相關(guān)申請的交叉引用

本pct申請要求于2014年8月14日提交的美國臨時專利申請第62/037,273號的優(yōu)先權(quán)，出于所有目的，該美國臨時專利申請的公開內(nèi)容通過引用全部合并到本文中。

本發(fā)明涉及微流體領(lǐng)域，并且更特別地涉及用于分析微流體裝置的輸出如微滴的設(shè)備和處理。

背景技術(shù)：

使用微尺度的乳劑作為隔離的區(qū)室來運行多個獨立的化學(xué)反應(yīng)的基于微滴的測定法作為廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的平臺在最近幾年得到了普及。相比于使用毫米大小的孔板來隔離流體的常規(guī)實驗室方法，微米尺度的微滴僅包含(10-12l)皮升的流體，提供了在體積上的10⁶倍的縮小。進一步，相比于常規(guī)孔板上可用的數(shù)百個區(qū)室，微流體允許以高達每分鐘10⁶的速率來創(chuàng)建微滴，從而提供在區(qū)室的數(shù)目上大于常規(guī)技術(shù)的10⁴倍。來自大規(guī)模并行超小體積測定法的靈敏度巨大提高已被利用來檢測蛋白質(zhì)和核酸的單分子，以：監(jiān)測作為時間的函數(shù)的分子濃度；執(zhí)行用于定向進化的高通量篩選；并且測定單細胞。

當用于產(chǎn)生和處理微滴的微流體裝置可以被小型化和集成到緊湊的單片芯片上時，已經(jīng)更難以小型化對基于微滴的測定法的讀出?？梢允褂没跓晒獾母袦y，這是因為：1)分子信標，其可以基于綁定事件來開啟或關(guān)閉熒光，避免額外的步驟來洗去過量的試劑；2)不同顏色的熒光團允許檢測單個微滴中的多個目標；并且3)廣泛可用的基于熒光的試劑使得測定的發(fā)展較為容易。以前的工作已經(jīng)將熒光檢測與微滴微流體技術(shù)進行集成并且使細胞的熒光檢測小型化。已開發(fā)有寬視野顯微鏡技術(shù)，其可以拍攝靜態(tài)微滴的顯微照片，其中，在單張中具有多達10⁶的析象能力。其他團體已開發(fā)了在流中檢測系統(tǒng)，其具有實時排序下游處理的優(yōu)點，并且具有與靜態(tài)技術(shù)相比可能的測量遠遠更大數(shù)目的微滴的能力，測量多達每秒10⁴個的微滴的能力。然而，這些技術(shù)需要復(fù)雜的光學(xué)器件并且不容易進行修改以監(jiān)測多于一個的通道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的各方面涉及用于分析微流體裝置的輸出的設(shè)備和方法。

根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了一種用于分析微滴的微流體裝置。微流體裝置包括基片和形成在基片上的微流體通道。微流體通道包括多個通路，所述多個通路中的每一個具有被配置成對通過該通路的微滴的信號進行調(diào)制的掩模圖案，使得通過所述多個通路的微滴產(chǎn)生多個信號。微流體裝置還包括被配置成檢測所述多個信號的檢測器。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種用于分析微滴的微流體裝置。微流體裝置包括基片和形成在基片上的微流體通道。微流體通道包括多個通路，所述多個通路中的每一個具有掩模圖案。每個掩模圖案被配置成對通過該通路的微滴的熒光信號進行調(diào)制，使得通過所述多個通路的微滴產(chǎn)生多個熒光信號。微流體裝置還包括被配置成同時檢測所述多個熒光信號的檢測器。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了一種用微流體裝置來分析多個微滴的方法，所述微流體裝置具有形成在基片上的微流體通道，所述微流體通道包括多個通路。該方法包括以下步驟：使多個微滴通過所述多個通路；使用形成在所述多個通路上的多個掩模圖案；對來自所述多個微滴中的多個信號進行調(diào)制；以及檢測所述多個信號。

應(yīng)該理解的是，前述的總體描述和以下的詳細描述對于本發(fā)明而言都是示例性的，而不是限制性的。

附圖說明

當結(jié)合附圖來閱讀時，本發(fā)明將會從下面的詳細描述中被最好地理解，在附圖中，相同的元件具有相同的附圖標記。當存在多個類似的元件時，單個附圖標記可以被分配給所述多個類似的元件，其中，小字符標志指代具體的元素。當總體指代元素或者指代元素中的非特定的一個或更多個時，小字符標志可以被丟棄。進行如下強調(diào)：根據(jù)常見做法，附圖中的各種特征未按比例繪制，除非有另外指明。相反，為清楚起見，各種特征的尺寸可以擴大或縮小。附圖中所包括的圖如下：

