本發(fā)明涉及類風濕性關節(jié)炎的簡便且正確的疾病活動性評價方法和評價用試劑盒。

背景技術：

類風濕性關節(jié)炎(ra)是近1％人口罹患的高頻度的疾病，是伴隨關節(jié)的滑膜增殖發(fā)生關節(jié)破壞的進展性且難治性的炎癥性疾病。從在全身關節(jié)發(fā)生滑膜炎并增殖了的滑膜組織分泌il-1β、tnf-α等炎癥性細胞因子和各種蛋白酶，關節(jié)軟骨和骨逐漸被侵蝕，如果繼續(xù)進展，則關節(jié)被破壞而變形。由被炎癥性細胞因子活化的軟骨細胞和滑膜細胞分泌的細胞外基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases：mmps)強烈參與軟骨破壞，其中，已知基質金屬蛋白酶-3(mmp-3)在類風濕性關節(jié)炎的滑膜細胞中大量產生，強烈參與軟骨破壞的進展(非專利文獻1～3)。同時，已知這些炎癥性細胞因子也通過破骨細胞的活化、骨芽細胞的抑制引起骨破壞，由關節(jié)破壞引起功能障礙，使患者的日常生活動作(activitiesofdailyliving，adl)顯著降低(非專利文獻4)。

對于類風濕性關節(jié)炎患者，除了腎上腺皮質甾體藥以外，也進行非甾體系消炎劑(nsaid)、抗風濕藥劑(dmard)和生物學藥劑(抗tnf受體拮抗劑、抗il-1β拮抗劑、抗il-6受體拮抗劑)等藥物治療，然而，任何一種藥劑都在效果上個體差異大，同時，盡管使用多種藥劑，也有不能達到緩解的病例存在。

在這樣的難治性類風濕性關節(jié)炎的治療中，通過早期發(fā)現和早期治療將病情至少控制在低疾病活動性以下，從而抑制關節(jié)破壞的進展被認為是重要的(非專利文獻5)。

然而，類風濕性關節(jié)炎的臨床觀察的個體差別大，因為迄今還沒有特異性的檢查，與其他關節(jié)炎的鑒別也難，所以被認為在早期診斷中需要專業(yè)的知識，可以認為，其治療效果的判定也同樣需要繼續(xù)的專業(yè)醫(yī)師的診斷檢查(非專利文獻6)。

為了將類風濕性關節(jié)炎疾病活動性進行定量化評價，以前編制出了各種各樣的評價方法，然而，難于正確地進行定量化。其中，作為將類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性正確定量的評價方法而開發(fā)的疾病活動度評分(diseaseactivityscore：das)，是對壓痛關節(jié)數和腫脹關節(jié)數進行考查，而且加上患者的身體狀況的自我評價，使用特別的算式進行判定的方法，在臨床研究中，作為疾病活動性的評價方法成為主流。

但是，對于28個關節(jié)的熟練醫(yī)師的診斷檢查不可或缺，此外，需要使用平方根、對數的復雜計算，因此，就日常的診斷檢查而言，被指出花費時間而且無法反映腳關節(jié)和腳指關節(jié)的癥狀等問題(非專利文獻7)。盡管經“das28”評價為“緩解”，也存在關節(jié)破壞發(fā)生進展的情況，因此，作為臨床的緩解標準，被認為需要使用另外的boolean標準和sdai等標準(非專利文獻8)。

因此，期待有簡便且不放過所謂關節(jié)破壞的嚴重的疾病活動性的、可以正確評價的類風濕性關節(jié)炎標志物的研究以及使用該類風濕性關節(jié)炎標志物的新的評價方法的開發(fā)，正在進行活躍的研究開發(fā)。

例如，也有下述提議：髓磷脂堿性蛋白質自身抗體和髓磷脂堿性蛋白質基因多態(tài)性的檢測(專利文獻1、2)；新的多肽人踝蛋白的f1結構域或f3結構域的檢測(專利文獻3)；富亮氨酸α2糖蛋白(lrg)檢測(專利文獻4)；在滑膜細胞高表達的與滑膜細胞的異常增殖相關聯的新的蛋白質滑膜素(synoviolin)、其基因及其自身抗體的檢測(專利文獻5～8)；γ-谷氨酰轉肽酶(γ-gtp)及其基因的檢測(專利文獻9)；含有硒半胱氨酸的蛋白質的含量的測定(專利文獻10)；抗醛縮酶a抗體的檢測(專利文獻11)；通過檢測ix型膠原α-1鏈的切斷蛋白質片段的切斷位置的抗體進行ix型膠原破壞的診斷(專利文獻12)；通過1,4,5-三磷酸肌醇受體(ip3r)檢測自身抗體(專利文獻13)；由作為ra抗原的clonea多肽和卵泡抑素相關蛋白(frp)導致的慢性類風濕性關節(jié)炎患者特異性抗體的檢測(專利文獻14)等；另外，還有對ra滑膜細胞特異性表達進行增減的mirna(mir124a)的檢測(專利文獻15)。同時，也有下述提議：通過檢測關節(jié)液中的肌腱蛋白c的選擇性剪接位置和量的抗體來鑒別變形性關節(jié)病和類風濕性關節(jié)炎的方法(專利文獻16)。但是，至今仍不存在實用的活動性評價體系標志物。

在這些類風濕性關節(jié)炎標志物中，現在，血清mmp-3值作為可靠性最高的關節(jié)破壞的預后預測因子而受到矚目(非專利文獻9)，在臨床中也被用于早期類風濕性關節(jié)炎的診斷以及治療方針的確定等。據說，從前作為類風濕性關節(jié)炎診斷用的炎癥標志物使用的血清crp和esr反映全身的炎癥，與之相對，血清mmp-3反映關節(jié)局部的病態(tài)，在與早期ra鑒別困難的變形性關節(jié)病、痛風、外傷性關節(jié)病等的鑒別中發(fā)揮威力。另一方面，作為同樣與早期ra鑒別困難的類風濕性疾病類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)也顯示高值，進一步地，即使是各種膠原病、腎病等也變?yōu)楦咧档?，不能說特異性高。因此，為了進行類風濕性關節(jié)炎的正確診斷，不得不組合使用血清crp等炎癥標志物等(非專利文獻10)。

著眼于血清中的糖蛋白的糖鏈組成的變化的研究也很活躍。從前有將免疫球蛋白g糖鏈等血清中的糖蛋白加熱變性后，將糖鏈切下進行標記、純化，使用經ods-硅膠柱的高效液相色譜進行糖鏈分析，基于來自于健康個體試樣的糖鏈組成的變化進行類風濕性關節(jié)炎診斷的方法(專利文獻17)，然而，存在分析用試樣的配制煩雜、靈敏度低的問題。近年來，著眼于被分泌至血清中的n-結合型糖鏈，有提議基于使用ms/ms光譜的分析的診斷方法，將被觀察到在類風濕性關節(jié)炎患者中表達量顯著增加的多種n-結合型糖鏈，特別是具有(hex)3(hexnac)3(deoxyhexose)1(neuac)3+(man)3(glcnac)2的糖組成的糖鏈的存在量以及與該糖鏈的脫氧己糖(deoxyhexose)的結合位置不同的結構異構體的存在比例作為類風濕性關節(jié)炎的診斷用標志物(專利文獻18)。然而，這些n-結合型糖鏈的大多數即使在健康個體中也存在于血中，在病毒性肝炎患者的病情惡化中也觀察到特征性的(hex)3(hexnac)3(deoxyhexose)1(neuac)3+(man)3(glcnac)2的增加(例如，nakagawat等人，journalofbiologicalchemistry281(40)29797-29806(2006)等多篇)，因此，在作為類風濕性關節(jié)炎診斷用標志物的臨床上的實用性上存在問題。

也有多個下述提議：通過將多個類風濕性關節(jié)炎標志物進行組合，使用特別的算式進行評分，用于進行正確的類風濕性關節(jié)炎診斷和預后預測的評價方法。

例如，有下述提議：基于第1標志物(slc16a4)基因表達量信息和第2標志物(slco2b1、ptprm、shb或atp9a)基因表達量信息的類風濕性關節(jié)炎的存在的評價方法(專利文獻19)。

最近，美國crescendo公司開發(fā)了通過測定由血清中的il-6、egf、vegfa、lep、saa1、vcam1、crp、mmp-1、mmp-3、tnfrsf1a、retn和chi3l1組成的12個生物標志物，使用特殊的算式進行評分的疾病活動性指標(dai)進行類風濕性關節(jié)炎的診斷、監(jiān)測的方法(專利文獻20、非專利文獻11)。該方法與“das28”的相關也高，可以說，不需要由熟練的醫(yī)師進行詳細的診斷，使較正確的類風濕性關節(jié)炎的診斷成為可能。然而，多達12個生物標志物的測定需要巨額資金，還需要通過復雜的算式進行計算，因此，在臨床現場幾乎不能說是實用的方法。

由于這樣的背景，強烈期望提供經由不需要復雜的算式、通過盡量少的生物標志物的簡便的測定就可以正確評價類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的新的類風濕性關節(jié)炎標志物。

同時，類風濕性關節(jié)炎、特別是就發(fā)病初期而言，有時與同樣是類風濕性疾病的一種的類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)呈現相似的癥狀(非專利文獻12)，散見兩者的鑒別困難的病例。因此，需要有用于正確鑒別類風濕性關節(jié)炎與類風濕性多發(fā)肌痛癥的方法。

另一方面，在類風濕性疾病中，復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)是極為罕見的疾病，其癥狀具有特征性，已知存在癥狀有時出現有時消失的活動期和非活動期。同時，作為特異性的血液檢查方法，有使用抗膠原抗體的方法，然而，陽性率也并不那么高，存在即使是類風濕性關節(jié)炎也成為陽性的問題(非專利文獻13)。因此，急切期望提供無論活動期、非活動期都可以正確測定的優(yōu)異的標志物和檢查方法。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：wo2012/144512

專利文獻2：日本特開2014-170012號公報

專利文獻3：日本特開2011-157301號公報

專利文獻4：日本特開2010-286279號公報

專利文獻5：日本特開2007-325595號公報

專利文獻6：日本特開2007-82545號公報

專利文獻7：日本特開2007-75106號公報

專利文獻8：wo02/052007

專利文獻9：日本特開2003-24099號公報

專利文獻10：日本特開2003-26598號公報

專利文獻11：日本特開平11-94836號公報

專利文獻12：wo2008/108723

專利文獻13：wo2008/001944

專利文獻14：wo97/17441

專利文獻15：wo2010/001632

專利文獻16：日本特開2004-138489號公報

專利文獻17：日本特開平8-228795號公報

專利文獻18：wo2009/096403

專利文獻19：日本特開2012-152198號公報

專利文獻20：wo2011/047358

非專利文獻

非專利文獻1：labinvest.1992jun；66(6):680-690

非專利文獻2：j.biol.chem.1986oct25；261(30):14245-14255

非專利文獻3：inflammationandregeneration2004may；24(3):154-160

非專利文獻4：jimmunolres.2014；2014:263625

非專利文獻5：annrheumdis.2010apr；69(4):631-637

非專利文獻6：annrheumdis.2014mar；73(3):492-509

非專利文獻7：arthritisrheum.2012may；64(5):1316-1322

非專利文獻8：arthritisrheum.2011mar；63(3):573-586

非專利文獻9：jrheumatol.2000dec；27(12):2761-2768

非專利文獻10：annrheumdis.2002feb；61(2):161-166

非專利文獻11：arthritiscareres.2012；64:1794-1803

非專利文獻12：jautoimmun.2014；feb-mar；48-49:76-8

非專利文獻13：arthritisrheum.1990oct33(19):1493-1500

非專利文獻14：molecular&cellularproteomics2009；8(1):99-108

非專利文獻15：biochemistry1990nov6；29(44):10261-10270

非專利文獻16：naturemethods2005；2:851-856

非專利文獻17：clinchem2011jan；57(1):48-56

技術實現要素：

發(fā)明要解決的技術問題

本發(fā)明的課題是通過簡便的方法提供靈敏度高且可靠地評價類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的方法以及用于該方法的試劑盒，具體而言，使用新的類風濕性關節(jié)炎標志物，通過可以使用于醫(yī)療現場的簡便方法，以在適用性、靈敏度、精度方面在臨床上可以允許的性能，提供評價類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的方法、判定類風濕性關節(jié)炎治療效果的方法和判定類風濕性關節(jié)炎緩解的方法以及用于該方法的試劑盒。

同時，本發(fā)明的課題還提供用于正確鑒別與類風濕性關節(jié)炎類似的類風濕性疾病類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)的判定方法以及用于該方法的試劑盒，進一步提供類風濕性疾病中的復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的正確判定方法以及用于該方法的試劑盒。

解決技術問題的技術手段

本發(fā)明人為了能夠解決上述課題，在對用于在臨床現場可以使用的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的評價方法的類風濕性關節(jié)炎標志物進行努力研究中，著眼于在已知的各種標志物中被認為最能夠反映關節(jié)局部病態(tài)的血清中的mmp-3，進一步進行了詳細研究。于是，發(fā)現血清中的mmp-3在罹患類風濕性關節(jié)炎時，其分泌量具有增加的趨勢，然而，與此同時，其糖鏈的組成中也發(fā)生很大變化。

