)也會(huì)引起熒光衰減。推測(cè)這是由于cubic試劑1中含有可能會(huì)導(dǎo)致yfp從樣本外漏的15％的tritonx-100的緣故。

本發(fā)明人曾通過(guò)復(fù)原性2d-ihc來(lái)呈示過(guò)scalea2處理的可逆性。就scales及cubic也試驗(yàn)了該可逆性(圖14)。在從經(jīng)scales處理了的樣本、及經(jīng)cubic處理了的樣本所獲得的薄切片中，map2及gfap等細(xì)胞基干蛋白質(zhì)獲得了充分免疫而得到了定位，但發(fā)現(xiàn)在經(jīng)scales處理了的樣本和經(jīng)cubic處理了的樣本間，突觸蛋白質(zhì)有實(shí)質(zhì)性差異。即，scales處理維持住了突觸前膜及突觸后膜蛋白質(zhì)的免疫染色、以及未成熟神經(jīng)細(xì)胞膜表面上存在的標(biāo)記分子的免疫染色，但cubic處理卻減弱了免疫染色的強(qiáng)度及/或特異性。

另外，用電子顯微鏡檢查、比較了突觸的超微小構(gòu)造。用4％pfa進(jìn)行了固定后的腦半球經(jīng)scales處理而變透明，接著用pbs來(lái)置換scales成分，以將scales成分從腦半球中去除(de-scaling)，由此恢復(fù)成了透明化處理前的狀態(tài)(復(fù)原)。之后，用恢復(fù)成透明化處理前狀態(tài)的樣本制備了1mm立方體，將其制備成供透射電子顯微鏡(tem)觀察的超薄切片。觀察中，看到了包括2層相接近的v錐狀神經(jīng)元細(xì)胞體在內(nèi)的較廣闊視野(圖1的d)。由于膜統(tǒng)合性得到了良好維持，因此成功觀察到了其中一方神經(jīng)元(左側(cè))中的細(xì)胞器官，諸如細(xì)胞核、乃至樹(shù)突(den)及軸丘(ah)這類(lèi)細(xì)胞表面突等。因此能檢查與神經(jīng)細(xì)胞器官具關(guān)聯(lián)性的超微小構(gòu)造。例如將軸突始段(ais)擴(kuò)大后，在細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了高電子密度區(qū)域(圖1的e)。進(jìn)一步擴(kuò)大后(圖1的f)發(fā)現(xiàn)了軸突終末(at)處的變形小泡的存在，該小泡區(qū)域表明這是對(duì)稱(chēng)性突觸。該位置及超微小構(gòu)造說(shuō)明了該突觸是抑制性突觸且是軸突間突觸。與此對(duì)照地，在at內(nèi)伴隨透明圓小泡的非對(duì)稱(chēng)性(可能為興奮性)突觸多被同定為神經(jīng)纖維區(qū)域(圖1的g、h)。用cubic樣本也同樣地制備了超薄切片。正如所預(yù)測(cè)的，由于cubic試劑1的高濃度(15％)tritonx-100，在tem圖像中觀察到超薄切片中不僅神經(jīng)細(xì)胞的原生質(zhì)膜被破壞，線(xiàn)粒體、樹(shù)突、髓鞘等各種微小構(gòu)造也被明顯破壞(圖15～圖16)。

(3)定量式三維(免疫)組織化學(xué)

本發(fā)明人曾針對(duì)使用以尿素為主成分的透明化處理試劑進(jìn)行了透明化處理的樣本，用pbs進(jìn)行置換來(lái)從樣本中去除(descaled)尿素成分，并由此發(fā)現(xiàn)了抗體等巨大分子會(huì)透過(guò)該樣本。為了利用這一特性，本發(fā)明人設(shè)計(jì)出了一種將數(shù)毫米厚的腦樣本內(nèi)的構(gòu)造完全免疫染色的、稱(chēng)為“abscale法”的方法(圖10)。