圖1a是根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的示意圖；

圖1b是根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的橫截面示意圖；

圖1c是描繪根據(jù)本發(fā)明的各方面的從105比特長的掩模圖案得到的幅度調(diào)制信號的曲線圖；

圖1d是根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的照片；

圖2a是根據(jù)本發(fā)明的各方面的信號測量的流程示意圖；

圖2b是根據(jù)本發(fā)明的各方面的二維速率相關(guān)；

圖2c是根據(jù)本發(fā)明的各方面的涉及原始信號數(shù)據(jù)和相應(yīng)的正交相關(guān)向量的一組曲線圖；

圖3a是根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的橫截面示意圖；

圖3b是根據(jù)本發(fā)明的各方面的裝置的一部分的光學(xué)顯微照片；

圖3c是根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的示意圖；

圖3d是根據(jù)本發(fā)明的各方面的熒光顯微照片；

圖3e是根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的示意圖；

圖3f是根據(jù)本發(fā)明的各方面的信號檢測器的芯片示意圖；

圖4a是根據(jù)本發(fā)明的各方面的涉及原始信號數(shù)據(jù)和相應(yīng)的正交相關(guān)向量的一組曲線圖；

圖4b是根據(jù)本發(fā)明的各方面的涉及多個微滴的原始信號數(shù)據(jù)和相應(yīng)的正交相關(guān)向量的一組曲線圖；

圖5是描繪根據(jù)本發(fā)明的各方面的分析多個微滴的方法的選擇步驟流程圖；

圖6a是描繪根據(jù)本發(fā)明的各方面的通過掩模圖案通路的兩個微滴的通過的一組曲線圖；

圖6b是描繪根據(jù)本發(fā)明的各方面的通過掩模圖案通路的微滴的通過的熱圖；

圖6c是描繪根據(jù)本發(fā)明的各方面的通過掩模圖案通路的微滴的通過的熱圖；

圖6d是描繪根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的測量能力的靈敏度和特異性的接收器工作特性曲線；

圖7a是描繪信噪比對根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的靈敏度和特異性的影響的接收器工作特性曲線；

圖7b是描繪掩模圖案的位的數(shù)目對根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的靈敏度和特異性的影響的接收器工作特性曲線；

圖7c是描繪通路的數(shù)目對根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的靈敏度和特異性的影響的接收器工作特性曲線；

圖7d是描繪通路的數(shù)目和微滴的數(shù)目對根據(jù)本發(fā)明的各方面的微流體裝置的靈敏度和特異性的影響的接收器工作特性曲線；

圖8是根據(jù)本發(fā)明的各方面的信號測量的流程示意圖；

圖9a是根據(jù)本發(fā)明的各方面的提供兩個不同波長的光的微流體裝置的橫截面示意圖；

圖9b是根據(jù)本發(fā)明的各方面的針對激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的兩步解調(diào)的流程示意圖；

圖9c是根據(jù)本發(fā)明的各方面的被配置成提供兩種不同信號的兩種染料的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的圖示；以及

圖9d是圖9b的兩步解調(diào)的結(jié)果的示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明的各方面涉及用于分析微流體裝置的輸出的設(shè)備和方法。

本發(fā)明人已經(jīng)認識到，提供對微流體裝置的輸出的全分析將會是有用的。本發(fā)明人還已經(jīng)認識到，針對微流體裝置的每個通道使用不同的微圖案化掩模來對來自輸出例如微滴的信號進行編碼，使得能夠恢復(fù)弱信號而無需昂貴和笨重的光檢測器。本發(fā)明人已經(jīng)還認識到使用掩模允許同時監(jiān)測多個通道，從而允許日益增加的復(fù)雜實驗，而無需另外的和昂貴的檢測硬件例如透鏡、激光器和復(fù)雜的流體控制硬件。特別地，本發(fā)明的微流體裝置可以使用單個檢測器來測量多個通道中的微滴，甚至同時測量多個通道中的微滴，并且不需要透鏡或復(fù)雜的流體流動控制。由此，微流體裝置的實施方式適用于便攜式醫(yī)用方面。

在本文中使用時，“微滴”總體上指用于要使用本發(fā)明的設(shè)備和方法來分析的一個或更多個分析物的賦形劑和/或遞送系統(tǒng)。在微流體裝置的上下文中，合適的分析物包括但不限于乳劑(例如油包水、水包油、水包油包水)、囊泡、微氣泡、珠粒(例如磁性聚合物珠)、細胞、病原體、dna、rna、核酸、污染物等。

在本文中使用時，“信號”是指微滴的任何外部可檢測的特征。可以由本發(fā)明的微流體裝置檢測的示例性信號包括電信號、磁信號、介電信號、超聲波信號、熒光信號。

圖1a示出了根據(jù)本發(fā)明的各方面的用于分析微滴的微流體裝置100的示意圖。本發(fā)明的微流體裝置允許對微滴——例如可以由微滴產(chǎn)生器110產(chǎn)生的單分散乳劑——的分析。在一種實施方式中，微滴產(chǎn)生器110是微流體裝置100的部件。

可以在基片上形成微流體裝置100的一部分。示例性基片材料包括玻璃、二氧化硅、聚酯薄膜、聚硅氧烷或碳基聚合物，包括但不限于聚二甲基硅氧烷(“pdms”)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或它們的混合物。

微流體裝置100包括微滴可以在其中流過的多個通路，這些通路可以統(tǒng)稱為微流體通道。微流體通道包括多個流體通路115。所述多個流體通路115與微滴產(chǎn)生器110流體連通并且從微滴產(chǎn)生器110接收微滴。在一種示例性實施方式中，所述多個流體通路115中的每一個包括源于微滴產(chǎn)生器110的微滴流。