本發(fā)明人了解以前在罹患各種疾病時，根據病情血清中的特定糖蛋白的糖鏈組成存在導致發(fā)生變化的情況，因此，考慮到根據類風濕性關節(jié)炎性的疾病活動性，在血清中的mmp-3的糖鏈組成上出現變化的可能性。但是，雖然說血清中的mmp-3蛋白由于類風濕性關節(jié)炎的罹患而增加，至多只有100ng/ml至1000μg/ml左右，是極其微量的，相對于血中糖蛋白總量的存在比例在100～1,000,000分之一以下，是極少的。因此，將存在于mmp-3上的糖鏈的糖鏈變化從血清中所含有的所有糖蛋白的糖鏈特異性地檢測出來，因s/n比變低、靈敏度低，所以正確地測定是困難的。在此，本發(fā)明人利用使用抗mmp-3抗體的抗體覆蓋·凝集素芯片法(antibodyoverlaylectinarraymethod)，構筑了得到血清中微量mmp-3上的糖鏈結構信息的方法。如果該方法對市售的重組mmp-3蛋白使用，則即使是僅有100pg至1ng左右的mmp-3蛋白量，得到最低限度的糖鏈結構信息也是可能的。這顯示即使是健康個體的血液中所含有的微量mmp-3(40ng/ml左右)，也能夠以敏銳的靈敏度進行分析，可以研究病情相應的糖鏈變化。

接著，將罹患類風濕性關節(jié)炎的患者等的血清作為對象，使用經由抗體覆蓋·凝集素芯片法的分析，選出識別患者血清中的mmp-3上的糖鏈上的特異性糖鏈的凝集素，嘗試對成為類風濕性關節(jié)炎標志物的糖鏈進行鑒定。

其結果，在類風濕性關節(jié)炎患者血清中的mmp-3中，在凝集素acg、jacalin、aba、aca中觀察到顯著高的信號。在此，因為除acg以外的jacalin、aba、aca凝集素明顯是o-結合型糖鏈(o-glycan)識別凝集素，因此，該結果意味著，由于類風濕性關節(jié)炎的罹患，作為血清中的mmp-3上的糖鏈，存在o-結合型糖鏈，至少存在由jacalin、aba和aca凝集素的任意一種識別的o-結合型糖鏈。從前，作為血清中的糖蛋白的糖鏈組成變化，主要是n-結合型糖鏈受到矚目(專利文獻18等)，至于mmp-3上的糖鏈，因為僅報告了o-結合型糖鏈的存在，因此可以認為，作為類風濕性關節(jié)炎特異性糖鏈抗原表位的糖鏈結構是新的糖鏈結構。

但是，僅就表達量多的糖鏈而言，不管是否罹患類風濕性關節(jié)炎，mmp-3本來具有的糖鏈伴隨著向血清中mmp-3分泌量的增大，也存在觀察到信號的增大的可能性。于是，對于各凝集素信號量，從與血清中的mmp-3的量的相關性來看，acg、aba、aca都與mmp-3表達量高度相關，然而，僅在jacalin凝集素的情況下相關性較弱，特別是，觀察到在mmp-3表達量高的組中jacalin信號顯著低的實例。在計算高度相關于mmp-3的aba和aca與jacalin的相關性時，相對于aba與aca的高度相關性，任意一種凝集素都與jacalin的相關性低。

這些結果存在著反映jacalin分別與aba、aca之間的糖鏈識別的不同的可能性。本發(fā)明人考慮，從迄今為止的知識來看，結果反映了對在o-結合型糖鏈的肽上結合的n-乙酰半乳糖胺(galnac)的第6位的糖鏈修飾的不同。判斷為，特別是jacalin不允許對o-結合型糖鏈的galnac的第6位的修飾，該修飾使反應性消失(非專利文獻14)。作為對該位置的代表性的修飾，有唾液酸修飾。于是，使用前述的患者血清中的一些血清試樣，實施作為唾液酸分解酶的唾液酸酶處理。將唾液酸酶處理前后的樣品作為對象進行凝集素芯片分析，結果顯示，就處理后的樣品而言，jacalin的信號也與aba、aca一樣與mmp-3的量相關。

以上的結果表明，如果罹患類風濕病，mmp-3的血中濃度升高，然而，對在mmp-3上存在的o-結合型糖鏈的肽上直接結合的galnac的唾液酸修飾，根據患者會不同。而且，在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性惡化的患者組中，從觀察到jacalin信號變弱的顯著趨勢來看，疾病活動性的惡化與該唾液酸修飾存在負相關的可能性大。

于是，接下來，對該不同的臨床實用性進行調查，作為捕捉mmp-3上的o-結合型糖鏈的“質的變化”的指標，研究了aba/jacalin值。將該值與臨床參數的相關性在統計學上進行驗證的結果，與從前作為表示類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的數值das28-crp、das28-esr、cdai、sdai和醫(yī)師vas的值全部具有顯著相關性，特別是，與das28顯示p≦0.0001這樣的高度相關性。

這意味著，通過使用以凝集素芯片和凝集素-抗體三明治elisa法為代表的使用凝集素的特定蛋白質上的糖鏈分析方法，僅通過測定對血清中的mmp-3的jacalin反應性以及對aba、aca或acg的反應性，求出兩者之比，不需要熟練醫(yī)師的診斷或通過復雜算式的煩雜計算，就可以客觀把握類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性，可以提供與das28同等程度的類風濕性關節(jié)炎的診斷精度。

同時，jacalin識別的糖鏈是o-結合型糖鏈，是在肽鏈的ser/thr上結合的o-結合型糖鏈的核心結構-1(核心1：gal(β1,3)galnac)或tn抗原(galnac)。然后，在其上存在的galnac的第6位導入唾液酸的情況下，通過該修飾，jacalin反應性受到阻礙。另一方面，aba和aca也與jacalin一樣，是o-結合型糖鏈識別凝集素，然而，識別或者可以允許該位置的唾液酸修飾(kunoa等人，molecular&cellularproteomics8(1)99-108(2009))。也就是說，上述結果強烈暗示，通過罹患類風濕性關節(jié)炎，對在血清中的mmp-3所具有的o-結合型糖鏈的核心結構-1的galnac的第6位的唾液酸修飾持續(xù)增加。

為了驗證這一點，使用從實際的類風濕性關節(jié)炎患者的病變關節(jié)采取的滑液試樣，根據mmp-3的量對jacalin信號作圖，顯示漂亮的呈現負相關的曲線。另一方面，從與早期的類風濕性關節(jié)炎鑒別困難的變形關節(jié)病患者得到的滑液試樣顯示與健康個體同樣的曲線。

該結果證實，如果罹患類風濕性關節(jié)炎，伴隨其病情的惡化，在滑膜組織內的滑膜細胞產生的mmp-3上的jacalin結合性糖鏈抗原表位減少，也就是說，在同一mmp-3上的o-結合型糖鏈的核心結構-1上對galnac的第6位的唾液酸修飾持續(xù)增加。與此同時，不容質疑，在罹患類風濕性關節(jié)炎患者血清試樣中觀察到的mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈抗原表位減少的現象正確反映來自于滑膜組織的mmp-3上的糖鏈結構變化。這也證實，使用對受試者侵入性較低的血清試樣，進行正確的類風濕性關節(jié)炎診斷是可能的。

通過得到以上知識，從而完成了本發(fā)明。

即，可以說，本發(fā)明提供由血清中的mmp-3上的凝集素jacalin結合性o-結合型糖鏈抗原表位形成的類風濕性關節(jié)炎的負相關的(負的)糖鏈生物標志物。具體而言，通過測定血液(例如血清)中的jacalin信號的倒數經mmp-3值或者aba、aca或acg信號值修正后的值，可以評價類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性。或者，即使觀察血液(血清)中的mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈的核心結構-1“gal(β1,3)galnac”的修飾galnac的第6位的唾液酸(neunac)的修飾程度(如果唾液酸修飾增加，jacalin的反應性降低)，也可以評價類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性。

本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性評價方法使得將類風濕性關節(jié)炎在適用性、靈敏度、精度方面以臨床上可允許的性能進行檢測和判別成為可能。而且，使得通過簡便的方法，使用可以用于醫(yī)療現場的方法，評價類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性成為可能。

在本發(fā)明中，受試試樣中的類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物的減少可以通過標記化的jacalin以及進一步標記化的aba、aca和acg的染色或者通過與標記化的mmp-3或標記抗mmp-3抗體的三明治法進行。作為在該三明治法中使用的抗mmp-3抗體，可以使用市售的(商品名)抗體。另外，在作為抗mmp-3抗體不使用市售的抗體的情況下，基于已知的mmp-3的序列信息，通過本身公知的方法可以制作特異性抗體。本發(fā)明所使用的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體的任意一種。這些抗體可以按照本身公知的抗體或抗血清的制造方法進行制造。

本發(fā)明的作為用于分析作為負的類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物的mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈的糖鏈結構的技術，可以列舉，通過前沿親和色譜法(fac)、凝集素微芯片、質譜法或串聯質譜法(ms或msⁿ)等的糖鏈圖譜分析。如果確定了該糖鏈結構，基于其信息可以選擇正的類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物。關于凝集素的信息，可以從凝集素前沿數據庫(lfdb)或日本產業(yè)技術綜合研究所·糖鏈醫(yī)工學研究中心的主頁等獲取。同時，也可以使用識別上述糖鏈結構的抗體。

使用本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性評價方法，使用疑似類風濕性關節(jié)炎的受試者的血液試樣(血清或血漿)，使得在醫(yī)療現場的簡便且精度高的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的評價成為可能。同時，作為侵入性最低的試樣，優(yōu)選血液試樣，但使用關節(jié)液(滑液)也可以得到同樣的結果，此外，當然，如果是胸腔積液、腹水、淋巴液、唾液、髓液等來自于受試者的體液，也同樣可以診斷。另外，就以下的說明而言，主要對典型的血液試樣進行敘述，然而，本發(fā)明不只限于血液試樣。

本發(fā)明包括類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性評價用試劑盒，所述試劑盒在用于實施本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性評價方法中使用，配備有：將凝集素或抗體的任意一種進行標記的、從jacalin和aba、aca和acg中選擇的任意一種凝集素以及抗mmp-3抗體。

在該試劑盒中，將包含從jacalin以及aba、aca、acg中選擇的任意一種凝集素的多種凝集素在支承體上進行固相化，優(yōu)選使用凝集素芯片，然而，也可以將各凝集素制成生物素化凝集素，在鏈霉親和素包覆的支承體上以固相化的形態(tài)進行配制。

進一步地，與類風濕性關節(jié)炎一樣，為了正確判定是否分別罹患類風濕性疾病類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)以考察用于與類風濕性關節(jié)炎進行正確鑒別的標志物，重新評估了凝集素芯片圖譜分析的結果，選擇統計學上具有顯著差異的lel和stl這樣的均可識別多聚乳糖胺結構的凝集素，使用新配制的類風濕性關節(jié)炎(ra)、類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的患者血清，研究了與mmp-3濃縮組分的lel和stl凝集素的反應性。

其結果，對于任意一種凝集素，得到這樣的顯著的結果：來自于復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)患者的試樣的反應性極高，然后，是來自于類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)患者的試樣反應性高，來自于類風濕性關節(jié)炎(ra)患者和健康個體(hc)的試樣幾乎沒有反應性。

這顯示，mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈成為類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的罹患判定用的優(yōu)異的糖鏈標志物。

同時，通過計算lel凝集素信號與jacalin或acg信號之比，與來自于類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)、復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)患者和健康個體(hc)的血清進行比較，確認僅有來自于類風濕性關節(jié)炎(ra)患者的血清顯示高的數值。

從這些結果來看，與受試血清試樣中的mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈的反應性，使用例如抗mmp-3抗體和lel或stl凝集素的三明治分析法等進行測定，可以將類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)與類風濕性關節(jié)炎(ra)相識別，正確診斷是否罹患。

同時，通過測定與受試血清試樣中的mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈的反應性信號與jacalin、acg等mmp-3上的前述o-結合型糖鏈的反應性信號之比，可以正確診斷與類似的類風濕性疾病相鑒別的、正在罹患的類風濕性關節(jié)炎(ra)。

通過得到以上的知識，也可以解決本發(fā)明的其他課題。

也就是說，本發(fā)明包括以下的發(fā)明。

〔1〕類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法，所述方法包括：測定受試體液試樣中的mmp-3上的o-結合型糖鏈的糖鏈結構的變化的工序。

本發(fā)明也可以表達如下。

〔1’〕提供用于判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的數據的方法，所述方法包括：測定受試體液試樣中的mmp-3上的o-結合型糖鏈的糖鏈結構的變化的工序。

〔2〕如前述〔1〕所記載的判定方法，所述方法如下進行：前述糖鏈結構的變化的測定是將顯示受試體液試樣中的mmp-3總量的測定信號乘以顯示mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號的倒數，或者，前述糖鏈結構的變化的測定是將顯示受試體液試樣中的mmp-3總量的測定信號的倒數乘以顯示mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號，計算下述糖鏈修飾判別指數x或y；

x＝顯示受試體液試樣中的mmp-3總量的測定信號/顯示同一mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號，

y＝顯示受試體液試樣中的mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號/顯示同一mmp-3總量的測定信號。

〔3〕如前述〔2〕所記載的方法，其中，糖鏈修飾判別指數x的值越高，判定為類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性越高；或者，糖鏈修飾判別指數y的值越高，判定為類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性越低。

〔4〕如前述〔2〕或〔3〕所記載的方法，其中，顯示前述mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號是使用jacalin凝集素測定的值。

