本發(fā)明，在其一些實施方案中，涉及富集并鑒定原發(fā)性腫瘤中的癌癥干細胞及任選將其從中分離的方法。然后可以鑒定將癌癥干細胞與原發(fā)性腫瘤中存在的其它癌細胞區(qū)分開的標志物以便幫助診斷癌癥。另外，對于癌癥治療而言可靶向該標志物。近年來已見證了實體瘤中癌癥引發(fā)性/癌癥干細胞(CSC)的驚人發(fā)現(xiàn)。應(yīng)用由干細胞研究確立的原理，使用異種移植(Xn)小鼠模型通過其再生癌癥的強化能力在功能上定義人CSC。與正常干細胞相似，CSC自身可以通過自我更新過程復(fù)制，這可以在連續(xù)移植測定法中進行研究。另外，源自純化CSC的癌癥再現(xiàn)它們所來源的親本癌癥的異源表型，反映了CSC的分化能力。已基于表面標志物表達進行了CSC的前瞻性分離，使得能夠在細胞培養(yǎng)之前通過流式細胞術(shù)重復(fù)分離高度純化的干細胞群。惡性橫紋肌樣腫瘤是幼兒中最具侵襲性且高度惡性的胚胎瘤。這些腫瘤可以出現(xiàn)在腎臟(稱為橫紋肌樣腫瘤)、腎外組織或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(稱為ATRT)。它們的特征在于SMARCB1(位于染色體22長臂的11.2區(qū)域(22q11.2)處的SWI/SNF染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物的核心組分)損失的幾乎完全外顯率。種系突變已有描述并且與極早期診斷、不同位置的同時和異時性腫瘤及最差預(yù)后相關(guān)聯(lián)。由于SWI/SNF功能喪失引起的基因表達異常被認為在癌形成中起主要作用，與染色質(zhì)重構(gòu)在細胞因子信號傳遞、分化、多能性和自我更新中的重要作用一致。盡管優(yōu)化了目前可用的醫(yī)療護理，包括手術(shù)、化療和放療，但橫紋肌樣腫瘤預(yù)后仍然極差，總存活率接近25％。為提高治愈率和降低短期和長期發(fā)病率，不斷擴展我們對腫瘤來源、開發(fā)腫瘤癌詢問模型及開發(fā)更耐受的新型生物靶向療法的了解是必要的。
背景技術(shù)：
：包括Pode-Shakked等，EMBOMolecularMedicine，第5卷，第1期，第18-37頁，2013和Metildi等，CancerRes2014；74(19Suppl):Abstractnr4960.doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4960。技術(shù)實現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種鑒定人原發(fā)性腫瘤中的癌癥干細胞標志物的方法，其包括：(a)使所述原發(fā)性腫瘤體內(nèi)傳代；并且(b)比較所述原發(fā)性腫瘤的第一群傳代腫瘤細胞與所述原發(fā)性腫瘤的第二群腫瘤細胞中至少一種抗原的水平，其中所述第二群腫瘤細胞是：(i)所述人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞；或(ii)所述人原發(fā)性腫瘤的體內(nèi)傳代細胞，其中所述第二群腫瘤細胞已經(jīng)在體內(nèi)傳代比所述第一群傳代腫瘤細胞少至少一代，其中與所述第二群腫瘤細胞中所述抗原的量相比，所述第一群腫瘤細胞中所述抗原的量增加表明在所述人原發(fā)性腫瘤中有癌癥干細胞標志物。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種在有需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的下調(diào)抗原表達和/或抑制抗原活性的試劑，其中所述腫瘤的體內(nèi)傳代細胞中所述抗原的量:所述腫瘤的原代細胞中所述抗原的量的比率高于預(yù)定水平。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種診斷受試者中的癌癥的方法，其包括分析所述受試者腫瘤中抗原的水平，其中所述抗原的存在表明為癌癥，其中所述腫瘤的體內(nèi)傳代細胞中所述抗原的量:所述腫瘤的原代細胞中所述抗原的量的比率高于預(yù)定水平。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種監(jiān)測受試者中的癌癥治療的方法，其包括分析在所述癌癥治療施用之后所述受試者的原發(fā)性腫瘤中抗原的水平，其中與所述癌癥治療施用之前所述抗原的水平相比，所述抗原的量降低表明為治療性治療，其中所述受試者腫瘤的體內(nèi)傳代細胞中所述抗原的量:所述受試者腫瘤的原代細胞中所述抗原的量的比率高于預(yù)定水平。