所述多個通路115中的每一個包括相應(yīng)的掩模圖案(統(tǒng)稱為掩模120)，所述掩模圖案被配置成對通過該通路的微滴產(chǎn)生的信號進行調(diào)制。雖然示出為單個掩模120，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會從本文中的描述中認識到每個掩模圖案可以被實現(xiàn)為獨立的掩模，或者兩個或更多個掩模圖案可以被合并成一個掩模。在一種實施方式中，掩模120是駐留在所述多個通路中的每一個中的一個或更多個表面上的微圖案(例如“條形碼”)。轉(zhuǎn)向圖1b，每個掩模圖案包括一個或更多個信號發(fā)射部分和一個或更多個信號抑制部分。例如，在待分析的信號是熒光的情況下，信號發(fā)射部分可以是允許信號(此處，光)通過掩模的透明部分124，并且信號抑制部分可以是防止信號通過掩模的不透明部分122。信號發(fā)射部分和信號抑制部分可以包括在完全透明與完全不透明之間的各種透明狀態(tài)。此處，掩?？梢允窃诓Ａ系墓饪虉D案化金屬，其還可以用作所述多個通路115的頂板(roof)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，掩模120可以形成在其它表面(即所述多個通路115的側(cè)面或底面)上。掩模120還可以形成在所述多個通路115的內(nèi)表面上，或者形成在所述多個通路之上的表面上(例如所述多個通路之上的濾光器上)。

在關(guān)注其他信號——例如電信號、磁信號、介電信號和超聲波信號中的一種或更多種——的情況下，掩模120可以包括除了變化的透明狀態(tài)之外的狀態(tài)。也就是說，信號發(fā)射部分應(yīng)當允許所關(guān)注的信號的全部或一部分通過掩模，而信號抑制部分應(yīng)當防止這樣的通過。例如，對于磁信號，掩模120可以包括定位在通路的不同位置處的磁場傳感器，以對掩模圖案進行編碼?？商娲?，可以將用于將傳感器相對于磁場進行遮蔽的高敏感性材料例如nife圖案化到所述多個通路115上，以實現(xiàn)相同的結(jié)果。在所關(guān)注的信號是超聲波的情況下，可以使用具有大的反射系數(shù)的材料來產(chǎn)生掩模圖案。

回到圖1a，在熒光是待分析的信號的情況下，微流體裝置100還可以包括照射器例如光源125。如所描繪的，光源125是側(cè)面照射系統(tǒng)，其用于激發(fā)微滴內(nèi)的熒光染料。光源125可以是發(fā)光二極管(led)，其發(fā)射被調(diào)諧到微滴內(nèi)的熒光團的激發(fā)波長λex的光。光源125可以被配置成發(fā)射在調(diào)諧到兩個或更多個熒光團的激發(fā)波長的兩個或更多的光波長處的光。可替代地，可以使用兩個或更多個光源來發(fā)射具有兩個或更多個光波長的光。照射器可以被配置成將所發(fā)射的兩個或更多個光波長調(diào)制成彼此不同相。

光源125可以被配置成在照射與不照射之間交替，和/或在兩個或更多個光波長之間交替。理想的是，這種交替在每個體像素下微滴持續(xù)期間發(fā)生許多次，例如每單個像素下的持續(xù)時間，微滴可以經(jīng)歷100次交替、200次交替、300次交替，等等。在一種實施方式中，所述兩個或更多個光波長之間的這種交替以300khz的頻率發(fā)生，使得：當每個微滴在單個個體像素下通過時，每個微滴經(jīng)歷300次激發(fā)交替。采用被配置成在照射與不照射之間交替和/或在兩個或更多個光波長之間交替的照射器可以使得微流體裝置100能夠?qū)τ诿總€微滴測量相對熒光信號，而不是絕對信號，從而有利于對分析物的改善的免校準分析。

可以使用反諧振耦合來包含微芯片內(nèi)的光并且一致地和強烈地照射流體通道。通過多個通路115的含有一種或多種熒光染料的微滴將吸收來自光源125的激發(fā)光并發(fā)出熒光。當微滴沿通路115向下移動時，它發(fā)出的光被掩模120進行幅度調(diào)制。

微流體裝置100還包括檢測器130，檢測器130檢測從所述多個通路115中的每一個發(fā)出的經(jīng)調(diào)制信號。檢測器130可以被配置成同時檢測從所述多個通路115中的每一個發(fā)出的經(jīng)調(diào)制信號。在一種實施方式中，如圖1b所示，來自通路的各向同性地發(fā)射的熒光通過掩模120的相應(yīng)的掩模圖案，并進入檢測器130例如硅光檢測器中。在示出的實施方式中，在掩模120與檢測器130之間是長通濾光器132，長通濾光器132減少了來自散射的激發(fā)光的背景信號。在一種實施方式中，在光源125產(chǎn)生兩種或更多種光波長的光的情況下，可以采用附加的濾光器使得使用兩種或更多種濾光器，每個濾光器對應(yīng)于所述兩種或更多種光波長中的單種波長，并且定位在掩模圖案與光檢測器之間。所述兩種或更多種濾光器可以被配置成對所述兩個或更多個熒光信號進行解調(diào)。所述兩種或更多種濾光器還可以被配置成長通濾光器并且在空間上分離，以使得每個微滴在每個濾光器下順序通過。檢測器130可以擱置在掩模120的正上方。