〔5〕如前述〔2〕～〔4〕中任意一項所記載的方法，其中，顯示前述mmp-3總量的測定信號是體液試樣中的mmp-3存在量的測定值或者是根據體液試樣中的mmp-3存在量而增減的測定信號。

〔6〕如前述〔5〕所記載的方法，其中，根據前述mmp-3存在量而增減的測定信號是使用對mmp-3的多肽鏈特異性地識別的抗mmp-3抗體測定的信號值或者是顯示體液試樣中的mmp-3與從aba、aca和acg中選擇的任意一種凝集素的結合量的測定信號值。

〔7〕判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的方法，所述方法包括下述(1)～(5)的工序：

(1)測定顯示受試體液試樣中的mmp-3與jacalin的結合量的信號的工序；

(2)測定顯示同一受試體液試樣中的mmp-3存在量、或者同一mmp-3與從aba、aca和acg中選擇的任意一種凝集素的結合量或與抗mmp-3抗體的結合量的信號的工序；

(3)將由工序(1)得到的測定值的倒數乘以由工序(2)得到的測定值來計算糖鏈修飾判別指數x，或者將由工序(1)得到的測定值乘以由工序(2)得到的測定值的倒數來計算糖鏈修飾判別指數y的工序；

(4)將由工序(3)計算的值(x)或(y)與基準值(x0)或(y0)進行比較的工序；

(5)在工序(4)中x高于基準值x0的情況下(x>x0)，判定為類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性高或者正在罹患類風濕性關節(jié)炎的工序；或者

在工序(4)中y低于基準值y0的情況下(y<y0)，判定為類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性高或者正在罹患類風濕性關節(jié)炎的工序。

〔8〕如前述〔7〕所記載的方法，其中，前述基準值x0或y0是對來自于健康個體的體液試樣經工序(1)～(3)計算的值。

〔9〕判定受試者的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的經時性的病情變化的方法，所述方法包括下述(1)～(5)的工序：

(1)測定顯示受試體液試樣中的mmp-3與jacalin的結合量的信號的工序；

(2)測定顯示同一受試體液試樣中的mmp-3存在量、或者同一mmp-3與從aba、aca和acg中選擇的任意一種凝集素的結合量或與抗mmp-3抗體的結合量的信號的工序；

(3)將由工序(1)得到的測定值的倒數乘以由工序(2)得到的測定值來計算糖鏈修飾判別指數x’，或者將由工序(1)得到的測定值乘以由工序(2)得到的測定值的倒數來計算糖鏈修飾判別指數y’的工序；

(4)將由工序(3)計算的值(x’)或(y’)與對同一受試者的檢測日以前的體液試樣經工序(1)～(3)計算的值(x’0)或(y’0)進行比較的工序；

(5)在工序(4)的比較工序中，對于x’在出現比檢測日以前高的數值的情況下(x’>x’0)、對于y’在出現比檢測日以前低的數值的情況下(y’<y’0)，判定為受試者的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性惡化，在出現低的數值的情況下(x’<x’0)或出現高的數值的情況下(y’>y’0)，判定為疾病活動性改善的工序。

〔10〕如前述〔9〕所記載的方法，其中，前述受試體液試樣是來自于類風濕性關節(jié)炎治療后的受試者的體液試樣，前述檢測日以前的體液試樣是來自于治療前的同一受試者的體液試樣；

在工序(4)的比較工序中，對于x’在比治療前低的情況下(x’<x’0)、對于y’在比治療前高的情況下(y’>y’0)，判定為通過對受試者實施的類風濕性關節(jié)炎的治療具有治療效果；在比治療前高或者沒有變化的情況下(x’≧x’0)、或者比治療前低或者沒有變化的情況下(y’≦y’0)，判定為沒有治療效果。

〔11〕成為類風濕性關節(jié)炎活動性判定用標志物的糖鏈抗原表位，其特征在于，其為mmp-3上的o-結合型糖鏈，而且是jacalin非結合性的。

〔12〕成為類風濕性關節(jié)炎活動性判定用標志物的糖鏈抗原表位，其特征在于，其為mmp-3上的o-結合型糖鏈，而且在mmp-3的肽鏈中的ser/thr上結合的galnac被α2,6唾液酸修飾。

〔13〕由前述〔11〕或〔12〕所記載的糖鏈抗原表位形成的類風濕性關節(jié)炎活動性判定用標志物。

〔14〕mmp-3，其為用于在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法中使用的mmp-3，而且是在肽鏈中的ser/thr上結合的galnac具有多個被α2,6唾液酸修飾的o-結合型糖鏈。

〔15〕mmp-3，其為用于在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法中使用的mmp-3，從受試體液試樣制備，而且具有多個jacalin非結合性的o-結合型糖鏈。

〔16〕mmp-3上的o-結合型糖鏈、并且在mmp-3的肽鏈中的ser/thr上結合的galnac被α2,6唾液酸修飾的o-結合型糖鏈在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法中的使用。

〔17〕在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法中使用的、在mmp-3的肽鏈中的ser/thr上結合的galnac被α2,6唾液酸修飾的o-結合型糖鏈。

〔18〕可適用于受試體液試樣的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑，所述試劑包含：特異性地識別前述〔11〕或〔12〕所記載的糖鏈抗原表位的物質或者特異性地識別前述〔14〕或〔15〕所記載的mmp-3的物質。

〔19〕前述〔18〕所記載的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑，其中，前述特異性地識別糖鏈抗原表位的物質是從糖鏈識別抗體、凝集素、糖鏈識別肽和糖鏈識別適體中選擇的物質。

〔20〕可適用于受試體液試樣的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑，前述試劑包含：識別在mmp-3上的ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的物質。

〔21〕前述〔20〕所記載的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性判定用試劑，其中，前述識別在mmp-3上的ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的物質是jacalin。

〔22〕類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑盒，前述試劑盒包含：前述〔18〕～〔21〕中的任意一項所記載的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑；以及進一步地，對于體液試樣中的mmp-3，依賴于mmp-3存在量而與mmp-3特異性地結合的物質。

〔23〕前述〔22〕所記載的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑盒，其中，前述對于體液試樣中的mmp-3，依賴于mmp-3存在量而與mmp-3特異性地結合的物質是從aba、aca和acg中選擇的凝集素或抗mmp-3抗體。

〔24〕jacalin在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法中的用途。

〔25〕在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法中使用的jacalin。

〔26〕jacalin在類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性判定用試劑的制造中的用途。

〔27〕成為類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)診斷用標志物的糖鏈抗原表位，其特征在于，其為受試體液試樣中的mmp-3上的糖鏈，并且含有與識別多聚乳糖胺結構的凝集素具有結合活性的糖鏈。

〔28〕如前述〔27〕所記載的糖鏈抗原表位，其中，識別多聚乳糖胺結構的凝集素是lel凝集素或stl凝集素。

〔29〕由如前述〔27〕或〔28〕所記載的糖鏈抗原表位形成的類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)診斷用標志物。

〔30〕可適用于受試血液試樣的類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)診斷用試劑，前述試劑包含：特異性地識別前述〔27〕或〔28〕所記載的糖鏈抗原表位的物質或特異性地識別含有該糖鏈抗原表位的mmp-3的物質。

〔31〕類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的診斷方法，其特征在于，所述方法包括下述工序：對于受試體液試樣，測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量。

本發(fā)明也可以表達如下。

〔31’〕提供用于診斷類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的數據的方法，其特征在于，所述方法包括如下工序：對于受試體液試樣，測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量。

〔32〕如前述〔31〕所記載的方法，其中，識別多聚乳糖胺結構的凝集素是lel凝集素或stl凝集素。

同時，本發(fā)明也可以表達如下。

〔32’〕lel凝集素或stl凝集素在類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的診斷方法中的用途。

〔32”〕在類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的診斷方法中使用的lel凝集素或stl凝集素。

〔32”’〕在類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的診斷用試劑中使用的lel凝集素或stl凝集素。

〔33〕如前述〔31〕或〔32〕所記載的方法，其中，前述測定工序是通過抗mmp-3抗體和識別多聚乳糖胺結構的凝集素的三明治分析法進行的測定工序。

〔34〕罹患類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的判定方法，其特征在于：對于來自于懷疑是否罹患類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的受試者的體液試樣，通過下述(1)～(3)的工序進行判定：

(1)對于來自于受試者的體液試樣，測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序；

(2)對于來自于健康個體和/或類風濕性關節(jié)炎患者的體液試樣，測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序；

(3)在由(1)得到的顯示糖鏈的存在量的數值顯著高于由(2)得到的顯示糖鏈的存在量的數值的情況下，判定為正在罹患類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的工序。

另外，在此，典型的識別多聚乳糖胺結構的凝集素是lel凝集素或stl凝集素。

〔35〕如前述〔34〕所記載的方法，其中，前述(1)和(2)的測定工序是抗mmp-3抗體和lel凝集素或stl凝集素的三明治分析法。

〔36〕類風濕性關節(jié)炎(ra)的診斷方法，其特征在于：對于受試體液試樣，至少適用下述(1)和(2)的測定工序：

(1)測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序；

(2)測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與從jacalin、aba、aca和acg中選擇的至少一種o-結合型糖鏈識別凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序。

另外，在此，典型的識別多聚乳糖胺結構的凝集素是lel凝集素或stl凝集素。

并且，本發(fā)明也可以表達如下。

〔36’〕提供用于診斷類風濕性關節(jié)炎(ra)的數據的方法，其特征在于，對于受試體液試樣，至少適用下述(1)和(2)的測定工序：

(1)測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序；

(2)測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與從jacalin、aba、aca和acg中選擇的至少一種o-結合型糖鏈識別凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序。

〔37〕如前述〔36〕所記載的方法，其特征在于：通過使用了前述抗mmp-3抗體以及包含識別多聚乳糖胺結構的凝集素和前述o-結合型糖鏈識別凝集素的凝集素芯片的三明治分析法同時進行前述(1)和(2)測定工序。

〔38〕罹患類風濕性關節(jié)炎的判定方法，其特征在于：對于來自于懷疑是否罹患類風濕性關節(jié)炎的受試者的體液試樣，通過下述(1)～(4)的工序進行判定：

(1)測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序；

(2)測定既顯示與抗mmp-3抗體的結合活性、又顯示與從jacalin、aba、aca和acg中選擇的至少一種o-結合型糖鏈識別凝集素的結合活性的糖鏈的存在量的工序；

(3)計算由(2)得到的糖鏈的存在量與由(1)得到的糖鏈的存在量之比的工序；

(4)與預先或者同時對于來自于健康個體的體液試樣使用(1)～(3)的工序計算的糖鏈的存在量之比的數值進行比較，在由(3)得到的數值顯著高的情況下，判定為受試者正在罹患類風濕性關節(jié)炎的工序。

另外，在此，典型的識別多聚乳糖胺結構的凝集素是lel凝集素或stl凝集素。

〔39〕如前述〔38〕所記載的方法，其特征在于：通過使用了前述抗mmp-3抗體以及包含識別多聚乳糖胺結構的凝集素和前述o-結合型糖鏈識別凝集素的凝集素芯片的三明治分析法同時進行前述(1)和(2)測定工序。

〔40〕類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)診斷用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含下述(1)和(2)：

(1)抗mmp-3抗體；

(2)識別多聚乳糖胺結構的凝集素。

〔41〕如前述〔40〕所記載的試劑盒，其中，識別多聚乳糖胺結構的凝集素是lel凝集素或stl凝集素。

〔42〕類風濕性關節(jié)炎診斷用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含下述(1)～(3)：

(1)抗mmp-3抗體；

(2)識別多聚乳糖胺結構的凝集素；

(3)從jacalin、aba、aca和acg中選擇的至少一種識別o-結合型糖鏈的凝集素。

〔43〕如前述(42〕所記載的試劑盒，其中，(2)和(3)的凝集素在同一凝集素芯片上存在。

發(fā)明效果

本發(fā)明的觀察mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈的減少的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性評價方法，可以客觀地判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性，使得更正確的病情把握成為可能。而且，因為僅通過測定與血清中的jacalin以及從aba、aca和acg中選擇的任何一種凝集素或者抗mmp-3抗體的結合性信號的簡單操作，使得與必須經過熟練醫(yī)師的詳細診斷和經過煩雜算式的分析的“das28”相匹敵的正確判定成為可能，所以對醫(yī)療現場的貢獻是不可估量的。而且，已證實，本發(fā)明中，在血液試樣(血清試樣)或關節(jié)液(滑液)試樣等體液試樣中觀察到的mmp-3上的o-結合型糖鏈的質的變化正確地反映在滑膜組織中產生的mmp-3上的o-結合型糖鏈的質的變化。根據本發(fā)明，可以提供在醫(yī)療現場可以容易使用的、具有簡便性和精度的、在臨床使用上優(yōu)異的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑盒。也期待使用該試劑盒可以與從前困難的早期的類風濕性關節(jié)炎與變形性關節(jié)病等其他關節(jié)炎癥性疾病進行鑒別的可能性。

進一步地，通過本發(fā)明判明受試體液試樣中的mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈成為用于正確判定是否分別罹患類風濕性關節(jié)炎與同樣是類風濕性疾病的類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的糖鏈標志物，通過與抗mmp-3抗體一起使用lel和/或stl凝集素，提供類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的正確的診斷方法以及與類風濕性關節(jié)炎的鑒別方法。