發(fā)明人對(duì)作為阿爾茨海默病(ad)模型體的高齡小鼠腦運(yùn)用了abscale。為了明示aβ斑的空間分布，使用了能與aβ中第1～16位氨基酸反應(yīng)的小鼠單克隆抗體(mab)6e10。該抗體在分子靶療法上有所運(yùn)用，例如提出了一種將6e10注射至體內(nèi)來(lái)使腦的aβ鈍化的方法。本實(shí)驗(yàn)中使用了市售的熒光6e10(alexa488-6e10)。但由于6e10會(huì)與幾種aβ前體、例如app及ctf-β發(fā)生反應(yīng)，因此可能會(huì)在神經(jīng)元內(nèi)觀測(cè)到alexa488-6e10的信號(hào)。對(duì)此，本發(fā)明人使用了能過(guò)剩產(chǎn)出aβ42的新穎的ad模型小鼠(app^nl-f)。為了觀測(cè)與神經(jīng)元細(xì)胞核相關(guān)聯(lián)的alexa488-6e10的信號(hào)位置，本發(fā)明人嘗試性地并用了將cy5與小鼠抗neunmab(a60)結(jié)合而得的抗體(a60-cy5)。

在abscale溶液中，使從20個(gè)月大的app^nl-f/nl/f小鼠獲得的經(jīng)固定了的腦半球(6×4×4mm)與alexa488-6e10及cy5-a60這兩方進(jìn)行了反應(yīng)(切斷前染色)。接著，用20％蔗糖溶液進(jìn)行了處理，然后包埋于oct包埋劑中，然后切取了厚50μm的冠狀面切片(圖2的a)。將含有海馬區(qū)的切片放到玻璃載片上，使其與兔抗neun多克隆抗體、以及和cy3結(jié)合了的山羊抗兔igg抗體進(jìn)行了反應(yīng)(切斷后染色)。之后，用立體顯微鏡觀察而得到了對(duì)應(yīng)于cy3(圖2的b)、cy5(圖2的c)、及alexa488(圖2的d)的3個(gè)熒光圖像(圖17的a；與圖2對(duì)應(yīng))。首先比較了cy3-αneun(切斷后染色)圖像和cy5-a60圖像，并評(píng)價(jià)了cy5-a60在腦半球全體中的擴(kuò)散性。無(wú)論從腦半球表面起的深度如何，cy5均表現(xiàn)出強(qiáng)信號(hào)，這與cy3信號(hào)完全吻合(圖2的e)。該結(jié)果意味著cy5-a60單克隆抗體可有效滲透進(jìn)腦半球內(nèi)，并表明了使用cy5-a60的abscale的合理性。接著，將cy5-a60圖像與切斷前染色的alexa488-6e10圖像進(jìn)行了比較(圖2的f)。alexa488所標(biāo)記的aβ斑的位置出現(xiàn)在缺少cy5所標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞核的區(qū)域(圖2的g、h)，這說(shuō)明aβ斑處于細(xì)胞之外。alexa488所標(biāo)記的aβ斑主要出現(xiàn)在皮質(zhì)，還較少地出現(xiàn)在丘腦(圖2的f)。通過(guò)對(duì)從20個(gè)月大app^nl-f/nl-f小鼠獲得的冠狀面切片進(jìn)行2d-ihc，觀察到了與上述同樣的aβ斑分布形態(tài)。因此可以得出alexa488的滲透力足能用來(lái)對(duì)4mm以下的腦樣本內(nèi)的所有aβ斑進(jìn)行熒光標(biāo)記的這一結(jié)論。

(4)使aβ淀粉樣蛋白可視化的chemscale及abscale

本發(fā)明人在創(chuàng)建其獨(dú)自的scale法的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在使用scalea2及/或scaleb4的透明化處理中或處理后，熒光物質(zhì)可較好地透過(guò)經(jīng)固定的腦樣本。在以往的研究中，本發(fā)明人成功地用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)對(duì)經(jīng)scalea2處理的腦塊進(jìn)行了核復(fù)染色。此稱(chēng)為“chemscale法”(圖11)的方法一般還能適用于較大的樣本。