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種選擇用于受試者中癌癥治療的試劑的方法：(a)根據(jù)本文描述的方法鑒定所述受試者原發(fā)性腫瘤中的至少一種癌癥干細胞標志物；并且(b)選擇下調(diào)所述癌癥干細胞標志物的表達和/或抑制所述癌癥干細胞標志物的活性的試劑，從而選擇用于癌癥治療的試劑。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種在有需要的受試者中治療非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤(ATRT)的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的結(jié)合多肽和/或下調(diào)多肽表達的試劑，所述多肽選自信號素3C(SEMA3C)、賴氨酰氧化酶(LOX)、糖蛋白M6A(GPM6A)、肝細胞生長因子(HGF/SF)和醛脫氫酶1(ALDH1)，從而治療ATRT。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種監(jiān)測受試者中的癌癥治療的方法，其包括：(a)根據(jù)本文描述的方法鑒定所述受試者原發(fā)性腫瘤中的至少一種癌癥干細胞標志物；(b)分析所述癌癥治療之后所述受試者腫瘤中所述癌癥干細胞標志物的量，其中與治療之前所述癌癥干細胞標志物的量相比，腫瘤中所述癌癥干細胞標志物的量降低表明癌癥治療有效。根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了一種診斷受試者中的癌癥的方法，其包括根據(jù)本文描述的方法鑒定所述受試者的生物樣品中的至少一種癌癥干細胞標志物，其中所述癌癥干細胞標志物的存在表明為癌癥。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，選擇所述第一群傳代細胞的傳代次數(shù)，使得存在至少連續(xù)兩代不顯著增加的明顯腫瘤侵襲性表型。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，選擇所述第一群的傳代次數(shù)，使得使用所述第一群傳代細胞的5000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與所述人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少5倍。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，選擇所述第一群傳代細胞的傳代次數(shù)，使得所述第一群傳代細胞中癌癥干細胞:非癌癥干細胞的比率大于1:1000。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述抗原為多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多肽量的增加是每個細胞中所述多肽表達水平的增加。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多肽量的增加是表達所述多肽的細胞的量的增加。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多肽量的增加是每個細胞中所述多肽表達水平的增加和表達所述多肽的細胞的量的增加。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第一群腫瘤細胞中的癌癥干細胞頻率:所述第二群腫瘤細胞中的癌癥干細胞頻率大于5:1。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述原發(fā)性腫瘤為小兒腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述原發(fā)性腫瘤選自非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤(ATRT)、尤文氏肉瘤(Ewings’ssarcoma)、血管肌脂瘤、胸膜肺母細胞瘤和威爾姆氏腫瘤(Wilms'tumor)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第一群傳代腫瘤細胞傳代最少2代。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第二群腫瘤細胞在體內(nèi)連續(xù)傳代不超過5代。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第一群傳代腫瘤細胞在體內(nèi)傳代至少5代。