進一步地，提供類風濕性關節(jié)炎(ra)的正確的診斷方法以及與類似的類風濕性疾病的鑒別方法，包括下述工序：測定與受試體液試樣中的mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈的反應性信號以及與從jacalin、acg、aba、aca和acg中選擇的mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素的反應性信號之比的工序。

同時，根據本發(fā)明，通過抗mmp-3抗體與lel或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素的組合、或者進一步組合從jacalin、acg、aba、aca和acg中選擇的mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素，可以提供能夠與類似的類風濕性疾病顯著識別的類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)、復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)以及類風濕性關節(jié)炎(ra)用診斷用試劑盒。

附圖說明

圖1表示洗脫組分(mmp-3-ip)的蛋白質印跡(wb)。另外，為了使各血清試樣可以換算為重組mmp-3的量，事先通過預實驗進行調整使試樣內的mmp-3的量落入標準rmmp-3的范圍(50～400pg)內，然后加樣至凝膠。圖中的括號內顯示樣品的加樣量(未表示：0.1μl(相當于血清0.2μl)；×1/4：0.025μl(相當于血清0.05μl)；×1/2：0.05μl(相當于血清0.1μl)；×2：0.2μl(相當于血清0.4μl)；×4：0.4μl(相當于血清0.8μl)。

圖2表示由wb的條帶強度估算的mmp-3的量與通常測定mmp-3的量的相關圖。

圖3表示來自于患者血清的mmp-3的凝集素芯片分析結果。是關于測定的36個病例中顯示典型性的譜的兩例的圖?？梢钥吹贸?，α2,3唾液酸識別凝集素acg與o-結合型糖鏈識別凝集素aba和aca在信號模式上十分相似，與此相對，同樣是o-結合型糖鏈識別凝集素jacalin的相對強度是不同的。各個病例中，將jacalin值低的情況稱為“模式(1)”，將jacalin值高的情況稱為“模式(2)”。

圖4表示通過凝集素芯片分析設想的mmp-3的主要o-結合型糖鏈結構。圖中，將畫下劃線的糖鏈結構設想為mmp-3的主要o-結合型糖鏈結構。另外，□表示galnac，○表示gal，◆表示neunac。

圖5表示mmp-3的血清中濃度分別與aba、aca、acg和jacalin的信號強度的相關圖。aba、aca和acg信號分別與mmp-3濃度存在相關性，與之相對，沒有確認到jacalin信號與mmp-3濃度的相關性。

圖6表示aba、aca和jacalin凝集素信號之間的相關圖。在aba、aca之間確認到強烈的相關性，而jacalin與任何一種凝集素都未確認到相關性，表明僅jacalin與mmp-3的量之間顯示不同的趨勢。

圖7表示aba/jacalin值與類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的相關圖。使用與mmp-3的量存在強烈相關性的凝集素之一aba的信號以及jacalin信號，以糖鏈修飾判別指數x＝aba/jacalin值為橫軸、以被稱為表示類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的各種參數的值為縱軸作圖，考察兩者之間的相關性。其結果，確認到與除患者vas值以外的全部參數具有一定程度的相關性。

圖8表示aba/jacalin值與疾病活動性分類的相關圖。基于das28-esr、sdai和cdai各自的標準，將36個病例的血清試樣分為4類(緩解、低疾病活動性、中等程度疾病活動性和高疾病活動性)，將aba/jacalin值作圖，考察各自的分布，其結果，隨著活動性增高，aba/jacalin值的數值升高。另一方面，未觀察到mmp-3值與疾病活動性的相關性。p值由斯皮爾曼等級相關系數求出。

圖9表示唾液酸酶消化對來自于血清的mmp-3的糖鏈譜產生的影響。對于12個病例的血清試樣，將mmp-3進行唾液酸酶消化，包括未處理試樣全部進行凝集素芯片分析，其結果，消化前，jacalin信號具有顯著差異(參見圖3)，然而，消化后，其差異消除。表示出從該結果設想的唾液酸酶消化前后的糖鏈結構變化。另外，□表示galnac，○表示gal，◆表示neunac。

圖10顯示滑液中的mmp-3的蛋白質印跡。將從罹患類風濕性關節(jié)炎(ra)和變形性關節(jié)病(oa)的各3個病例的患者采集的滑液中的mmp-3的量進行測定，由預先調整為1μg/ml濃度的各自的滑液稀釋試樣，通過抗mmp-3抗體進行免疫沉降(ip)，將取得的洗脫液(mmp-3-ip)加樣于等量凝膠進行蛋白質印跡。在任何一個試樣中測定到基本同等程度的mmp-3值。

圖11表示來自于滑液的mmp-3的比較糖鏈分析。將從罹患類風濕性關節(jié)炎(ra)和變形性關節(jié)病(oa)的各3個病例的患者采集的滑液中的mmp-3通過凝集素芯片進行比較糖鏈分析。上圖顯示來自于類風濕性關節(jié)炎患者3個病例的滑液試樣的糖鏈譜，下圖顯示來自于變形性關節(jié)病患者3個病例的滑液試樣的糖鏈譜。就本實驗而言，因為同時測定了mmp-3的量，所以信號的差異意味著mmp-3的糖鏈的質的差異。來自于類風濕性關節(jié)炎患者的滑液試樣的mmp-3糖鏈譜與從類風濕性關節(jié)炎患者中、特別是疾病活動性高的患者的血清試樣得到的mmp-3的糖鏈譜類似，即使在滑液試樣中也具有jacalin值相對較低的特征。這意味著，即使在滑膜組織內產生的mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈抗原表位的糖鏈結構被分泌至血清中，也保持同樣的糖鏈結構，因此，顯示使用對患者負擔較小的血液試樣(血清試樣)，能夠以與滑液試樣幾乎同等程度的精度進行糖鏈抗原表位分析。

圖12表示滑液中的4種凝集素信號的比較數據。圖11的糖鏈譜中，對于在類風濕性關節(jié)炎患者血清試樣中確認到顯著的信號強度的acg、aba、aca和jacalin，將類風濕性關節(jié)炎(ra)和變形性關節(jié)病(oa)的滑液試樣之間的數值作圖。4種凝集素均在ra和oa之間確認到顯著差異，特別是在jacalin中兩者之間確認到顯著差異，就ra而言，可觀察到jacalin值低的趨勢。即證實，對血清試樣使用mmp-3上的糖鏈抗原表位分析正確地反映了滑液中的mmp-3上的糖鏈抗原表位的狀態(tài)。

圖13表示使用其他病例(類風濕性關節(jié)炎：ra；類風濕性多發(fā)肌痛癥：pmr；復發(fā)性多發(fā)軟骨炎：rp)患者組共計29名的血清，mmp-3的血清濃度與aba、aca、acg和jacalin各自的信號強度的相關圖。與圖5一樣，aba、aca和acg信號都與mmp-3濃度相關，與此相對，未確認到jacalin信號與mmp-3濃度的相關性。

圖14是分別對于ra、pmr、rp和健康個體(hc)，將jacalin值和mmp-3值作圖的圖。就ra而言，未觀察到mmp-3值和jacalin值之間相關，也可以看出，與圖5的背離實例一樣，mmp-3值越高，jacalin值好像越低；然而，非ra未觀察到這樣的趨勢，jacalin和mmp-3值的相關性高。

圖15是分別對于ra、pmr、rp和hc，將acg/jacalin值和mmp-3值作圖的圖?？芍瑑Hra中，在類風濕性關節(jié)炎(ra)活動性高的組中，acg/jacalin值高。

圖16是測定ra、pmr、rp和hc各自的stl和lel凝集素信號，進行wilcoxson檢驗和roc分析的圖。就類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)而言，auc＝1.0，顯示對任何一種疾病都可以特異性地鑒別。

圖17是測定ra、pmr、rp和hc各自的jacalin/lel值和acg/lel值，進行wilcoxson檢驗和roc分析的圖。就類風濕性關節(jié)炎(ra)而言，在jacalin/lel值的情況下，auc＝0.983，在acg/lel值的情況下，auc＝0.956，顯示任意值都可以特異性地鑒別。

具體實施方式

1.本發(fā)明中的類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物

在本發(fā)明中，作為與類風濕性關節(jié)炎診斷負相關的(負的)的糖鏈生物標志物而使用的糖鏈，是可以在血清中觀察的來自于滑膜組織的基質金屬蛋白酶3(matrixmetalloproteinases-3；mmp-3)上的糖鏈，且可觀察到隨著類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的增大而漸漸喪失的jacalin結合性糖鏈。

將jacalin結合性糖鏈的量使用血清中的mmp-3存在量或在mmp-3上特定存在的糖鏈的量或者以顯示存在與mmp-3存在量相關的反應性的凝集素為代表的糖鏈識別探針的結合量進行修正后的值，成為本發(fā)明的糖鏈生物標志物的量。

(1-1)對于mmp-3

已知mmp-3在類風濕性關節(jié)炎的滑膜細胞中大量產生，與軟骨破壞的進展強烈相關(非專利文獻1～3)。

從前作為類風濕性關節(jié)炎診斷用的炎癥標志物使用的血清crp和esr反映全身的炎癥，與此相對，據說血清中的mmp-3值反映關節(jié)局部的病態(tài)，現在，作為可靠性最高的關節(jié)破壞的預后預測因子而受到矚目。同時，初期的類風濕性關節(jié)炎與變形性關節(jié)病等其他關節(jié)性疾病的鑒別困難，然而，從反映軟骨破壞程度的血清中的mmp-3值來看，類風濕性關節(jié)炎可以在初期階段進行診斷。

但是，因為與成為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的指標的“das28”的相關性并不那么高，所以不能單獨作為成為類風濕性關節(jié)炎的病態(tài)指標的診斷用標志物使用，在臨床上用于與“das28”等進行組合的早期類風濕性關節(jié)炎的診斷以及治療方針的確定等。

mmp-3從軟骨細胞和滑膜細胞作為分泌型(分子量57,000或59,000)而被分泌，去除信號肽等而成為活性型(分子量45,000、28,000)，是分解構成基底膜和軟骨的軟骨蛋白聚糖、iii、iv、v、vii、ix型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白和明膠的金屬蛋白酶(非專利文獻2、非專利文獻15)。

mmp-3被除去信號序列和前體序列后成為mmp-3成熟蛋白而被活化?？梢哉J為，與其他mmp家族成員一樣，mmp-3具有如下結構域結構：與zn結合的酶活性結構域(結合結構域)和參與底物識別的血紅素結合蛋白樣結構域通過75個氨基酸殘基以下的鉸鏈區(qū)(連接結構域)相連。mmp-3上的糖鏈結構和附加位置信息匱乏，已知有關n-結合型糖鏈存在酶活性結構域。然而，完全沒有關于o-結合型糖鏈的知識。如果基于其他mmp的知識進行預測，可以認為，罹患類風濕性關節(jié)炎后，在mmp-3的鉸鏈區(qū)上，存在多個與在滑膜組織和血清中觀察到糖鏈結構變化的mmp-3上的jacalin、aba、aca凝集素結合的o-結合型糖鏈，在其他區(qū)域也有存在的可能性。

(1-2)本發(fā)明中的類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物結合性的凝集素

在本發(fā)明中，作為負的糖鏈生物標志物，可以特異性判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的類風濕性關節(jié)炎標志物是“來自于滑膜組織的mmp-3上的凝集素jacalin結合性o-結合型糖鏈”。另外，“凝集素”被定義為“特異性地識別糖鏈并結合、形成交聯的蛋白質”，本發(fā)明所使用的jacalin、aba、aca和acg都是凝集素的一種。

本發(fā)明的識別糖鏈標志物的凝集素“jacalin”是指從菠蘿蜜(學名：artocarpasintegliforia)的種子分離的凝集素，屬于jacalin相關凝集素家族。已知在gal上具有單糖特異性(根據凝集素前沿數據庫(lfdb))。

jacalin可以通過將菠蘿蜜的種子破碎后提取進行純化，也可以使用已知的堿基序列通過基因重組技術由大腸菌宿主等大量生產。就本發(fā)明的實施例而言，使用vector公司制非綴合(uncongugated)jacalin(商品編號l-1150)和生物素化(biotinylated)jacalin(商品編號b-1155)、或包含jacalin的凝集素芯片(商品名“l(fā)ecchip^tm(glycotechnica公司制)”)。

另外，用于類風濕性關節(jié)炎診斷的在類風濕性關節(jié)炎疾病活動性分析中使用的其他凝集素中，aba是從雙孢蘑菇(學名：agaricusbisporus)分離的凝集素，是對gal和glcnac具有特異性的凝集素；aca是從莧科的莧屬(學名：amaranthus)的種子分離的凝集素，是對galnac具有特異性的凝集素；acg是從茶樹菇(學名：agrocybecylindracea)分離的屬于半乳糖凝集素家族的凝集素(根據凝集素前沿數據庫(lfdb))。

aba、aca和acg都可以由其來源的植物或蘑菇提取，另外也可以由各堿基序列信息(各數據庫的編號)利用基因重組技術進行合成，aba來自于日本wako社(重組蛋白)和日本mbl社(來自于天然)等，aca來自于日本vector社(來自于天然)等，另外，重組acg來自于日本wako社等，分別都是在市場上銷售的，配置有這些aba、aca和acg的凝集素芯片也以商品名“l(fā)ecchip^tm”由日本glycotechnica社在市場上銷售。就本發(fā)明的實施例而言，使用“l(fā)ecchip^tm”。