當微滴在掩模圖案下方通過時，它發(fā)射的光從被信號抑制部分122阻擋變?yōu)橥ㄟ^信號發(fā)出部分124透過，這產(chǎn)生二元幅度調(diào)制信號vd(t)。在一種實施方式中，對于多個通路115——n個通路115——中的每一個，可以將掩模圖案mn定義為一系列的1和0，其中，1對應(yīng)于透明，而0對應(yīng)于不透明。將掩模120定位成靠近微滴確保掩模圖案中的每比特對著從微滴射出的光的最大可能立體角，因此，確保1和0之間的對比。

掩模圖案的范圍可以為80至125比特。在一種實施方式中，掩模圖案大于100比特。在一個系統(tǒng)(snr＝-6db，c＝4通道)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，掩模長度可以在性能上沒有顯著降低的情況下減小到最低為l＝100比特(auc＝0.999)。在這樣的系統(tǒng)中，低于l＝50比特，靈敏度和特異性可能會略微退化。

理想地，掩模120內(nèi)的掩模圖案可以最低限度地彼此相關(guān)，使得能量e(ma＊ma)為最小。這允許微滴共存于同一通道的不同通路中的檢測區(qū)域中并且區(qū)分于彼此。優(yōu)選地，掩模圖案對于所述多個通路115中的每一個而言是不同的。在一種實施方式中，掩模圖案可以最低限度地彼此交叉相關(guān)，使得能量e(ma＊mb)對于a≠b為最小。這允許來自不同通道的信號最大限度地分離。

可以使用反饋寄存器來生成被稱為最大長度序列(mls)的偽隨機向量。對于長度l＝2^m-1的序列，移位寄存器的元素由度m的本原多項式h(x)限定。通過迭代該移位寄存器，可以生成被證明是最小限度地自相關(guān)的一系列的1和0。為了創(chuàng)建多個通道，可以通過將一維mls折疊成如由macwilliams和sloane描述的二維mls、偽隨機序列和陣列來生成二維mls。proceedingoftheieee64:1715-1729(1976)。

掩模圖案允許將由檢測器130獲得的一維信號解壓縮成一組向量，每個向量代表所述多個通路115中的一個。圖1c圖示了105比特的長掩模圖案的一個示例和來自通過的微滴的相應(yīng)的幅度調(diào)制信號vd。此時編碼有兩個功能：1)它允許使用基于相關(guān)的信號恢復(fù)來恢復(fù)弱信號(snr<<1)，并且因此使得能夠進行簡單的硬件實現(xiàn)，其不包括透鏡、激光器或高靈敏度的檢測器；2)它允許僅使用單個檢測器來獨立監(jiān)測多個通道，從而使得能夠在單個芯片上實現(xiàn)附加的測定，而不會增加硬件的復(fù)雜性。

每比特的長度可以是均勻的。在一種實施方式中，比特長度為80μm長，導(dǎo)致對于105比特長的掩模圖案具有8.4mm長的檢測區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，比特長度將還會隨比特不同而不同。

圖1d是根據(jù)本發(fā)明的各方面的用于分析微滴的微流體裝置100的照片。在該實施方式中，系統(tǒng)大致是移動電話的尺寸(10×5×2cm³)。

處理來自光檢測器的信號vd(t)可以包括初步確定熒光微滴是否已經(jīng)通過檢測區(qū)域，如果是，則確定熒光微滴通過多個通路115中的哪些通路。為此，微流體裝置100還可以包括被配置成使多個熒光信號中的每一個與掩模圖案相關(guān)的電路。該信號可以被投影至一組向量ψn上，每個向量表示來自通過的微滴的信號vd(t)與掩模mn中的每一個的相對相關(guān)。如圖2a所描繪的，由光檢測器測量到的信號vd(t)被投影至向量ψn(τ)＝vd(t)＊mn(x/v)＝∫vd(t)mn(x/v+τ)dt從-∞到∞，每個向量表示微滴已經(jīng)通過單個通道n并且以速率v行進的可能性。

隨著加載有10nm羅丹明(rhodamine)的微滴通過檢測區(qū)域，來自光檢測器的原始數(shù)據(jù)的示例在圖2c中被示為vd。在信號通過相關(guān)器組(圖2a)之后，產(chǎn)生了一組向量ψ1、ψ2、ψ3和ψ4，其中，每個向量對應(yīng)于多個通路115中的特定通道。微滴引起ψ2中大的峰值，這表明微滴通過該通道。限定了應(yīng)用于這些向量(示為綠色虛線)中的每一個的門控閾值ψt，高于該閾值認為檢測到熒光微滴。

可以利用微滴速率的知識來增強上述峰值檢測。然而，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，微滴和流量控制不是必需的。特別地，可以使用適于具有分散速率的微滴的算法?？梢杂嬎愣S相關(guān)mn(x/v)＊vd(t)，其中，v是具有一系列速率[vmin:vmax]的一維矩陣?？梢允褂胢atlab來計算該二維相關(guān)。圖2b將輸出描繪為速率v和時間t中的二維矩陣，據(jù)此，可以在二維空間中準確地找到峰值位置(vp,tp)。該技術(shù)的假設(shè)是，在檢測區(qū)域中微滴速率在持續(xù)時間(～50ms)內(nèi)恒定，這用實驗來驗證。在該特定實施方式中，可以觀察到三個不同速率的三個微滴。