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述傳代在小鼠中實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述傳代是通過將所述原發(fā)性腫瘤異種移植物的組織樣品的非解離細胞植入動物體內(nèi)來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述傳代是通過將所述原發(fā)性腫瘤異種移植物的單細胞懸液植入動物體內(nèi)來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在mRNA水平實現(xiàn)測定所述至少一種多肽的表達。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在蛋白質(zhì)水平實現(xiàn)測定所述至少一種多肽的表達。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述癌細胞侵襲性表型選自癌細胞標志物的水平、基因表達譜、獲取異種移植物的時間、產(chǎn)生異種移植物所需的細胞數(shù)量、遷移能力、侵入非癌組織的能力和增殖水平。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第一群腫瘤細胞尚未進行免疫隔離。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述抗原是根據(jù)本文描述的方法鑒定的癌癥干細胞標志物。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述抗原為多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，原發(fā)性腫瘤中所述多肽的表達:體內(nèi)傳代細胞中所述多肽的表達的比率為至少1:5。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述體內(nèi)傳代細胞包含已進行至少3次體內(nèi)傳代的細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多肽為賴氨酰氧化酶(LOX)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述試劑為β-氨基丙腈(BAPN)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，當(dāng)所述癌癥干細胞標志物選自信號素3C(SEMA3C)、賴氨酰氧化酶(LOX)、糖蛋白M6A(GPM6A)、肝細胞生長因子(HGF/SF)和醛脫氫酶1(ALDH1)時，所述癌癥為ATRT。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然在本發(fā)明實施方案的實踐或試驗中可使用與本文所述類似或等效的方法和材料，但是下面描述的是示例性方法和/或材料。如有沖突，以專利說明書，包括定義為準。另外，所述材料、方法和實例僅為說明性而非旨在為必要性限制。附圖說明本文僅以舉例的方式，參考附圖描述了本發(fā)明的一些實施方案?，F(xiàn)詳細地具體參考附圖，強調(diào)所示細節(jié)僅舉例而言并且是為了說明性討論本發(fā)明實施方案的目的。就這一點而言，隨附圖所做的描述使得對于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言可如何實踐本發(fā)明的實施方案顯而易見。圖中：圖1A-D.MRT的長期繁殖與CSC頻率增加相關(guān)。(A)連續(xù)Xn繁殖與腫瘤植入時間更短(藍色)和重量與切除時間比增大(紅色)有關(guān)聯(lián)，表明腫瘤行為朝更具侵襲性的表型變化；(B)原代MRT、早代Xn(P2)、中間代Xn(P7)和晚代Xn(P14)的H&E染色。Xn腫瘤細胞保持基本橫紋肌樣細胞形態(tài)，具有一些形態(tài)差異包括獲得梭形細胞、大面積壞死、凋亡小體更少且有絲分裂更多(白色箭頭)。比例尺，100μm(上)和50μm(下)；(C)細胞角蛋白AE1/AE3、上皮細胞膜抗原(EMA)、神經(jīng)絲蛋白(NFP)和波形蛋白(vimentin)的連續(xù)切片中原代MRT、早代Xn(P2)、中間代Xn(P7)和晚代Xn(P14)的IHC。高代Xn顯示分化標志物損失(上面三個圖)，而原發(fā)性腫瘤和Xn組織強烈表達波形蛋白(下圖)。比例尺，200μm；(D)比較原發(fā)性腫瘤、早代Xn(P3)和晚代(P17)間E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白的表達水平的qRT-PCR分析。上皮標志物(E-鈣粘蛋白)的表達在整個連續(xù)繁殖過程中被下調(diào)，而波形蛋白的表達保持持久。對于qRT-PCR分析，原發(fā)性腫瘤細胞的值用于歸一化(因此＝1)并且相對于其計算所有其它值。結(jié)果呈現(xiàn)為三次獨立實驗的平均值±S.E.M。