(1-3)關于成為本發(fā)明的糖鏈生物標志物的糖鏈抗原表位

成為本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎診斷用的負的糖鏈生物標志物的糖鏈抗原表位是mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈。而且，可以認為，在mmp-3的酶活性結構域(結合結構域)和與血紅素結合蛋白樣結構域緊密相連的鉸鏈區(qū)(連接結構域)上存在多個該o-結合型糖鏈，可以認為，存在多個該o-結合型糖鏈，使得凝集素之間在反應性上產生很大不同。

另外，jacalin與在肽鏈的ser/thr上結合的o-結合型糖鏈的核心結構-1(核心1)“gal(β1,3)galnac”或tn抗原(galnac)進行配位，已知，通過向它們的galnac的第6位導入唾液酸(neunac)的修飾而使識別被消除。也就是說，可以認為，jacalin信號量的減少對應于對上述糖鏈骨架的“galnac”的第6位的唾液酸的修飾率增加的狀態(tài)。另外，jacalin是由于對galnac的α2,6唾液酸修飾從而結合性降低的代表性的實例，如果是具有同樣特征的凝集素和糖鏈識別抗體或者糖鏈識別肽、糖鏈識別適體，也是可以替代使用的。

進一步地，如果一并考慮可以識別或允許修飾核心1的“gal”和“galnac”的任何一種的唾液酸的aba和aca的信號與mmp-3值的行為一致，可以認為，按照發(fā)明人的凝集素芯片分析數據，健康個體的mmp-3的連接結構域上的o-結合型糖鏈為以核心1為母骨架，僅是“gal”和“galnac”的gal被唾液酸(neunac)修飾或者都被唾液酸(neunac)修飾，如果罹患類風濕性關節(jié)炎，則對應于類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的增高，漸漸地唾液酸(neunac)的導入率增加，未對第6位修飾的“galnac”的量逐漸消失。

根據對mmp-3使用唾液酸酶的唾液酸切斷實驗的結果(圖9)，mmp-3所具有的主要的o-結合型糖鏈的結構是核心1結構(gal(β1,3)galnac)，可以理解為，對gal幾乎都進行了α2,3唾液酸的修飾。而且，對galnac的α2,6唾液酸修飾的程度，就健康個體而言是低頻率的，得到以下結論：隨著類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性增高，其修飾程度持續(xù)增大。

由此證實，核心1結構中的對galnac的α2,6唾液酸修飾程度成為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的標志物，并且，來自于jacalin的信號成為負的活動性標志物，同時，連同來自于aba和aca的信號一起，來自于acg的信號也與血清中的mmp-3的量顯示同樣的行為。

也就是說，成為本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎活動性的判定用標志物的糖鏈抗原表位，可以表達如下。

“糖鏈抗原表位，其特征在于：其為mmp-3上的o-結合型糖鏈，是jacalin非結合性的。”或者

“糖鏈抗原表位，其特征在于：其為mmp-3上的o-結合型糖鏈，在mmp-3的肽鏈中的ser/thr上結合的galnac由α2,6唾液酸進行修飾?！?/p>

而且，這表示，不僅是jacalin，只要是識別在mmp-3上的ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈、且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的物質，都可以作為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑使用。

具體而言，可以使用對在mmp-3的肽鏈中的ser/thr上結合的galnac的α2,6唾液酸的修飾識別并結合的凝集素、糖鏈識別抗體、糖鏈識別肽、糖鏈識別適體等。相反，識別在mmp-3上的ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的物質，即從識別含有在ser/thr上結合的αgalnac的糖鏈且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的糖鏈識別抗體、結合性凝集素、糖鏈識別肽和糖鏈識別適體中選擇的物質，同時也可以作為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑使用。后者的典型的實例是在本實施例中使用的jacalin。

2.本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定方法

(2-1)用于判定本發(fā)明的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的標志物

本發(fā)明的特征在于：為了判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性，測定在受試血液試樣中的mmp-3上的o-結合型糖鏈的糖鏈結構的變化。

為此，成為類風濕性關節(jié)炎活動性的判定用標志物的正的糖鏈抗原表位可以表達如下。

“糖鏈抗原表位，其特征在于：其為mmp-3上的o-結合型糖鏈，并且是jacalin非結合性的。”或者

“糖鏈抗原表位，其特征在于：其為mmp-3上的o-結合型糖鏈，在mmp-3的肽鏈中的ser/thr上結合的galnac由α2,6唾液酸進行修飾。”

而且，通過將該糖鏈抗原表位進行檢測和定量，可以判定是否罹患類風濕性關節(jié)炎以及類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的程度。

特異性地識別該糖鏈抗原表位的物質，即，從特異性地識別在ser/thr上結合的galnac被α2,6唾液酸修飾的o-結合型糖鏈的糖鏈識別抗體、結合性凝集素、糖鏈識別肽和糖鏈識別適體中選擇的物質，成為用于檢測和定量該糖鏈抗原表位的類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑。

相反，識別在mmp-3上的ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的物質，即，從識別在ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的糖鏈識別抗體、結合性凝集素、糖鏈識別肽和糖鏈識別適體中選擇的物質，同時也可以作為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑使用。后者的典型的實例是在本實施例中使用的jacalin。在以下的分析方法中，主要使用jacalin進行說明，然而并不限于jacalin。

同時，從受試血液試樣等受試體液試樣制備的mmp-3且具有多個jacalin非結合性的o-結合型糖鏈的mmp-3本身，即，具有多個在肽鏈中的ser/thr上結合的galnac被α2,6唾液酸修飾的o-結合型糖鏈的mmp-3本身成為類風濕性關節(jié)炎活動性的判定用標志物。

為了檢測或定量這樣的mmp-3，可以使用與上述糖鏈抗原表位同樣的分析方法。

而且，為了判定受試血液試樣等受試體液試樣中的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性，在測定糖鏈結構的變化時，將顯示受試血液試樣中的mmp-3總量的測定信號乘以顯示mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號的倒數，或者，前述糖鏈結構的變化的測定是將顯示受試體液試樣中的mmp-3總量的測定信號的倒數乘以顯示mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號，可以對下述糖鏈修飾判別指數x或y進行計算。

另外，糖鏈修飾判別指數(x或y)可以定義為：“具有類似的特異性的多個凝集素組，特別是對于某種母骨架糖鏈結構(例如就本發(fā)明而言，是核心1結構)修飾的成分(例如唾液酸或脫氧己糖等)、方式(在哪個糖鏈上在哪個位置)、比例不同的情況下，各凝集素的結合的強度不同。在該結合強度可以轉換為能夠定量的信號的情況下，通過將它們組合進行公式化，可用于對母骨架的修飾狀態(tài)進行比較評價的指數”。

x＝顯示受試體液試樣中的mmp-3總量的測定信號/顯示同一mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號；

y＝顯示受試體液試樣中的mmp-3上的jacalin結合性o-結合型糖鏈總量的測定信號/顯示同一mmp-3總量的測定信號。

此時，糖鏈修飾判別指數x的值越高，可以判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性越高；相反，糖鏈修飾判別指數y的值越高，可以判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性越低。

為了判定受試者是否罹患類風濕性關節(jié)炎或者判定特定時期的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性，優(yōu)選設置下述工序：設定健康個體中的基準值(x0)或(y0)，使用來自于受試者的體液試樣進行測定，將計算的x和y進行比較。

在x高于基準值x0(x>x0)的情況下，判定類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性高或正在罹患類風濕性關節(jié)炎的工序；或者，在y低于基準值y0的情況下(y<y0)，判定為類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性高或正在罹患類風濕性關節(jié)炎。

經時性地觀察受試者，也可以判定受試者的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的經時性的病情變化。

在此情況下，優(yōu)選設置下述工序：使用來自于受試者的體液試樣進行測定，將計算出的x’和y’與對同一受試者的檢測日以前的體液試樣計算出的值(x’0)或x’0)進行比較。對于x’在出現比檢測日以前高的數值的情況下(x’>x’0)、對于y’在出現比檢測日以前低的數值的情況下(y’<y’0)，判定受試者的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性惡化；在出現低的數值的情況下(x’<x’0)或出現高的數值的情況下(y’>y’0)，判定疾病活動性改善。

通過使用來自于類風濕性關節(jié)炎治療后的受試者的體液試樣與治療前的體液試樣進行比較，可以判定治療效果。

在此，作為受試體液試樣中的“顯示mmp-3總量的測定信號”，可以使用體液試樣中的mmp-3存在量的測定值或隨著體液試樣中的mmp-3存在量而增減的測定信號。

體液試樣中的mmp-3存在量的測定值是指受試體液試樣中含有的mmp-3存在量的絕對值的測定值，對于本領域技術人員來說，試樣中的mmp-3存在量的測定方法是已知的。具體而言，可以對于mmp-3使用將單克隆抗體包覆在膠乳顆粒上的膠乳凝集法等。

另外，作為受試體液試樣中的“隨著mmp-3存在量而增減的測定信號”，除了使用抗mmp-3抗體(特異性地識別mmp-3的多肽鏈的抗體)測定的信號值以外，還可以優(yōu)選使用與mmp-3值顯示同樣行為的來自于aba、aca或acg的信號量，即，顯示體液試樣中的mmp-3與aba、aca或acg的結合量的測定信號值。另外，不限于aba、aca、acg，只要是被認為與mmp-3的量相關的凝集素，就可以替代使用。

本發(fā)明最優(yōu)選的x和y如下。

x＝來自于受試體液試樣中的aba的測定信號/來自于同一試樣的jacalin的測定信號；

y＝來自于受試體液試樣中的jacalin的測定信號/來自于同一試樣的aba的測定信號。

(2-2)通過凝集素芯片或三明治elisa法的檢測和定量

在本發(fā)明中，將受試試樣使用凝集素芯片或三明治elisa法測定jacalin信號值，通過將其倒數使用同時測定的aba、aca或acg信號值進行修正，可以判定是否罹患類風濕性關節(jié)炎或類風濕性關節(jié)炎疾病活動性。aba、aca或acg信號值可以用mmp-3值代替。

凝集素芯片可以通過下述任意一種方法進行分析：將mmp-3進行熒光標記后加樣于凝集素芯片，進行結合反應后檢測信號的直接法；或者將未標記的mmp-3加樣于凝集素芯片后，使用抗體覆蓋法檢測結合信號的間接法。

在此，作為受試試樣，不只限于從受試者采取的血液得到的血清和血漿，也可以將關節(jié)液(滑液)、胸腔積液、腹水、滑膜液、淋巴液等其他體液試樣作為對象，受試者不受到特別限定，可以廣泛適用于患有或未患有類風濕性關節(jié)炎的人、或者需要判定類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的人。

另外，為了追求受試者的負擔小且檢查時間的縮短，最優(yōu)選將受試者的血液(血清、血漿等)作為受試試樣。

通過本發(fā)明的檢測方法檢測受試試樣中的類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物的減少，可以確切評價類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性。同時，可以確切判定類風濕性關節(jié)炎治療的效果，確定緩解程度。

(2-3)凝集素芯片分析法

含mmp-3組分的濃縮

因為成為本發(fā)明的負相關的(負的)類風濕性關節(jié)炎糖鏈標志物的jacalin結合性糖鏈是mmp-3上的糖鏈，所以在受試者的血液試樣等受試試樣為微量等的情況下，通過使用抗mmp-3抗體的親和柱等的mmp-3濃縮組分，使得更正確地判定類風濕性關節(jié)炎疾病活動性成為可能。

另外，效仿在wo2011/007797中記載的鏈霉親和素包覆磁珠的純化方法，即使使用將抗mmp-3抗體進行生物素化并綴合在鏈霉親和素包覆磁珠上的磁珠，也可以高效率地進行濃縮。就本發(fā)明的實施例而言，使用該磁珠可以得到mmp-3濃縮組分。

標記化

作為標記物質的實例，可以列舉，例如：熒光物質(例如，fitc、羅丹明、cy-3、cy-5)；放射性物質(例如，¹⁴c、³h)；酶(例如，堿性磷酸酶、過氧化物酶(辣根過氧化物酶等)；葡糖氧化酶；β-半乳糖苷酶)等。同時，也可以利用生物素和(鏈霉)親和素的結合。將檢測劑使用生物素進行標記，將(鏈霉)親和素以上述標記物質進行標記，可以利用生物素和(鏈霉)親和素的結合進行檢測。

在作為標記物質使用酶的情況下，根據所使用的酶，使用適當的底物進行檢測。例如，在作為酶使用過氧化物酶的情況下，作為底物，使用鄰苯二胺(opd)、四甲基聯苯胺(tmb)等；在使用堿性磷酸酶的情況下，作為底物，使用對硝基苯磷酸鹽/酯(pnpp)等。對于酶反應終止液、底物溶解液，可以根據所選擇的酶，從以往公知的溶液中適當選擇。凝集素芯片的配制

作為凝集素芯片，使用包含jacalin凝集素以及aba、aca和acg的任一凝集素的任何形式的凝集素芯片即可。例如，可以使用本發(fā)明人開發(fā)的特異性不同的45種植物凝集素在同一基板上固定化的凝集素芯片(非專利文獻16)或lecchip^tmver.1.0(日本グライコテクニカ社制)，也可以按照適當的公知方法進行配制。

在凝集素芯片中，與jacalin凝集素一起，可以僅包含aba、aca和acg的任一凝集素即可，然而，優(yōu)選包含全部aba、aca和acg凝集素，進一步優(yōu)選將多種其他凝集素在支承體上進行固相化。作為此時的其他凝集素，可以列舉：mah凝集素、mal凝集素、wga凝集素等。