可以通過使光源125在照射與不照射之間交替和/或在兩個或更多個光波長之間交替來進一步改進檢測。通過調(diào)制激發(fā)光，可以將信號在頻率上偏移出光檢測器130的低頻噪聲，從而提高檢測低snr微滴的能力。通過對來自兩個激發(fā)源和兩個發(fā)射濾光器的微滴的響應(yīng)進行編碼，利用四種可能的組來獨立地測量每個微滴。在一種實施方式中，可以測量三個參數(shù)以檢測微滴的存在，例如兩個熒光通道和亮場散射(ssc)。

轉(zhuǎn)向圖5，提供了描繪用微流體裝置來分析多個微滴的方法的選擇步驟的流程圖，微流體裝置具有形成在基片上的微流體通道，微流體通道包括多個通路。應(yīng)當注意，關(guān)于本文所述的方法，根據(jù)本文的描述將理解，一個或更多個步驟可以被省略和/或不按所描述的方法的順序(包括同時地)被執(zhí)行，然而仍然實現(xiàn)期望結(jié)果。

在步驟510中，多個微滴通過多個通路(例如圖1a中的多個通路115)。多個微滴可以由例如微滴產(chǎn)生器110產(chǎn)生。

在步驟520中，使用形成在多個通路上的多個掩模圖案(例如圖1a的掩模120)來調(diào)制來自多個微滴的多個信號。每個掩模圖案可以具有一個或更多個信號發(fā)射部分和一個或更多個信號抑制部分。在待檢測的信號是熒光或光的情況下，一個或更多個信號發(fā)射部分可以是透明部分，并且一個或更多個信號阻尼部分可以是不透明部分。此外，一個或更多個信號發(fā)射部分可以形成各種透明狀態(tài)的圖案。多個掩模的透明部分和不透明部分可以優(yōu)先對應(yīng)于具有至少約100位的二元圖案。在一種實施方式中，多個通路中的每一個具有來自多個掩模的相應(yīng)掩模。

在步驟530中，檢測多個信號?？梢允褂脵z測器130例如光檢測器來檢測多個信號。檢測器可以定位成正好與掩模120相對，或者濾光器132可以定位在檢測器(例如光檢測器130)與掩模120之間。

在實施方式中，在信號是熒光信號并且檢測器是光檢測器的情況下，在步驟530之前照亮多個通路。例如通過使照射器在照射與不照射之間交替和/或在兩個或更多個光波長之間交替來交替照射多個通路，可以促進對熒光信號的檢測。在一種實施方式中，交替照射多個通路包括重復(fù)地打開和關(guān)閉照射器例如光源125。在另一實施方式中，交替照射多個通路包括在兩個或更多個光之間交替，每個光具有一個或更多個光波長。每種光可以被配置成具有與包括其它光的一個或更多個光波長不同的一個或更多個光波長。例如，照射多個通路的步驟可以包括照射器，該照射器被配置成產(chǎn)生兩個或更多個光，每種光具有光波長并且在照射多個通路的步驟期間在兩個或更多種光之間交替。

微滴可以包括兩種或更多種熒光染料以產(chǎn)生兩個或更多個熒光信號。多個熒光信號中的每一個可以對應(yīng)于不同光波長和/或可以具有不同的發(fā)射光譜。

由檢測器檢測到的多個信號可以另外與多個掩模中的相應(yīng)掩模相關(guān)。

示例

包括以下示例以說明本發(fā)明的總體性質(zhì)。所述示例還說明通過產(chǎn)生穩(wěn)定的單分散微泡以及通過采用根據(jù)本發(fā)明的原理的微流體裝置和相關(guān)過程獲得的改進結(jié)果。

如圖3a所示，使用軟光刻制造模制的pdms流體通道和對玻璃上的ni的標準平面光刻法生成掩模的組合來制造裝置。si光檢測器緊密地位于芯片的上面，濾光器用于阻擋散射的激發(fā)光。使用具有80μm厚特征的標準單層su-8光刻(su-82025，microchem)來制造模制的pdms層。使用標準平面光刻法將掩模圖案化在玻璃上的ni中。首先，將ni熱蒸發(fā)到玻璃載片(kurtleskerpvd75，wolfnanofabricationfacility，賓夕法尼亞大學(xué))上。隨后，使用ni(氯化鐵(iii))的濕法蝕刻來光刻限定(shipley1813)掩模圖案。使用pdms沖壓粘合將ni圖案化的玻璃載片永久粘合到模制的pdms層上。圖3b描繪了裝置的一部分的光學(xué)顯微照片。比例尺為160μm。