本發(fā)明人為了進(jìn)行多色成像，將chemscale法與abscale法并用。本發(fā)明人使用了對(duì)由alexa488-6e10及aβ組成的集合體表現(xiàn)出強(qiáng)親和性且顏色能與alexa488-6e10的顏色相區(qū)別的苯并噻唑類(lèi)似物pp-bta-1，來(lái)嘗試監(jiān)測(cè)aβ斑(圖17的b；與圖3的a及圖3的b對(duì)應(yīng))。對(duì)從18個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠摘出的腦半球運(yùn)用了該并用手法。本發(fā)明人首先取得了分散在皮質(zhì)全體中的經(jīng)熒光標(biāo)記了的aβ斑的全體圖像(圖3的a)。與alexa488-6e10相比，pp-bta-1更強(qiáng)調(diào)地顯現(xiàn)了被稱(chēng)為腦淀粉樣蛋白癥的沉降在大腦血管上的淀粉樣蛋白。其后，本發(fā)明人著重觀察了每個(gè)aβ斑。在通過(guò)典型的熒光沉降而得到的詳細(xì)的3d重建圖像中，清楚地得到了過(guò)去曾被報(bào)告過(guò)的、反映出alexa488-6e10所染色了的aβ斑的圓形中空部。(圖3的a中的小插圖)。與此相對(duì)照地，pp-bta-1的強(qiáng)熒光出現(xiàn)在aβ斑的中央部。這些結(jié)果表明，使用alexa488-6e10及pp-bta-1來(lái)進(jìn)行的染色及成像的深度足能用來(lái)使分布于腦半球全體中的aβ淀粉樣蛋白可視化。接著，運(yùn)用相同手法對(duì)9個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠的腦半球進(jìn)行了染色及成像，但僅確認(rèn)到了稀散的標(biāo)記(圖3的b)。

作為chemscale法的副類(lèi)型，本發(fā)明人曾為了對(duì)血管構(gòu)造進(jìn)行3d圖像重建而使用紅熒光對(duì)小鼠的血管作標(biāo)記。這里運(yùn)用同一手法，從被麻醉了的app^nl-f/nl-f小鼠(20個(gè)月大)的心室灌注了用德克薩斯紅標(biāo)記了的血凝素。在后續(xù)的固定化完成后，用alexa488-6e10對(duì)左腦半球進(jìn)行了abscale處理，然后利用spim系統(tǒng)進(jìn)行了成像(圖17的c；與圖3的c對(duì)應(yīng))。根據(jù)大腦皮質(zhì)的立方柱狀區(qū)域的3d重建圖像，表明全部的aβ斑或直接與血管接觸，或位于血管附近(圖3的c)。

(5)高齡小鼠及人腦中的小神經(jīng)膠質(zhì)-aβ斑結(jié)合

在通過(guò)二維剖面的大量研究中表明，阿爾茨海默病(ad)的患者及模型中的位于aβ斑周?chē)男∩窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量會(huì)較多。但本發(fā)明人認(rèn)為，不顯眼的細(xì)胞群的成像、及遺傳特征的定量測(cè)定必需以三維空間方式來(lái)實(shí)施。