*p<0.05；(D)來自低、中和高MRT傳代的Xn細胞的代表性流式細胞術(shù)分析，以分析單細胞懸液上幾種CSC標志物包括CD24、CD34、CD90、CD56、CD326和ALDH1抗原的表達。結(jié)果揭示ALDH1是MRTCSC標志物的良好候選物，呈現(xiàn)了通過Xn傳代增加表達的模式。圖2A-E.與腫瘤引發(fā)活性增強相關(guān)的全基因標記揭示了假定CSC生物標志物和新的治療靶標。(A)比較幾種不同樣品的微陣列基因表達分析：1.原代MRT，2.早期MRTXn(P2)，3.中間MRTXn(P7)，4.晚期MRTXn(P17)，5.人胚胎干細胞(hESC)，6.胎腎(FK)，7.成人腎(AK)，8.胎腦(FB)，9.成人腦(AB)。無監(jiān)管的分級群聚揭示了MRT晚代和hESC之間的巨大相似性，強調(diào)了它們的未分化特性；(B)對MRT組織的比較揭示了兩種不同的基因表達模式；在整個傳代過程中上調(diào)(紅色)和下調(diào)(綠色)的基因；(C)與MRT中CSC功能增強相關(guān)的前十種上調(diào)基因，包括信號素3C(SEMA3C)、賴氨酰氧化酶(LOX)、糖蛋白M6A(GPM6A)、肝細胞生長因子(HGF/SF)和醛脫氫酶1(ALDH1)；(D)比較不同MRT樣品間幾種增殖標志物(例如KI67、CDC20、CDK1和CCNA2)的表達模式的基因熱圖，揭示高代具高度增殖性；(E)功能分析證明與原發(fā)性腫瘤和低代Xn相比高代Xn中的細胞壞死、細胞死亡和細胞分化減少。圖3A-E.ALDH1是MRTCSC的假定標志物。(A)人MRTXn在NOD/SCID小鼠中連續(xù)繁殖導(dǎo)致表達ALDH1的細胞富集，圖解；(B)對不同MRTXn傳代的代表性FACS分析。隨著腫瘤進展，表達ALDH1的細胞的比例顯著增加，在源自P4的細胞中為4％(左)而在源自P10細胞的細胞中為25％(右)，表明通過Xn連續(xù)繁殖表達ALDH1+的細胞富集；(C)對原代MRT、中間代Xn(P7)和晚代Xn(P13)的ALDH1的IHC分析揭示隨著Xn連續(xù)繁殖而表達增加。比例尺，200μm；(D)對原代MRT的ALDH1的大放大倍數(shù)IHC分析證明高度表達ALDH1的細胞主要是大橫紋肌樣細胞。比例尺，200μm；(E)經(jīng)由qRT-PCR驗證揭示在晚代中ALDH1高度表達，相比于原發(fā)性腫瘤高約40倍。對于qRT-PCR分析，原發(fā)性腫瘤細胞的值用于歸一化(因此＝1)并且據(jù)此計算所有其它值。結(jié)果呈現(xiàn)為三次獨立實驗的平均值±S.E.M。*p<0.05；**p<0.01。圖4A-D.對ALDH1作為MRTCSC標志物的功能驗證。(A)比較ALDH1+和ALDH1-MRT細胞之間的菌落形成能力。ALDH1+細胞形成的菌落數(shù)量相比于ALDH1-細胞明顯更高(左上方柱狀圖；p＝0.0083)。與ALDH1-細胞相比，細胞數(shù)量/個菌落明顯更高(左下方柱狀圖；p＝0.0024)。右側(cè)呈現(xiàn)了由ALDH1+和ALDH-細胞形成的菌落的代表性圖像。實驗進行三次；(B)由ALDH1+細胞產(chǎn)生的腫瘤可進一步連續(xù)移植到二級受者中，展示出體內(nèi)自我更新能力，與在該群體中存在腫瘤引發(fā)能力一致；(C)RNA測序?qū)嶒炞C明相比于ALDH-細胞在ALDH+細胞中上調(diào)最多的基因是相比于原發(fā)性腫瘤在Xn晚代中明顯過表達的那些基因(例如ANXA1、GPM6A、HGF和LOX)。(D)經(jīng)由qRT-PCR驗證揭示相比于ALDH-細胞在分選的ALDH+中LOX高度表達。對于qRT-PCR分析，ALDH-細胞的值用于歸一化(因此＝1)并且據(jù)此計算所有其它值。結(jié)果呈現(xiàn)為三次獨立實驗的平均值±S.E.M；*p<0.05。圖5A-D.LOX抑制劑作為可能的MRT治療靶標的功能驗證。(A)對原發(fā)性腫瘤、早代(P2)、中間代(P7)和晚代(P14)MRT的LOX的IHC染色。染色揭示了隨著Xn連續(xù)繁殖廣泛、遞增的表達。比例尺，100μm；(B)BAPN對威爾姆氏腫瘤(WT)Xn的影響，威爾姆氏腫瘤是在小鼠中連續(xù)繁殖的常見小兒腎臟實體瘤。結(jié)果證明對WT細胞增殖無影響，表明LOX抑制對MRT細胞的特異性作用。**p<0.01；(C)BAPN處理誘導(dǎo)MRT細胞上的形態(tài)變化，包括核固縮和細胞吞噬。比例尺，100μm(上)和50μm(下)；(D)遷移測定揭示與未處理的細胞相比，100μMBAPN處理48小時顯著抑制MRT細胞的遷移能力。比例尺，1000μm。圖6.ATRTXn模型的建立，圖解。原發(fā)性腫瘤移植物通過皮下移植2-5mm腫瘤碎片到免疫缺陷小鼠中而形成。在允許腫瘤繁殖的所有小鼠中都觀察到腫瘤攝取。ATRTXn在NOD/SCID小鼠中的連續(xù)繁殖通過組織樣品移植或利用1x106個固定數(shù)量的細胞進行單細胞懸液移植來進行。