如圖3c所描繪的，使用t形接頭產(chǎn)生微滴。微滴加載有羅丹明。比例尺為60μm。使用混合的軟光刻/激光加工，將四個t形接頭集成到單個裝置上，僅具有單個油輸入端。使用以下的組合來制造芯片：1)使用軟光刻在pdms層中制造微尺度微滴制造器和流體通道；以及2)使用直接激光微加工對具有更深的(d＝200μm)激光雕刻通道的pdms的第二層制造通孔，以向各個微滴制造器均勻地遞送油。t形接頭的孔徑為100μm寬和50μm深。礦物油用作具有5％v/v司盤(span)80和1％v/v吐溫(tween)(fisherscientific)的連續(xù)相。水相的流速為0.1ml/hr，油相的流速為1ml/hr，并且使用注射泵(braintreescientific)來控制。如圖3d所示，平均微滴尺寸為60μm，cv為～5％。使用片上儲液器用于四個水的輸入端，并且使用聚乙烯管將兩個芯片連接在一起，單個注射泵能夠驅(qū)動裝置。完成使用管道連接兩個獨立的芯片模塊以方便原型制作。使用兼容制造策略制造的微滴產(chǎn)生器和檢測模塊也集成在同一芯片上。

如圖3f所描繪的，使用定制電子設(shè)備來放大、數(shù)字化以及處理來自光檢測器的輸出電流。光檢測器傳感器在λ＝600nm處具有的響應(yīng)度為200ma/w。光檢測器連接至具有dc-20khz帶寬(thorpd100a)的g＝0.75×10⁶v/a跨阻抗放大器?？缱杩狗糯笃鞯妮敵龆吮籥c耦接至增益為20、高通頻率為fh＝1hz和低通頻率為20khz(ithaco)的前置放大器(pa)。pa的輸出端連接至對數(shù)字轉(zhuǎn)換器(nationalinstruments，niusb-6009)的模擬，其在將信號通過usb發(fā)送至計算機或智能電話以用于分析之前以40ks/s對信號進行數(shù)字化。所有分析在個人計算機(matlab)上完成，但是對于便攜式實現(xiàn)，可以使用數(shù)字信號處理(dsp)芯片或使用云計算來完成該處理。

圖3e描繪了示出如何使用抗諧振耦合將光經(jīng)由側(cè)面照射遞送到芯片中的示意圖。

使用可以封裝到小尺寸便攜式設(shè)備(圖1d)中的商業(yè)產(chǎn)品將芯片中的光學(xué)器件保持為盡可能小且便宜。激發(fā)光由封裝在具有散熱器(wakefieldthermalsolutions,19757-m-ab)的定制激光加工(universallaser)丙烯酸盒中的超亮led(λex＝530nm)(luminus，cbt-90-g-c11-jk201)提供。盒被設(shè)計成使得芯片可以以類似于槽式連接器的方式滑入其中，并且光將以傾斜角度耦合到芯片以用于最大抗諧振耦合。使用安裝在具有集成跨阻放大的印刷電路板上的silicone光檢測器(thorlabs，pda100a)。在芯片與檢測器之間放置λ＝600nm長通濾光器(#69-868edmund光學(xué)器件)以減少激發(fā)波長的散射光的影響(95％反射率)。

該裝置的掩模圖案的長度為105比特。使該序列盡可能長以使每個通道的自相關(guān)和通道之間的互相關(guān)最小化。序列長度受光檢測器的尺寸的限制。silicone光檢測器(thorlabs，pda100a)為10×10mm²，并且由于沒有使用透鏡，這設(shè)置了檢測區(qū)域的尺寸。掩模中的每個像素的尺寸由微滴的尺寸確定。為了確保從每個微滴各向同性射出的光的大部分被掩模圖案阻擋，掩模的像素尺寸與微滴的像素尺寸匹配。使用60μm微滴和80μm像素。因此，每個通道的總比特數(shù)被限制為10mm/80μm＝125。

為了生成每個掩模為105比特長的一組掩模，所述一組掩模與對于最小自相關(guān)和互相關(guān)的規(guī)范匹配，采用macwilliams和sloane中的處理以從偽隨機最大長度序列(mls)創(chuàng)建偽隨機矩陣陣列。偽隨機矩陣的維度是mls序列的某些允許的分解。在這種情況下，維度為105×39＝4095＝212-1(m＝12)。使用matlab將這些序列與隨機生成的掩模序列進行比較。發(fā)現(xiàn)mls生成的掩模具有顯著更小的自相關(guān)和互相關(guān)(p<10^-4，雙側(cè)t校驗)。還開發(fā)了用于生成掩模的替代策略，其中，生成大的隨機掩模庫，然后選擇具有低自相關(guān)的掩模的子集。然后，從該子集中選擇具有低互相關(guān)的子集對，并且從那些對中選擇具有低互相關(guān)的四個組。這兩個過程產(chǎn)生了類似的結(jié)果，但是mls技術(shù)僅花費了數(shù)秒的計算時間，而選擇技術(shù)花費了幾個小時，并且對于大于四個通道不可阻擋地變得慢。兩種實現(xiàn)都在matlab中執(zhí)行。

測量低于本底噪聲的熒光微滴

發(fā)明人的基于相關(guān)性的檢測方案允許極弱信號(snr<<1)從低于本底噪聲恢復(fù)。該平臺可以有效地將信號與噪聲分離，這是因為信號與掩模的圖案相關(guān)，而噪聲不相關(guān)?；謴?fù)弱信號的能力是期望的，這是因為所述檢測方案允許無透鏡使用，從而使得其非常適合于小型化。為了證明這種能力，測量具有snr～0.25的弱熒光微滴，所述弱熒光微滴在原始數(shù)據(jù)中不能被分辨。如圖4a所示，通過在同一時間間隔上將來自通過的微滴的信號中的預(yù)期能量除以噪聲的平均能量來計算信噪比。然而，在將該數(shù)據(jù)與正確的掩模m2相關(guān)之后，其相關(guān)向量ψ中的峰值遠高于相關(guān)數(shù)據(jù)中的本底噪聲(snr>10)并且容易被檢測。