為了從全體上發(fā)現(xiàn)淀粉樣變病中伴隨何種小神經(jīng)膠質(zhì)活化性，本發(fā)明人對(duì)從20個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠獲得的2mm厚的大腦皮質(zhì)切片實(shí)施了雙色abscale法(圖4的a)。切片在與alexa488-6e10、用以對(duì)aβ斑和小神經(jīng)膠質(zhì)進(jìn)行免疫染色的兔抗iba1多克隆抗體、和用以對(duì)aβ斑和小神經(jīng)膠質(zhì)進(jìn)行免疫染色的與alexa546共軛了的抗兔igg抗體發(fā)生了反應(yīng)后，變得透明。通過(guò)2mm厚的切片，成功地用spim系統(tǒng)觀察到了包含軀體感覺(jué)皮質(zhì)和海馬ca1的區(qū)域(圖4的a的立方體)(圖17的d；與圖4對(duì)應(yīng))。不僅是6e-10陽(yáng)性斑，具通常的大小及形狀的iba1陽(yáng)性小神經(jīng)膠質(zhì)也變得清晰可視。這些的3d重建圖像延長(zhǎng)至所觀察到的區(qū)域內(nèi)，作成有2個(gè)透視圖(xy平面及xz平面；分別為圖4的b、c)。后者呈現(xiàn)了沿z軸的熒光分布，這說(shuō)明了抗體的滲透效率。即使是最深區(qū)域，也無(wú)信號(hào)衰減，因此可得出抗體從兩方表面均實(shí)現(xiàn)了良好滲透。接著，本發(fā)明人選定了含37個(gè)充分離散的aβ斑的皮質(zhì)區(qū)域(圖4的d)。其中，在aβ斑的附近(60μm以?xún)?nèi)近處)發(fā)現(xiàn)了120個(gè)小神經(jīng)膠質(zhì)。對(duì)圖像進(jìn)行分割后，確定了每個(gè)斑的大小和形狀、以及斑和小神經(jīng)膠質(zhì)這兩者的位置(重心)。本發(fā)明人運(yùn)用了自己設(shè)計(jì)的、自動(dòng)在三維空間上測(cè)定從各小神經(jīng)膠質(zhì)中心到最近的斑的邊緣為止的距離的算法(圖5的e)。休眠狀態(tài)的小神經(jīng)膠質(zhì)和活化了的小神經(jīng)膠質(zhì)分別呈樹(shù)狀和及阿米巴蟲(chóng)狀，由于它們的三維空間形狀特征易于體現(xiàn)，因此成功地判斷出了各類(lèi)別的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的休眠/活化狀態(tài)。小神經(jīng)膠質(zhì)離斑較近的這種狀況、以及活化了的小神經(jīng)膠質(zhì)的形態(tài)特征能夠成為判斷老人斑重癥度的信息。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了2個(gè)彼此靠近的具幾乎同等大小的斑(圖4的f)，但它們各自與小神經(jīng)膠質(zhì)的空間位置關(guān)系卻不同(圖4的g)。其中1個(gè)斑與9個(gè)小神經(jīng)膠質(zhì)直接地接觸或接近，這表明了急性神經(jīng)炎狀態(tài)(圖4的h、#2)。另1個(gè)斑不與任何小神經(jīng)膠質(zhì)接近，該斑周?chē)纳赃h(yuǎn)離的小神經(jīng)膠質(zhì)幾乎全部為休眠狀態(tài)(圖4的h、#1)，這表明該斑為陳舊性。在2個(gè)aβ斑的直方圖上，示出了從活性狀態(tài)及休眠狀態(tài)的小神經(jīng)膠質(zhì)至斑邊緣為止的距離的離散情況(圖4的h下方)。對(duì)于37個(gè)斑，均以相同方法分析了與該斑接近的120個(gè)小神經(jīng)膠質(zhì)(圖4的i)。無(wú)論是活化了的小神經(jīng)膠質(zhì)，還是休眠狀態(tài)的小神經(jīng)膠質(zhì)，其與斑之間的距離均較大，有102個(gè)小神經(jīng)膠質(zhì)位于遠(yuǎn)離斑邊緣(超過(guò)21μm的遠(yuǎn)處)的位置，僅18個(gè)細(xì)胞處于與斑非常接近的位置(21μm以?xún)?nèi)近處)。圖18的a示出了每個(gè)斑的直方圖。本發(fā)明人將不與任何活化了小神經(jīng)膠質(zhì)接近(21μm以?xún)?nèi)近處)的斑定義為“陳舊性斑”。37個(gè)斑中有25個(gè)斑(68％)為“陳舊性”。