可以將jacalin和其他凝集素直接在支承體上進行固相化(直接法)，然而，通過將jacalin等制成生物素化jacalin等，以在鏈霉親和素包覆的支承體上以固相化的形態(tài)進行配制(間接法)，可以大幅增進檢測靈敏度的提高和背景的減少。

作為凝集素芯片的支承體，只要是倏逝波可以透過的透明物質即可，一般可以使用載玻片、聚碳酸酯等合成樹脂等。

對凝集素芯片的添加和清洗

將用cy-3等標記的受試試樣使用緩沖液稀釋或不稀釋，添加至凝集素芯片反應槽，使之相互作用后，將非特異性結合的夾雜物使用凝集素芯片用緩沖液(市售)進行清洗。另外，在使用倏逝波檢測的情況下，也可以省略清洗工序。

檢測方法

一般而言，與抗原抗體反應的結合相比，凝集素對糖鏈的結合一般較弱，抗原抗體反應的結合常數為10⁶～10⁹m^-1左右，相對于此，凝集素和糖鏈間的結合常數被認為是10⁴～10⁷m^-1，所以在凝集素的糖鏈結合信號的檢測中，通常優(yōu)選使用倏逝波激發(fā)型熒光檢測法進行，在本發(fā)明中也優(yōu)選使用倏逝波激發(fā)型熒光檢測法。倏逝波激發(fā)型熒光檢測法是指利用下述現象的方法：在載玻片的端面(側面)以發(fā)生全反射的條件將光入射，則在玻璃(固相)和水(液相)等折射率不同的兩相之間的情況下，僅在離界面數百納米左右的近場，被稱為倏逝波的射程距離極短的光(被稱為近場光)滲出。根據該方法，將熒光物質的激發(fā)光從端面入射，僅激發(fā)在近場存在的熒光物質，進行熒光觀察。倏逝波激發(fā)型熒光檢測法記載于非專利文獻16等。在該檢測中，可以使用glycostation^tmreader1200(日本モリテックス：グライコテクニカ社)等。

但是，在本發(fā)明中成為檢測對象的jacalin等凝集素與mmp-3上的o-結合型糖鏈抗原表位的結合性，根據在實施例中的分析結果，結果顯示為可以估算為非常高的結合常數?？梢哉J為，這是被認為存在于mmp-3鉸鏈區(qū)存在多個o-結合型糖鏈而導致的集群效應。在基板上被固定的高密度的凝集素與糖鏈的相互作用被認為是通過集群效應而導致結合常數在2位數以上的效果。同時，因為特別是據說該集群效應具有顯著降低解離速度的效果，因此，可以認為,即使需要清洗工序的檢測體系也可以檢測出來。因此，可以使用包括清洗工序的間接法的抗體覆蓋·凝集素芯片法以及如下文所述的三明治elisa法等抗原抗體反應的檢測體系所使用的一般檢測法。

評價方法

通過凝集素芯片的評價是選擇識別來自于體液例如血清的mmp-3中基本上以一定比例存在的糖鏈的、或與mmp-3的量結合信號值存在相關性的凝集素aba凝集素等，作為內標凝集素，在同一凝集素芯片基板上固定，在將jacalin信號等目的凝集素信號進行相對值化之后，通過判斷超過或不超過某臨界值進行。這樣的以某凝集素的值為基準的目的凝集素的信號進行相對值化以用于判別的方法可以按照本發(fā)明人以前發(fā)表的論文(非專利文獻17)進行。可以使用標本化的多種類風濕性關節(jié)炎患者的體液例如血清預先進行臨界值的設定。也就是說，基于從預先的來自于多名類風濕性關節(jié)炎患者的血清和健康個體血清作為對象的凝集素芯片分析得到的上述相對值，計算后述的糖鏈修飾判別指數(x或y)。更優(yōu)選預先作成多名對應于類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的程度的糖鏈修飾判別指數，與來自于受試血液試樣的糖鏈修飾判別指數進行比較，判定受試者的類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的程度，判定受試者是否罹患類風濕性關節(jié)炎，另外，判定類風濕性關節(jié)炎疾病活動性為何種程度。

(2-4)三明治法

就三明治法而言，使jacalin等凝集素的任一種以及抗mmp-3抗體結合在固相上。以下，將固相化的結合物質稱為“捕捉劑”，將對方物質稱為“檢測劑”。作為將捕捉劑固相化的支承體(固相)，可以列舉：平板(例如，微孔板)；微芯片基板(例如，微芯片用載玻片)；管；珠(例如，塑料珠、磁珠)；色譜法用載體(例如，sepharose(商標)；膜(例如，硝化纖維素膜、pvdf膜)；凝膠(例如，聚丙烯酰胺凝膠)等。其中，優(yōu)選使用平板、珠和膜，從處理的簡便性來看，最優(yōu)選使用平板。可以通過只要能得到充分的結合強度的任意方法對捕捉劑進行固相化，例如，通過共價鍵、離子鍵、物理吸附等進行固相化?；蛘撸部梢允褂妙A先將捕捉劑進行了固相化的支承體。

檢測劑也可以通過間接的或直接的標記物質進行標記。作為標記物質的實例，可以列舉，例如：熒光物質(例如，fitc、羅丹明、cy-3、cy-5)；放射性物質(例如，¹³c、³h)；酶(例如，堿性磷酸酶、過氧化物酶(辣根過氧化物酶等)、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶)等。同時，也可以將檢測劑進行生物素標記，將(鏈霉)親和素使用上述標記物質進行標記，將生物素和(鏈霉)親和素結合使用。

在作為標記物質使用酶的情況下，根據使用的酶，使用適當的底物進行檢測。例如，在作為酶使用過氧化物酶的情況下，作為底物，使用鄰苯二胺(opd)、四甲基聯苯胺(tmb)等；在使用堿性磷酸酶的情況下，作為底物，使用磷酸對硝基苯鹽/酯(pnpp)等。對于酶反應終止液、底物溶解液，可以根據選擇的酶，從以往公知的溶液中適當選擇。

捕捉劑與血液試樣中的mmp-3或者與mmp-3上的jacalin、aba、aca和acg凝集素結合性糖鏈形成復合物。通過測定適用于該復合物的檢測劑所產生的信號，對血清中的mmp-3上的jacalin、aba、aca和acg凝集素結合性糖鏈進行檢測·定量。利用與所使用的標記物質相應的適當的測定裝置進行信號的測定即可。

作為本發(fā)明的用于測定jacalin結合性糖鏈抗原表位的三明治法，具體而言，是在支承體上將包含jacalin在內的多種凝集素進行固相化，添加受試試樣，進行反應，由此提示在反應場上與該凝集素結合的mmp-3，對此可以通過使標記的該mmp-3結合物質發(fā)生作用進行檢測。使用的多種凝集素可以在同一支承體上排列(芯片化)，也可以在各自不同的支承體上固定并進行并行測定。此時，代替將jacalin等凝集素直接在支承體上進行固相化的方法(直接法)，通過將jacalin等凝集素分別進行生物素化，以將該生物素化的凝集素在鏈霉親和素包覆的支承體上以固相化的形態(tài)進行配制的方法(間接法)，可以大幅增進檢測靈敏度的提高和背景的減少。

作為其他方法，將mmp-3結合物質在支承體上進行固相化，通過添加受試試樣進行反應，使mmp-3在結合物質上以覆蓋mmp-3的形態(tài)的進行準備之后，可以通過標記化的jacalin凝集素和其他標記凝集素，檢測與該凝集素顯示反應性的mmp-3。

在本發(fā)明的jacalin結合性糖鏈含量的測定中，可以使用elisa、免疫色譜法、放射免疫分析(ria)、熒光免疫分析(fia法)、化學發(fā)光免疫分析、倏逝波分析法等。這些方法是本領域技術人員所公知的，選擇任意一種方法即可。同時，這些方法按照通常的步驟實施即可，實際的反應條件的設定等在本領域技術人員通常可以進行的技術范圍內。其中，特別優(yōu)選使用凝集素·抗體三明治elisa，該方法使用抗mmp-3抗體作為mmp-3結合物質。

受試血液試樣等受試體液試樣中的具有jacalin結合性糖鏈的mmp-3與作為捕捉劑使用的支承體上的jacalin等凝集素或者抗mmp-3抗體形成復合物。通過測定在該復合物上使用檢測劑標記化凝集素或者標記化抗mmp-3抗體而產生的信號，對受試試樣中的jacalin結合性糖鏈進行檢測·定量。利用與所使用的標記物質相應的適當的測定裝置進行信號的測定即可。

在將受試者的血液試樣作為受試試樣的情況下，例如可以通過以下步驟進行三明治elisa分析。

含有標記化的受試試樣的制備方法與(2-2)的凝集素芯片分析法相同。

接著，例如，在以鏈霉親和素包覆的elisa平板的各孔中，使生物素化jacalin結合，添加受試血液試樣或其mmp-3組分，使之與試樣中的mmp-3進行相互作用。接著，以緩沖液清洗或不清洗，使用未反應的jacalin作為封閉劑進行封閉，使標記mmp-3抗體進行反應。

另外，在三明治elisa中，優(yōu)選與jacalin以外的aba、aca或acg凝集素等其他凝集素并用，這與在凝集素芯片分析的情況一樣。

進一步地，代替凝集素包覆elisa平板，可以使用將抗mmp-3抗體在支承體上進行固相化的抗體包覆elisa平板。在此情況下，添加受試血液試樣進行抗原抗體反應后，可以使標記化的jacalin和其他標記化凝集素(aba、aca或acg)進行反應，測定各自的信號值。

類風濕性關節(jié)炎性活動性標志物的檢測和判別方法

elisa法是公知的方法，按照通常的步驟實施即可，可以根據標志物使用最適合的測定裝置。

根據本法的類風濕性關節(jié)炎標志物的定量性的檢測，可以從血清等進行配制，將蛋白質量公知的jacalin結合性mmp-3作為標準物質使用，作成標準曲線，作為標準物質的相當量進行換算。在標準物質中，如果確認與jacalin具有結合性，也可以是重組mmp-3。例如，如實施例1所述，可以使用在小鼠骨髓瘤細胞(n0細胞)大量表達并純化的市售重組mmp-3(r&dsystems公司制，產品編號513-mp-010)作為標準物質使用。同時，作為不使用標準物質的評價方法，效仿上述凝集素芯片法，可以將根據病變信號不發(fā)生變動的凝集素作為內標凝集素使用，在將jacalin信號進行相對值化之后，進行超過或不超過某臨界值的判斷。另外，可以使用多名判明疾病活動性的類風濕性關節(jié)炎患者的血液試樣事先進行內標凝集素的選擇以及臨界值的設定。也就是說，可以根據將預先從多名疾病活動性不同的患者采取的血液試樣作為對象的凝集素芯片分析，通過統計學事先設定內標。同時，以通過將預先從多名疾病活動性不同的患者采取的血液試樣作為對象的elisa測定得到的上述相對值作為基礎作成判別公式。更優(yōu)選對應于類風濕性關節(jié)炎的進行或疾病活動性惡化的程度作成多個判別公式，判定受試血液試樣的類風濕性關節(jié)炎的進行或疾病活動性惡化程度，判定受試者是否罹患類風濕性關節(jié)炎性，另外判定類風濕性關節(jié)炎疾患活動性的階段是哪種程度。

例如，在作為內標凝集素使用aba的情況下，使用分別將40μl血液試樣使用以mmp-3-aba、mmp-3-jacalin制成的三明治測定的數值，判定mmp-3-aba/mmp-3-jacalin比值小于2為緩解，2以上且小于3為低疾病活動性，3以上且小于8為中疾病活動性，8以上為高疾病活動性。

另外，也可以將elisa測定替換為微芯片或基于spr等不同的相互作用分析原理的測定方法。在此情況下，因為這些都是公知的方法，所以按照通常的步驟實施即可，可以根據方法使用最合適的測定裝置。

3.類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性的判定用試劑盒

可以將識別在mmp-3上的ser/thr上結合的含有αgalnac的糖鏈、且不識別在該αgalnac上結合了α2,6唾液酸的糖鏈的物質、優(yōu)選將jacalin作為類風濕性關節(jié)炎的疾病活動性判定用試劑的有效成分使用。

進一步地，對于血液試樣中的mmp-3，依賴于mmp-3存在量與mmp-3特異性結合的物質，具體而言，可以將從aba、aca和acg中選擇的凝集素或抗mmp-3抗體進行組合，作為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性判定用試劑盒使用。

本發(fā)明的活動性的判定用試劑盒，例如可以是下述組合。

(1)(a)將包含jacalin作為必需凝集素以及進一步優(yōu)選包含aba、aca或acg的至少一種的多種凝集素直接或者通過生物素-親和素間接地進行結合的支承體；和

(b)可以標記受試血液試樣中的mmp-3的標記物質。

(2)(a)將包含jacalin作為必需凝集素以及進一步優(yōu)選包含成為內標凝集素的aba、aca或acg的至少一種的多種凝集素直接或者通過生物素-親和素間接地進行結合的支承體；和

(b)標記化的抗mmp-3抗體。

(3)(a)將抗mmp-3抗體直接或者通過生物素-親和素間接結合的支承體；和

(b)包含標記化的jacalin以及進一步優(yōu)選包含aba、aca或acg的至少一種的多種標記化的凝集素。

此時，能夠以一個支承體固定多種凝集素，也可以分別將各凝集素固定于不同支承體使用。

本發(fā)明的診斷用試劑或診斷用試劑盒可以用于希望獲知是否罹患類風濕性關節(jié)炎的受試者，特別用于判定是否罹患與變形性關節(jié)病等顯示類似癥狀的早期類風濕性關節(jié)炎。此時，可以預先將使用健康個體和/或類風濕性關節(jié)炎患者所得到的測定值作為基準值。