同時測量檢測區(qū)域中的多個微滴

本發(fā)明平臺的高靈敏度部分地來自于檢測區(qū)域的大面積(10×10mm²)，檢測區(qū)域在熒光微滴通過時收集來自熒光微滴的許多光子。然而，具有大的檢測區(qū)域的權(quán)衡是，如在常規(guī)細胞計數(shù)法中一樣，檢測區(qū)域一次限于一個微滴，其嚴重限制了裝置的總處理能力。為此，將掩模設(shè)計成能夠同時分辨檢測區(qū)域內(nèi)的多個微滴。選擇具有低自相關(guān)和彼此低互相關(guān)的掩模圖案，以使得基于互相關(guān)的檢測策略可以同時分辨沿著同一通道或不同通道中的不同位置的微滴。

為了證明該能力，同時測量通過檢測區(qū)域的三個微滴，所述三個微滴全部在同一通道中。如圖4b所示，在原始數(shù)據(jù)中，三個信號重疊并且不可能分辨。然而，在將該數(shù)據(jù)與正確掩模相關(guān)之后，相關(guān)向量ψ中的三個峰值變得很好分離并且可以被單獨分辨。

多通道檢測

本發(fā)明平臺的益處是同時檢測多個通道中的微滴的能力。為了表征該能力，微滴被發(fā)送通過特定通道，并且將裝置的輸出與預(yù)期結(jié)果進行比較。該功能在圖6a中示出，圖6a示出了通過檢測區(qū)域的兩個微滴，其中，一個微滴在通道1中通過，另一個微滴在通道2中通過。在將該數(shù)據(jù)與正確的掩模相關(guān)之后，通道2中的清晰峰值對應(yīng)于第一微滴并且通道1中的清晰峰值對應(yīng)于第二微滴，從而允許容易識別微滴的正確通道。

裝置靈敏度和特異性的定量

為了表征靈敏度與特異性之間的權(quán)衡，使用一系列閾值ψt來測試本發(fā)明的裝置，并且生成受試者工作特性曲線(roc)。靈敏度＝tp/p，其中，tp是檢測器成功檢測到通過的微滴并且準確識別到其通道的實例的數(shù)目，并且p是微滴的總數(shù)目。特異性＝檢測器的tn/n，其中，tn＝n-fp是真陰性并且由總的假陽性fp——即檢測器錯誤檢測微滴的實例——和陰性的總數(shù)目n＝p*(c-1)來限定，n由微滴的總數(shù)目p和通道的總數(shù)目c來限定。

微滴首先一次通過四個通道之一，并且量化靈敏度和特異性的檢測。圖6b總結(jié)了熱圖中的實驗結(jié)果。裝置按預(yù)期執(zhí)行；沿著熱圖的對角線在微滴通過的通道中檢測到微滴，而不是在偏離對角線的不正確的通道中。黑點示出微滴通過的通道。對于每次測試，使具有snr～1的～400個微滴通過。對于選擇的閾值ψt，靈敏度為1.0，并且特異性為0.994。

為了證明芯片同時檢測多個通道中的微滴的能力，微滴接下來通過通道的六個可能的組(ch1和ch2、ch1和ch3等)中的每一個。圖6c總結(jié)了熱圖中的實驗結(jié)果。在正確的通道組中檢測到微滴，而不是在不正確的通道中。對于每次測試，使具有snr～1的～800個微滴通過。對于選擇的閾值ψt，平均靈敏度為1.0，并且特異性為0.993。

靈敏度與特異性之間的權(quán)衡通過產(chǎn)生總結(jié)上述結(jié)果的roc曲線來表征。對于具有近似snr～1的微滴，圖6d描繪了曲線下方的區(qū)域，auc＝0.9995，從而證明了僅使用單個光檢測器魯棒地監(jiān)測微滴的平行流的能力。

表征設(shè)計參數(shù)選擇對性能的影響

為了表征和輔助系統(tǒng)的設(shè)計，使用模型來模擬一系列參數(shù)。該模型使用matlab實現(xiàn)。簡而言之，使用隨機數(shù)發(fā)生器隨機地產(chǎn)生微滴通過通道的時間點tp和微滴通過的特定通道n。使用掩模圖案生成來自通過的微滴的信號vd(t)＝m(n，x/v-tp)+vd(t)，所述信號由微滴速率v縮放并且在時間點tp被放置在輸出信號vd(t)中。重復(fù)地放置n個微滴。高斯噪聲被添加至信號達適當?shù)男旁氡萻nr。通過與實驗數(shù)據(jù)直接比較來驗證該模型。使用該模型，確定了檢測策略的極限，這為未來的應(yīng)用和發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