對(duì)用10個(gè)月大的app^nl-f/nl-f小鼠所制備的切片進(jìn)行了同樣的分析。(圖4的j)。在斑較多的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了有107個(gè)小神經(jīng)膠質(zhì)處在27個(gè)斑的附近(圖4的k)。在27個(gè)斑的直方圖中，與最接近的斑之間的距離呈現(xiàn)出較廣的離散(圖4的1)。每個(gè)斑的直方圖均呈現(xiàn)出同樣情況(圖18的b)。有趣的是，根據(jù)上述定義，27個(gè)斑中僅2個(gè)(7.4％)斑被分類(lèi)為“隙舊性”。與20個(gè)月大的小鼠相比，該早期生長(zhǎng)階段小鼠的樣本中雖然只發(fā)現(xiàn)了極少的aβ斑，但有更高比率的斑表明了急性神經(jīng)炎狀態(tài)。

本發(fā)明人還針對(duì)阿爾茨海默病患者的腦解剖樣本，同樣地采用雙色abscale手法來(lái)就小神經(jīng)膠質(zhì)與斑的關(guān)系進(jìn)行了3d可視化。這里重要的是，為區(qū)別細(xì)胞外的aβ斑信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)的alexa488-6e10信號(hào)，追加使用了用來(lái)同定神經(jīng)元細(xì)胞核的cy5-a60。根據(jù)3d重建圖像，將9名患者的腦塊分成了2組。3個(gè)樣本中，存在擁有高密度核的斑(有芯斑)(圖19的左半側(cè)；有核斑(+))，而其他6個(gè)樣本中無(wú)該斑(圖19的右半側(cè)；有核斑(-))。舉例而言，在前一組的1個(gè)樣本(#1617)中清晰觀察到了11個(gè)具有核的斑，但未在該斑的致密區(qū)域觀察到iba1陽(yáng)性小神經(jīng)膠質(zhì)群(圖5的a)。進(jìn)一步通過(guò)透視圖進(jìn)行觀察，明顯發(fā)現(xiàn)具有核的斑幾乎都遠(yuǎn)離小神經(jīng)膠質(zhì)(圖5的b)，且?guī)缀醵疾慌c小神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)(圖5的c)。而與前一組相對(duì)照地，后一組樣本(#1523)中未發(fā)現(xiàn)具有明顯的核的斑，但在3d透視圖中觀察到了多量的小神經(jīng)膠質(zhì)群(圖5的d)。通過(guò)對(duì)一連的xy圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各小神經(jīng)膠質(zhì)群與“擴(kuò)散斑”接近。這種類(lèi)型的斑與其周?chē)募?xì)胞內(nèi)的aβ積累體相比顯得模糊不清，因此未能得出體光線(xiàn)透射(volumeraycasting)圖像數(shù)據(jù)(圖5的d)。為了發(fā)現(xiàn)有可能隱藏在這些xy圖間的構(gòu)造，使用了能沿z軸構(gòu)建包含2～12張xy圖像的完整合成圖像群的程序軟件(圖5的e)。擴(kuò)散斑清晰呈現(xiàn)在沿z軸合成出的圖像中(圖5的f、g)。之后，為了觀察擴(kuò)散斑是否與小神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)，利用了立方體狀區(qū)域(各為圖5的h及i)。在腦塊樣本(#1523)中，共26個(gè)擴(kuò)散斑得到了同定，判明了有22個(gè)擴(kuò)散斑與小神經(jīng)膠質(zhì)具有相互作用。這些小神經(jīng)膠質(zhì)與擴(kuò)散斑間的關(guān)聯(lián)性往往也在其他患者的樣本中被觀察到(圖19)。實(shí)際上，光學(xué)性圖像分割可有效地用于模糊圖像的分割的初次優(yōu)化。這種再次分割的手法中無(wú)機(jī)械性分割，因此能同定不同大小的構(gòu)造。有趣的是，在包含具有核的斑的樣本中，幾乎未觀察到擴(kuò)散斑(圖19的左半)，這支持了擴(kuò)散斑是具有核的斑的前體這一看法。

(6)scalesq：可適用于腦切片的快速性scale

高齡小鼠的全腦的快速透明化并不容易，然而本發(fā)明人注意到很多研究人員不太想用全腦而是使用腦切片。尤其是目前從事立體解析學(xué)的人員，其或許從透明腦切片(1～2mm)就能獲得充分的利益。這就出現(xiàn)了能否考慮使腦切片特異性地快速透明化的問(wèn)題。