同時，在類風濕性關節(jié)炎患者中，可以用于正確把握經時性的疾病活動性的病態(tài)變化。

并且，可以用于客觀地判定在接受類風濕性關節(jié)炎治療的患者中的該治療的效果。特別是，用于判定是否緩解，即是否不需要繼續(xù)治療。4.類似的類風濕性疾病的正確診斷方法以及用于該方法的診斷用試劑盒

根據本發(fā)明，受試體液試樣(血清試樣等)中的mmp-3上的lel或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素反應性糖鏈與類風濕性疾病中特別是在復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)患者體液試樣的反應性具有極高的顯著差異；接著，與類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)患者體液試樣的反應性，與類風濕性關節(jié)炎(ra)患者以及與健康個體(hc)體液試樣的反應性顯示具有高的顯著性差異。

也就是說，抗mmp-3抗體與lel和/或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素進行組合的試劑盒成為復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)診斷用試劑盒和/或類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)診斷用試劑盒。

在此，lel凝集素作為來自于番茄(lycopersiconesculentum)的glcnac反應性凝集素、stl凝集素作為來自于馬鈴薯(solanumtuberosum)的glcnac反應性凝集素以前為人們所熟知，可以認為，兩種凝集素識別多聚乳糖胺結構的glcnac。另外，關于lel凝集素的其他信息詳細記載于本發(fā)明人的文獻(methodsinenzymology,vol.479,2010,p.185-204)；同時，關于stl凝集素的其他信息詳細記載于本發(fā)明人的文獻(methodsinenzymology,vol.478,2010,p.181-195)。

同時，作為其他識別多聚乳糖胺結構的凝集素，已知有galectin-3等。

作為具體的受試體液試樣(血清試樣等)中的mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈等的測定方法，使用前述(2-3)中記載的凝集素芯片法，可以將受試血清試樣等受試體液試樣使用包含對mmp-3濃縮組分的lel和/或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素的凝集素芯片進行測定的方法。

同時，使用在前述(2-4)中記載的三明治法，將受試血清試樣等受試體液試樣使用抗mmp-3抗體以及l(fā)el和/或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素的三明治法，例如有：將標記抗mmp-3抗體與包含lel和/或stl凝集素的凝集素芯片進行組合而成的三明治elisa法等。

通過使用該測定方法，可以特異性地診斷復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)和/或類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)。

通過在上述抗mmp-3抗體與lel和/或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素進行組合的試劑盒中，進一步將jacalin、acg等mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素進行組合，可以提供能夠分別顯著識別類似的類風濕性疾病的類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)、復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)和類風濕性關節(jié)炎(ra)用的診斷用試劑盒。在此，在敘述“mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素”時，是指在前述(1-2)中記載的通過與類風濕性關節(jié)炎(ra)血清中的mmp-3濃縮組分的結合性已得到確認的jacalin、aba、aca和acg。另外，也可以使用其他例如識別唾液酸核心1結構的mah凝集素等。

包括下述工序的方法成為類風濕性關節(jié)炎(ra)的正確診斷方法以及與類似的類風濕性疾病的鑒別方法：計算與受試體液試樣(血清試樣等)中的mmp-3上的lel或stl凝集素反應性糖鏈的反應性信號以及與jacalin、acg等mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素的反應性信號之比的工序。

具體而言，適用前述(2-3)中記載的凝集素芯片法，可以使用：將受試血清試樣等受試體液試樣的mmp-3濃縮組分使用包含lel和/或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素以及jacalin、acg等mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素的凝集素芯片進行測定的方法。

同時，使用前述(2-4)中記載的三明治法，將受試血清試樣等受試體液試樣，使用抗mmp-3抗體和lel和/或stl凝集素等識別多聚乳糖胺結構的凝集素以及進一步的jacalin、acg等的mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素的三明治法，例如有：將標記抗mmp-3抗體以及包含lel和/或stl凝集素連同jacalin、acg等mmp-3上的o-結合型糖鏈識別凝集素的凝集素芯片組合而成的三明治elisa法等。

實施例

顯示以下實施例，對本發(fā)明具體進行說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。

本發(fā)明中的其他用語和概念是基于該技術領域慣常使用的用語的意義。為了實施本發(fā)明而使用的各種各樣的技術，尤其是除了明示其出處的技術以外，只要是本領域技術人員均是基于公知的文獻等就可以容易且可靠地實施。同時，各種分析等可以根據所使用的分析儀器或試劑、試劑盒的使用說明書、目錄等記載的方法進行。

另外，在本說明書中引用的技術文獻、日本專利公報和日本專利申請說明書中的記載內容作為本發(fā)明的記載內容進行參考。

同時，在各實施例中使用的所有的體液(血清和滑液)，來自于在采集場所臨床機構獲取知情同意的患者且接受了發(fā)明人各自所屬機構的倫理審查并獲得批準。

實施例1：受試血清試樣中的mmp-3存在量的測定

就本實施例而言，收集了類風濕性關節(jié)炎患者32個病例和其他關節(jié)炎4個病例的血清，以其中30個病例作為對象。

血清中mmp-3的簡易分級、濃縮(富集)是基于本發(fā)明人以前開發(fā)的方法(非專利文獻14)，與以往發(fā)明人分析的蛋白質進行比較，為血中濃度非常低的mmp-3蛋白質進行了條件的最優(yōu)化，如下進行。

(1-1)預清洗工序：

在血清中含有的蛋白質中，進行對利用抗原抗體反應場的磁珠非特異性地結合的物質的預先除去作業(yè)(預清洗)。也就是說，對于1.5ml容量的管分離的血清40μl，加入預先使用反應緩沖液(含有1％tritonx-100的tris緩沖的生理鹽水(tbstx))清洗過3次的鏈霉親和素固定化磁珠(sa珠)溶液(日本多摩川精機社制，10mg/ml)10μl和反應緩沖液36μl進行溶液調整，在4℃振蕩反應30分鐘。反應后，使用磁石將磁珠捕捉到一處，將得到的上清回收于另一1.5ml容量的管。

免疫沉降工序：

向回收的上清中，加入生物素化mmp-3抗體(r&dsystems公司制)(50μg/ml)4μl，一邊在4℃振蕩一夜、一邊進行抗原抗體反應。反應后，加入使用反應緩沖液清洗過的sa珠溶液(10mg/ml)10μl，在4℃進行振蕩反應30分鐘。通過磁石回收與抗原-抗體復合物結合的磁珠，除去得到的上清后，將珠使用反應緩沖液200μl清洗3次。在使用磁石回收珠時，為了完全除去珠和珠之間夾雜的被非特異性回收的蛋白質雜質的清洗如下：向磁珠加入反應緩沖液，然后使用超聲波分散裝置(日本多摩川精機社制)和破碎·離心多功能一體機bugcrasher(日本タイテック社制)等，實現將珠完全分散。

(1-3)洗脫工序：

為了洗脫在珠上通過抗體間接捕捉的mmp-3，向洗凈的珠中加入含有0.2％sds的tbs10μl，在95℃加熱5分鐘滅活抗體，使mmp-3游離。使用磁石將磁珠捕捉在一處，回收得到的上清。

(1-4)生物素標記抗體除去工序：

在所得到的上清中，不僅是mmp-3，還并存滅活的抗mmp-3抗體。因為該抗體被生物素標記，所以容易通過sa珠捕捉。于是，向1.5ml容量的管加入洗脫液和預先用反應緩沖液清洗了3次的sa珠(20mg/ml)10μl，在4℃進行生物素-親和素反應30分鐘，反應后迅速用磁石將磁珠捕捉至一處?；厥盏玫降纳锨?，作為mmp-3-ip產物(20μl)。

(1-5)結果：

為了估算各樣品的回收量，使用上述生物素標記抗體進行蛋白質印跡(wb)。預先使用市售的重組型人mmp-3(rmmp-3，r&dsystems公司制)，通過wb計算該蛋白質的檢測下限，其結果為50pg。于是，將rmmp-350pg、100pg、200pg、400pg作為標準物質，與樣品一起加樣至凝膠，通過進行wb，對各樣品中mmp-3的量進行半定量分析。另外，分別將0.1μl樣品加樣至凝膠。

其結果，因為有些樣品在超過了rmmp-3加樣400pg時的條帶強度，所以分別適當稀釋，再次進行wb。其結果記錄于圖1。

因為各樣品的條帶信號落于標準物質的信號范圍內，所以由標準物質的信號作成標準曲線，作為rmmp-3換算計算各樣品的血中濃度。各自的換算濃度表示于圖2。

為了驗證富集的妥當性，與在臨床現場測定的mmp-3值進行比較，結果顯示強的相關性(圖2右)。這暗示，通過富集得到的mmp-3的量依賴于在血中存在時的濃度。

另外，將此次計算的數值與臨床現場進行通常測定的值進行比較，結果有很大的偏離，然而，可以認為，這是因為本實施例所使用的標準物質與在臨床現場所用的測定體系所使用的標準物質不同，從而與抗體的反應性不同。

進一步地，此次對來自于市售健康個體血清(日本コージンバイオ社制)的mmp-3也進行同樣的實驗，可以在文獻所報道的健康個體的mmp-3濃度范圍進行回收。

實施例2：通過抗體覆蓋·凝集素芯片的糖鏈譜分析

就本實施例而言，對于在實施例1進行了mmp-3的簡易分級·濃縮(富集)的受試血清試樣mmp-3-ip中的mmp-3，使用通過凝集素芯片的比較糖鏈譜分析，考察伴隨類風濕病的mmp-3上的糖鏈變化。

取在實施例(1-4)得到的各個受試mmp-3-ip試樣2μl，使用作為凝集素芯片反應緩沖液的含有1％tritonx-100的磷酸緩沖的生理鹽水(pbstx)，調整至60μl。將該溶液添加至凝集素芯片(lecchip^tm(日本グライコテクニカ社制))的各反應槽(每片玻璃形成有7個反應槽)，在20℃進行相互作用反應10小時以上。由此，試樣中的mmp-3上的糖鏈與在芯片基板上固定的45種凝集素的結合反應達到平衡狀態(tài)。此后，為了避免檢測用抗體上的糖鏈結合于未反應的基盤上的凝集素從而產生噪聲信號，加入來自于人血清的igg溶液(sigma公司制)2μl(相當于20μg)，反應30分鐘。在進行該封閉反應后，使用60μl的pbstx清洗各反應槽3次后，向pbstx溶液58μl再次加入來自于人血清的igg溶液2μl，進行若干攪拌后，加入相當于100ng的檢測用抗mmp-3抗體(生物素標記物)，在20℃反應1小時?？乖贵w反應后，使用60μl的pbstx清洗各反應槽3次，接著加入含有相當于200ng的cy-3標記鏈霉親和素(日本geヘルスケア社制)的pbstx溶液，進一步在20℃反應30分鐘。反應后，使用60μl的pbstx清洗各反應槽3次后，通過芯片掃描儀glycostation^tm(日本グライコテクニカ社制)進行芯片掃描。

其結果，可以取得mmp-3的糖鏈結構信息。該mmp-3的糖鏈結構信息目前未見報告。取得的信號隨血中mmp-3濃度而增減。在圖3中表示測定的30個病例的數據的典型實例。全部病例中顯示顯著的信號強度的凝集素僅有acg、aba、jacalin、aca四種。另外，acg是識別α2,3唾液酸的凝集素，aba、jacalin、aca是識別詳細的特異性不同的基本上以核心1結構或tn結構為骨架的o-結合型糖鏈的凝集素。

如圖4所示，根據以上結果，設想mmp-3上的糖鏈結構是以核心1結構或tn結構為骨架的o-結合型糖鏈，估計是唾液酸修飾程度不同的結構群。

然后，驗證了各凝集素信號與血中mmp-3的量的相關性。如圖5所示，顯示acg、aba和aca比較強烈相關，jacalin未顯示相關性。在考察o-結合型糖鏈識別凝集素之間的相關性的情況下，也觀察到了這種jacalin的背離(圖6)。這三個o-結合型糖鏈識別凝集素各自特異性存在差異，特別是在核心1結構的galnac上導入α2,6唾液酸(neunac)的修飾的情況下，其允許性不同，其他糖蛋白的分析表明，jacalin的反應性最低(非專利文獻14)。具體而言，jacalin不允許在o-結合型糖鏈的核心1結構的galnac上導入α2,6唾液酸(neunac)的修飾，在aba和aca的情況下，可以允許或者沒有關系。

由以上暗示，與在健康個體血清中也存在的mmp-3的o-結合型糖鏈相比，伴隨罹患類風濕性關節(jié)炎的血中濃度上升的mmp-3上的o-結合型糖鏈對核心1結構的唾液酸修飾、特別是α2,6唾液酸修飾是豐富的。