研究了微滴檢測的靈敏度和特異性如何是光檢測器的信噪比(snr)的函數(shù)。對于本研究中使用的設(shè)置(l＝100比特，c＝4個信道)，發(fā)現(xiàn)如圖7a所描繪的，可以在snr低至-10db(0.1)的情況下以高靈敏度和精確度(auc＝0.9991)檢測到微滴。snr低于-13db(0.05)，靈敏度和特異性開始迅速下降。當信號僅為噪聲的5％時分辨微滴的能力使得能夠使用簡單的無透鏡光檢測器來分辨弱熒光微滴。

接下來，測量掩模l中的比特數(shù)對性能的影響。對于與原型匹配的系統(tǒng)(snr＝-6db，c＝4個信道)，發(fā)現(xiàn)掩?？梢詼p小至低至l＝100比特(auc＝0.999)的長度，而沒有顯著地減小性能。低于l＝50比特，靈敏度和特異性迅速下降。隨著比特長度的性能的增加可以歸因于兩個因素：1)隨著比特數(shù)增加，微滴被有效地測量更多的實例，從而導(dǎo)致通過信號求平均～√l來增加有效snr；以及2)隨著比特數(shù)增加，通道之間的互相關(guān)ma＊mb≠a相應(yīng)地減小，當微滴通過通道b≠a時，這減小了ψa中的背景信號。

表征增加通道數(shù)目的限制

最后，模型系統(tǒng)用于證明增加比原型中證明的c＝4更多的通道的可行性。在第一實驗中，總微滴速率保持恒定r＝r0以使得檢測區(qū)域中的微滴的平均數(shù)目為～1。如圖7c所示，對于與原型匹配的裝置(l＝100比特，snr＝-6db)，發(fā)現(xiàn)隨著通道數(shù)目從c＝4增加至16，靈敏度和特異性保持恒定。該結(jié)果可以歸因于若干因素，包括：1)隨著c從4增加至16，通道之間的相關(guān)ma＊mb≠a的增加不顯著；以及2)由于可以從l＝100比特生成的不相關(guān)掩模的數(shù)目比c.312大得多。隨著通道數(shù)目的增加，每微滴有更多的相關(guān)向量ψa。峰值查找算法通過比較峰值高度與其他向量ψb≠a中的局部方差來識別峰值。隨著通道數(shù)目c增加，求平均增加，這減小了假陽性和假陰性。

如圖7d所示，芯片的多路復(fù)用能力可能在某種程度上受微滴密度限制，其中，當檢測區(qū)域中的平均微滴數(shù)目增加超過～2時，芯片性能下降。因為微滴在通道中的位置遵循泊松統(tǒng)計，隨著檢測區(qū)域中的微滴的平均數(shù)目變得大于2，變得越來越可能的是：在任何給定情況下可能在檢測區(qū)域中發(fā)現(xiàn)>5個微滴，此時檢測器分辨單個事件的能力受到影響。為了測試該現(xiàn)象，而不是保持總微滴速率恒定r＝r0，每通道的微滴速率保持恒定r∝c。選擇微滴速率以使得對于4個通道，在檢測區(qū)域中平均一次存在一個微滴，并且速率隨著通道的增加而成比例地增加。裝置的性能隨著每次增加通道而成比例地下降。

利用多種熒光染料和多種光波長

通過調(diào)制熒光信號的激發(fā)波長和發(fā)射波長二者以檢測每個微滴內(nèi)的多種熒光染料，可以改進對微滴中的分析物的檢測。在圖9a中，兩種熒光染料、熒光素和羅丹明b分別具有對應(yīng)于與綠色相關(guān)聯(lián)的530nm的光波長以及與藍色相關(guān)聯(lián)的460nm的光波長的激發(fā)波長。期望地，用于激發(fā)熒光染料的兩種光波長被調(diào)制為彼此不同相。

由熒光素和羅丹明b染料產(chǎn)生的激發(fā)光譜(由虛線示出)和發(fā)射光譜(由實線示出)的示例示于圖9c中。

采用兩種不同的長通濾光器來分辨由微滴產(chǎn)生的發(fā)射光譜。兩個濾光器將在空間上分開以使得每個微滴在濾光器下面順序地通過。在該示例中，兩個濾光器中的每一個被配置成對應(yīng)于單個波長，例如綠光波長或藍光波長，以使得一個濾光器阻擋由藍光波長產(chǎn)生的激發(fā)，并且另一濾光器阻擋由綠光波長產(chǎn)生的激發(fā)。兩個掩模圖案可以與濾光器共同定位以解調(diào)來自每個濾光器的響應(yīng)。

來自光檢測器的信號被解調(diào)以獨立地測量從兩種染料接收到的兩個信號。圖9b示出了兩步解調(diào)方法，通過所述方法激發(fā)解調(diào)和發(fā)射解調(diào)順序地發(fā)生。在該示例中，如圖9d所示，解調(diào)產(chǎn)生與來自兩個激發(fā)源和兩個發(fā)射濾光器的響應(yīng)相關(guān)聯(lián)的四種可能組合。

盡管本文中參照具體實施方式示出和描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明不意在限制于所示的細節(jié)。確切地，在權(quán)利要求的范圍和權(quán)利要求的等同物的范圍內(nèi)并且在不偏離本發(fā)明的情況下可以在細節(jié)上做出各種修改。