在用以抵消抑制尿素水和作用的山梨糖醇的存在下所能夠提升的尿素濃度極限，也是另一個(gè)值得考慮的問(wèn)題。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有9.1m的尿素和22.5％的山梨糖醇的溶液具有使成體小鼠的數(shù)mm厚腦切片快速透明化的能力。值得注意的是，該溶液不含tritonx-100，故將其命名為“scalesq(0)”。8周大的yfp-h小鼠的1mm厚腦樣本在scalesq(0)中以37℃培養(yǎng)1～2小時(shí)后，明顯變得透明(圖6的a～c)。為了確認(rèn)該手法能否完全維持yfp熒光，本發(fā)明人對(duì)經(jīng)透明化的半球(圖6的d)和對(duì)照用半球(圖20)的yfp熒光進(jìn)行了比較。將經(jīng)透明化的半球在scales4(0)(圖8)中培養(yǎng)2小時(shí)后，將其提供至了spim系統(tǒng)下的快速3d成像實(shí)驗(yàn)。表達(dá)了局部皮質(zhì)(圖6的d中的白框)中yfp的神經(jīng)元(圖6的e)被在1分種內(nèi)完成了其3d重建圖像。因此可期待scalesq(0)溶液對(duì)超微小構(gòu)造的良好維持性。實(shí)際上，本發(fā)明人通過(guò)em觀察(圖6的f)來(lái)評(píng)價(jià)了復(fù)原后的樣本的膜整體性。

雖然通過(guò)scalesq(0)得到了明顯的透明性(圖6的a～c)，但通過(guò)spim成像，發(fā)現(xiàn)標(biāo)本切片內(nèi)部還存在非透明性部分。為了提高透明化后的切片的透明度，在scalesq(0)中以各種濃度添加了tritonx-100。本發(fā)明人將能充分維持fp熒光的tritonx-100濃度上限定為了5％。scalesq(5)(圖8)能夠在完全不引起yfp熒光損耗的情況下使1mm厚切片變透明(圖6的g～1)。透明化后的樣本雖然非常適合用來(lái)對(duì)表達(dá)了yfp的神經(jīng)元進(jìn)行spim成像(圖6的k)，但由于tritonx-100濃度的影響，超微小構(gòu)造的維持性為不理想狀態(tài)(圖6的i)。

(7)scaless：透明度提升性被進(jìn)而改良的scales

為了評(píng)價(jià)比scales4溶液更能提升透明化的透明度(透光性)的生物材料用透明化試劑(scaless)，制備了scaless20(組分為：4m尿素、40％山梨糖醇、20％蔗糖、20％dmso、0.2％tritonx-100)和scaless40(組分為：3.56m尿素、35.56％山梨糖醇、35.56％蔗糖、17.78％dmso、0.18％tritonx-100)。為了檢驗(yàn)使用scaless20及scaless40時(shí)的透明度提升性，用戊巴比妥(somnopenty)將作為透明化處理對(duì)象的17周大yfp-h小鼠充分麻醉，然后從小鼠心室灌注4％pfa/pbs(-)，之后摘出小鼠的全腦并在4％pfa/pbs(-)中以4℃進(jìn)行了3天的后期固定，由此準(zhǔn)備了樣本。對(duì)經(jīng)固定的全腦實(shí)施了“〔實(shí)驗(yàn)方法〕”欄中“<使用scales溶液進(jìn)行的透明化處理>”項(xiàng)目所披露的第1步驟～第3步驟的處理，然后，作為觀察前的步驟，將經(jīng)過(guò)了第3步驟后的樣本在scales4中孵育了189天。在189天孵育后的翌日，將全腦分割成右半球和左半球，將右半球在scaless20或scaless40中孵育了一天，由此實(shí)施了透明化處理。另一方面，為了進(jìn)行透明度的比較，再次將左半球在scales4中孵育了一天。