該現象與mmp-3的量不相關，這很有意思，以后驗證了對于與臨床參數的相關性。

實施例3：取得的數據與臨床參數的比較分析

考察了實施例2所得到的mmp-3上獨特的凝集素信號與臨床參數的相關性。另外，在驗證時，在反映蛋白質上的o-結合型糖鏈的質的變化的糖鏈修飾判別指數x中，使用了x＝aba/jacalin的情況下的值。在驗證了的參數中，與顯示類風濕性關節(jié)炎的活動性的參數的比較表示于圖7。顯示了與除患者vas以外的參數(das28-crp、das28-esr、cdai、sdai、醫(yī)師vas)具有某種程度的相關性。因為迄今為止報道稱mmp-3的量與疾病的活動性的相關程度低，但與上述報道相反，反映其蛋白質上的糖鏈的質的變化的aba/jacalin值與疾病活動性之間存在相關性，這是非常有趣的。

接著，對各患者通過表示類風濕性關節(jié)炎的活動性的3個評價方法(das28-esr、sdai、cdai)劃分為4個階段(緩解、低疾病活動性、中等程度疾病活動性和高疾病活動性)，將活動性和aba/jacalin值的相關性作圖(圖8)。

其結果，糖鏈修飾判別指數aba/jacalin值與疾病活動性指標高度相關(通過斯皮爾曼等級相關系數求出的p值為p＜0.001)。另一方面，對于mmp-3的量也作圖，然而，對于任意一種評價方法都沒有顯示相關性。

從以上的結果可知，首次發(fā)現了將mmp-3上的o-結合型糖鏈的質的變化作為糖鏈修飾判別指數進行定量測量在評價類風濕性關節(jié)炎的活動性中適用的可能性。

為了驗證這樣的糖鏈的質的變化是否是由唾液酸的修飾的方式的差異或比例的變化導致的，對于唾液酸酶消化前后的mmp-3，通過凝集素芯片進行比較分析。

實施例4：對唾液酸酶消化的糖鏈譜的影響

從實施例3的結果可以認為，對于血清中的mmp-3的各凝集素的反應性的變化是由對mmp-3上的o-結合型糖鏈的唾液酸修飾的方式的差異、比例的變化而產生的可能性高。因此，就本實施例而言，選擇在實施例1和實施例2的分析中所使用的受試血清試樣中的糖鏈修飾判別指數(aba/jacalin值)低值組和高值組各6例共計12個病例，在對于各血清試樣將mmp-3上的唾液酸殘基切除的情況下，考察了對糖鏈譜產生的影響。

(4-1)血清中mmp-3的富集

按照實施例1的方法，對于前述選定的12個病例的血清試樣，再次對血清中的mmp-3進行富集，得到12種受試mmp-3-ip試樣。糖鏈修飾判別指數(aba/jacalin值)低值組的樣品名為ra07、ra20、ra31、ra33、ra34、ra35，高值組的樣品名為ra10、ra13、ra14、ra17、ra21、ra24。

(4-2)唾液酸酶消化

將得到的mmp-3-ip溶液20μl中的2μl在唾液酸酶消化中使用。向溶液2μl加入專用的5×反應緩沖液b2μl和唾液酸酶a(皆為prozyme公司制)0.5μl(終濃度：0.125u/ml)，使用超純水配制為10μl。在37℃反應1小時，將唾液酸(α2,3唾液酸和α2,6唾液酸兩種)從mmp-3切除。作為對照，也配制在前述成分中不含有唾液酸酶的反應溶液，同時進行反應。在全部反應結束后，將反應溶液暫時在冰上靜置。將由此得到的溶液作為唾液酸酶消化產物。

(4-3)通過抗體覆蓋·凝集素芯片法的糖鏈譜分析

通過與實施例1同樣的方法進行抗體覆蓋·凝集素芯片法。另外，唾液酸酶反應溶液在預先以pbstx配制使總容量成為60μl后使用于凝集素芯片分析。

其結果顯示于圖9。在切斷唾液酸后，使用識別o-結合型糖鏈上的唾液酸的凝集素(acg、mah)，信號幾乎是0。同時，在所有樣品中，出現了完全不允許唾液酸修飾的核心1結構識別凝集素pna的信號。另一方面，識別tn結構的凝集素hpa、vva和gali在唾液酸消化后也沒有得到信號。

通過以上內容可以解釋為：mmp-3所具有的主要的o-結合型糖鏈的結構是核心1結構(gal(β1,3)galnac)，對gal的α2,3唾液酸的修飾幾乎都已經完成。而且，可以得出下述結論：對galnac的α2,6唾液酸修飾的程度以低頻率進行，其比例隨著病態(tài)發(fā)生變化。由此，核心1結構中的對galnac的α2,6唾液酸修飾程度成為類風濕性關節(jié)炎疾病活動性的標志物，并且來自于jacalin的信號成為負的活動性標志物，同時，連同來自于aba和aca的信號，來自于acg的信號也同時證實了與血清中的mmp-3的量顯示同樣的行為?？傊鳛樵谔擎溞揎椗袆e指數x或y的計算中使用的“顯示受試血清試樣中的mmp-3總量的測定信號”，可以使用：mmp-3存在量的測定值；通過抗mmp-3抗體測定的信號值；顯示血清試樣中的mmp-3與從aba、aca和acg中選擇的任意一種凝集素的結合量的測定信號值。

同時，因為唾液酸消化后的aba標準化糖鏈譜幾乎一致，所以暗示，根據樣品不同而產生的反應性的區(qū)別起因于唾液酸的修飾的方式和程度(參見圖9中右圖所示的設想的反應前后的結構變化)。

實施例5：滑液中mmp-3的糖鏈譜分析

從成為病變部位的滑膜組織產生的mmp-3向滑液中釋放，從而參與骨破壞。其中一部分向血中移動，以在血清中的mmp-3的量與在滑膜組織的產生量具有相關性為前提，可以考慮將以前血清中的mmp-3的量作為標志物使用。然而，在實施例2中經凝集素芯片分析的可觀察到與類風濕性關節(jié)炎活動性相關的血清中的mmp-3上的o-結合型糖鏈上的唾液酸的修飾的方式、程度的變化是否正確地反映在滑膜組織產生的mmp-3上的糖鏈結構的變化，這只是推測。

因此，就本實施例而言，通過考察向滑液中釋放的mmp-3是什么樣的糖鏈譜，驗證了血中mmp-3的糖鏈變化與類風濕性關節(jié)炎活動性的關聯的妥當性。

(5-1)滑液中mmp-3的富集

按照實施例1的方法，對于類風濕性關節(jié)炎(ra)3個病例、變形性關節(jié)病(oa)3個病例，從滑液將mmp-3進行富集。另外，因為在ra和oa中，滑液中的mmp-3的量有很大的不同，所以預先測定滑液中的mmp-3的量，利用同樣的mmp-3的量進行富集。其結果，如圖10所示，取得的mmp-3的量幾乎是一樣的。

(5-2)通過抗體覆蓋·凝集素芯片的糖鏈譜分析

抗體覆蓋·凝集素芯片按照與實施例2同樣的方法進行。其結果表示于圖11。

非常有意思的是，ra和oa的mmp-3的糖鏈譜存在很大不同。而且，與血清中的mmp-3同樣，其差異可以通過4種凝集素進行說明。來自于ra患者的mmp-3相對來說具有jacalin信號弱、acg信號強的趨勢(圖12)。該jacalin信號的趨勢與伴隨由類風濕性關節(jié)炎患者血清得到的疾病活動性的jacalin信號的減弱是一致的。

通過以上內容，暗示滑膜細胞伴隨著活化使mmp-3的釋放量增加，由于活化在細胞的糖鏈合成機制上產生變化，作為其結果，蛋白質上的o-結合型糖鏈的唾液酸修飾、特別是α2,6唾液酸的修飾產生變化，成為高度修飾。同時，證實了在實施例2和實施例3的受試血清試樣中得到的知識正確地反映了從滑膜組織產生的mmp-3上的糖鏈結構的變化。

實施例6：mmp-3陽性疾病的鑒別能力

(6-1)與使用來自于其他類風濕性疾病患者的血清的mmp-3上的jacalin等o-結合型糖鏈的反應性比較

就本實例而言，以類風濕性關節(jié)炎患者(ra)14例、類風濕性多發(fā)肌痛癥患者(pmr)8例、復發(fā)性多發(fā)軟骨炎患者(rp)7例、健康個體(hc)5例的血清為對象，進行了實施例1和實施例2的驗證。ra、pmr、rp都是血清mmp-3容易成為高值的疾病。在臨床診斷上，費心鑒別ra和pmr的情況很多，rp是臨床癥狀比較具有特征的疾病，然而不存在靈敏度高的檢查方法。具體而言，從上述各對象疾病的患者血清使用與實施例1同樣的方法將mmp-3進行濃縮，使用與實施例2同樣的方法進行來自于各疾病的mmp-3的糖鏈譜分析。

其結果，可以取得各疾病中的糖鏈結構信息。從所得到的所有患者的數據來看，首先將acg、aba、aca和jacalin值進行比較研究，其結果，如圖13所示，以實施例1(1-1)中作為對象的風濕病患者血清的結果(圖5)一樣，得到acg、aba、aca與mmp-3值相關，而jacalin不相關的結果。

為了觀察jacalin與mmp-3值背離產生哪些疾病，分別以疾病分組作圖(圖14)。其結果，有意思的是，ra和非ra趨勢不同：就ra而言，mmp-3值越高，與jacalin值的背離趨勢越高，反而看起來是下降的樣子；與此相對，非ra未觀察到這樣的趨勢，jacalin和mmp-3值高度相關。

于是，取所有類風濕性疾病顯示與mmp-3值高度相關的典型的凝集素acg與jacalin之比，計算acg/jacalin值并作圖(圖15)，其結果，顯示該值為高值的只有ra活動性高的組。

然而，如實施例4所證實的，jacalin值的下降可以理解為反映mmp-3所含有的o-結合型糖鏈的galnac中的α2,6唾液酸修飾。而且，反映這樣的galnac的α2,6唾液酸修飾的jacalin值的下降現象在類風濕性疾病中也是ra所特有的，且在ra活動性高的病例中是具有特征性的，這在本實施例中再次得到證實。

(6-2)與識別多聚乳糖胺結構的凝集素的反應性比較

如(6-1)，再次證明了作為jacalin信號顯示ra活動性的事實，暗示也可以用于鑒別ra和非ra，因此對其他凝集素的信號的差異也再次進行比較研究(圖16)。

作為其他凝集素，選擇了(6-1)的凝集素芯片譜分析的結果具有統計學性顯著差異的被稱為lel(來自于番茄)和stl(來自于馬鈴薯)的識別多聚乳糖胺結構的凝集素?？梢哉J為，這兩種凝集素識別多聚乳糖胺結構的glcnac。

測定lel和stl凝集素反應性糖鏈的信號，通過steel-dwass檢驗進行判定，其結果，得到與hc、ra相比，pmr、rp具有顯著高值的結果，發(fā)現對于不同疾病存在很大的不同(圖16上圖)。

以血清mmp-3濃度對各疾病進行同樣的steel-dwass檢驗，僅就血清mmp-3濃度而言，這樣的差異無法觀察到(圖16下左圖)。

使用這些信號能否鑒別hc·ra與pmr、hc·ra·pmr與rp，通過以縱軸為真陽性率、以橫軸為假陽性率作圖的受試者工作特征曲線(roc曲線)進行分析。在3組中，對于與ra鑒別最困難的pmr進行roc分析，結果判明，具有roc＝1.0且roc曲線下面積(auc)＝1.0這樣的非常高的鑒別能力(圖16下右圖)。發(fā)現stl、lel兩信號都具有pmr和ra/hc、或者rp和pmr/ra/hc為auc＝1.0這樣的非常高的鑒別能力(同圖16下右圖)。

也就是說，結果顯示，在受試血清試樣中的mmp-3上的lel和/或stl凝集素反應性糖鏈成為類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)各自的優(yōu)異的糖鏈標志物。

這意味著，通過測定受試血清試樣的mmp-3濃縮組分中與lel或stl凝集素的反應性、或者通過使用抗mmp-3抗體與lel或stl凝集素的三明治分析法的測定值，可以判定是否罹患類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和/或是否罹患復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)。進一步地，這也是顯示可以正確鑒別以前鑒別困難的類風濕性關節(jié)炎和類風濕性多發(fā)肌痛癥的結果。

可以將難于鑒別的病例類風濕性多發(fā)肌痛癥(pmr)和類風濕性關節(jié)炎(ra)正確識別的同時，可以提供尚未確立正確的診斷方法的復發(fā)性多發(fā)軟骨炎(rp)的正確的診斷方法，這是劃時代的。

使用mmp-3的糖鏈譜分析數據詳細分析了上述實驗數據，探索了在mmp-3容易成為高值的疾病中僅對ra特異性地檢測的方法。

就ra而言，因為與pmr、rp相比，被稱為lel或stl信號的識別多聚乳糖胺的凝集素的信號較低，可以與pmr和rp進行鑒別，然而，因為hc也是lel或stl信號低，因而還是不能與hc進行鑒別。于是，對于ra，為了突出與hc的不同，取mmp-3上的acg、jacalin等o-結合型糖鏈的信號之比，可以作成僅ra為高值的指標(例如，jacalin/lel和acg/lel)(圖17上圖)。以這些信號值為基礎，研究疾病中僅檢測ra的能力，進行roc分析，其結果，顯示具有aoc＝0.95～0.98這樣的高鑒別能力(圖17下圖)。

即，顯示在類似的類風濕性疾病中，為了正確鑒別為類風濕性關節(jié)炎，測定受試血清試樣的mmp-3反應性組分中的lel或stl凝集素與jacalin、acg等o-結合型糖鏈的反應性之比即可。