針對(duì)用scaless20、scaless40或scales4進(jìn)行了透明化處理的腦半球，比較了它們的透過(guò)性(圖中的“滲透性”)、yfp熒光信號(hào)強(qiáng)度(圖中的“熒光性”)及體積變動(dòng)(圖中的“膨脹(空間上)”)(圖21)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用scaless20或scaless40進(jìn)行處理，透過(guò)性和熒光信號(hào)強(qiáng)度得到了進(jìn)一步提高，而體積變動(dòng)情況與scales4同樣，未受到影響。

接著，為了評(píng)價(jià)經(jīng)scaless40處理后的全腦的透明度，用4％pfa固定了yfp-h小鼠(17周大)的全腦，并進(jìn)行了上述第1步驟～第3步驟的處理，然后，作為觀察前的步驟，將經(jīng)過(guò)了第3步驟后的樣本在scales4中孵育了59天，由此準(zhǔn)備了全腦樣本。觀察了從scales4中剛?cè)〕鰰r(shí)(空氣中)的全腦樣本和浸在scales4中時(shí)(液體中)的全腦樣本(見(jiàn)圖22上半部的s4d25)，之后進(jìn)而將樣本在scaless40中孵育2天，然后觀察了從scaless40取出時(shí)(空氣中)的樣本和浸在scaless40中時(shí)(液體中)的樣本。結(jié)果得知，通過(guò)用scaless40孵育2天，透過(guò)性得到了提高(圖22)。根據(jù)以上的結(jié)果，顯然可知scaless的組分使得透光性進(jìn)一步提高。

<比較例1>

使用在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元表達(dá)了熒光蛋白質(zhì)yfp的轉(zhuǎn)基因小鼠(yfp-hline，由美國(guó)哈佛大學(xué)joshuasanes教授提供；參考文獻(xiàn)：fengetal.neuron，28：41-51，2000)，通過(guò)灌注來(lái)將小鼠全身固定，并進(jìn)行了生物材料(大腦)的摘出及固定。固定方法如下：在室溫下，使用蠕動(dòng)泵或注射器從小鼠左心房灌注固定液(4(w/v)％多聚甲醛/pbs，ph7.5～8.0)來(lái)將動(dòng)物全身完全固定。接著，將全身完全固定了的該動(dòng)物的頭蓋骨去除，十分小心地摘出了作為生物材料的臟器(例如腦全體)。將摘出的臟器在4℃環(huán)境下浸漬于冰冷固定液(4(w/v)％多聚甲醛/pbs，ph7.5～8.0)中8小時(shí)～12小時(shí)。

這里，將摘出后的大腦分割成左半球和右半球并進(jìn)行了固定。

接著，將得到的2個(gè)大腦半球中的一個(gè)，在室溫下浸漬于具有以下組分的生物材料用透明化試劑中4天。另外，將另一大腦半球，在室溫下浸漬于具有以下組分的比較用試劑中4天。結(jié)果如圖7所示。這里，位于圖7中左側(cè)的大腦半球經(jīng)過(guò)了比較用試劑的處理，右側(cè)的大腦半球經(jīng)過(guò)了生物材料用透明化試劑的處理。比較用試劑未使大腦半球發(fā)生實(shí)質(zhì)性的透明化。

通過(guò)以上的比較，可知尿素與山梨糖醇的組合可提升透明化。

生物材料用透明化試劑的組分：

在水中添入40％(w/v)山梨糖醇、2m尿素、10％(w/v)甘油、及0.2％(w/v)tritonx-100而成的水溶液。

比較用試劑的組分：

在水中添入40％(w/v)赤蘚醇、2m尿素、10％(w/v)甘油、及0.2％(w/v)tritonx-100而成的水溶液。

本發(fā)明并不限于上述各實(shí)施方式及實(shí)施例，能在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變更，適當(dāng)?shù)亟M合不同實(shí)施方式中披露的技術(shù)手段而得到的實(shí)施方式也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。

〔產(chǎn)業(yè)上的可利用性〕

本發(fā)明能提供一種用以制備供光學(xué)觀察所用的生物材料的生物材料用透明化試劑、及其利用。