連續(xù)繁殖允許我們建立低(<P5)、中(P5-P10)和高代(P10-P15)ATRTXn傳代。組織片段還用于IHC染色，RNA、DNA和蛋白質(zhì)分離。粘附細胞也用于腫瘤細胞的體外研究。圖7A-D.LOX抑制劑作為ATRTCIC/CSC治療劑的功能驗證。(A)處理后的細胞活力測定。對以不同濃度BAPN(10-1000fμM)生長48小時的P2Xn細胞進行MTS分析，檢查細胞活力。處理導(dǎo)致在用100μMBAPN處理之后增殖顯著減少(相比于UT細胞為47％)。**，p<0.01。(B)BAPN處理誘導(dǎo)ATRT細胞上的形態(tài)變化。處理后觀察到的變化為：核固縮和細胞吞噬。比例尺，100μm(上)和50μm(下)。(C)BAPN處理抑制細胞遷移。遷移測定揭示與未處理的細胞相比，100μMBAPN處理48小時顯著抑制ATRT細胞的遷移能力。比例尺，1000μm。(D)在ATRT細胞中BAPN有效抑制lox活性。LOX活性定量試劑盒在P3和P10細胞上用100μMBAPN處理后顯示出顯著抑制(分別為81％和63％)。圖8A-B是直到出現(xiàn)腫瘤的平均天數(shù)隨異種移植物傳代而變化的圖表。在尤文氏肉瘤(圖8A)和威爾姆氏腫瘤(圖8B)兩種中連續(xù)Xn繁殖與腫瘤植入時間更短有關(guān)聯(lián)，表明腫瘤行為朝更具侵襲性的表型變化。圖9是基因熱圖，其揭示了晚代腫瘤異種移植物為高度增殖性，呈現(xiàn)自我更新基因上調(diào)，具有侵入基因標記，預(yù)測了轉(zhuǎn)移性行為。圖10A-對幾種Xn傳代(P4、P8、P12和P17)的NCAM1的免疫組織化學(xué)分析(IHC)揭示隨Xn連續(xù)增殖而表達增加。比例尺，200μm；圖10B-qRT-PCR分析揭示相比于成人肺部對照在原發(fā)性腫瘤中NCAM1高度表達(右)并且相比于成人肺部在胎肺中NCAM1高度表達(左)。結(jié)果呈現(xiàn)為三次獨立實驗的平均值±S.E.M。*，p<0.05。圖11A-對幾種Xn傳代(P4、P8、P12和P17)的CD44的IHC分析揭示隨Xn連續(xù)增殖而表達增加。比例尺，200μm；圖11B-對原代PPB的CD44的大放大倍數(shù)IHC分析證明高度表達CD44的細胞沿著腫瘤分散。比例尺，200μm。具體實施方式本發(fā)明，在其一些實施方案中，涉及富集并鑒定原發(fā)性腫瘤中的癌癥干細胞及任選將其從中分離的方法。然后可以鑒定將癌癥干細胞與原發(fā)性腫瘤中存在的其它癌細胞區(qū)分開的標志物以便幫助診斷癌癥。另外，對于癌癥治療而言可靶向該標志物。在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明在其應(yīng)用上不一定限于以下描述中提出或通過實施例舉例說明的細節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實施方案或以各種方式實踐或?qū)嵤?。癌癥干細胞代表分級組織腫瘤中的惡性細胞亞類，其能夠選擇性地引發(fā)腫瘤和自我更新并且通過分化產(chǎn)生非致瘤性癌細胞后代的混合群體。作為生理干細胞抗藥性表型的觀察結(jié)果的推論，已假設(shè)CSC可能也代表癌癥中特征在于對化療和放療的抗性增加的亞群。因此，通過特定標志物靶向CSC的癌癥治療有可能通過降低復(fù)發(fā)和播散風(fēng)險而增加當(dāng)前治療形式的功效。癌癥干細胞的鑒定是一項復(fù)雜任務(wù)，尤其是鑒于它們通常在腫瘤細胞中以極低數(shù)量表達的這一事實。在小兒實體瘤中，對多種新鮮腫瘤標本的使用權(quán)有限使這個問題復(fù)雜化，進一步加強了穩(wěn)健性CSC分析和新型治療策略的有效開發(fā)。發(fā)明人結(jié)合人非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤(ATRT)、高侵襲性和致命性小兒腫瘤的長期體內(nèi)繁殖，與在免疫缺陷小鼠中的有限稀釋異種移植物而發(fā)現(xiàn)CSC表型。使用這種方法，發(fā)明人能夠使用少至50個細胞(與低代異種移植物相比少40倍)產(chǎn)生ATRT。發(fā)明人由這些實驗推斷，連續(xù)循環(huán)的異種移植可用于選擇另外的CSC表型并且這種方法對于癌癥診斷和治療而言是有價值的工具。與ATRT類似，發(fā)明人證實尤文氏肉瘤、威爾姆氏腫瘤和胸膜肺母細胞瘤(PPB)產(chǎn)生的異種移植物(Xn)的連續(xù)繁殖與腫瘤植入時間更短和腫瘤生長加速有關(guān)聯(lián)，表明腫瘤侵襲性隨著傳代而提升。因此，發(fā)明人推斷可以使用上述方法對多種癌癥進行CSC的鑒定。對于特定腫瘤的CSC的了解有助于新治療的開發(fā)。這可以在個性化水平(即檢查特定受試者腫瘤中的CSC并相應(yīng)地治療)或在更一般的水平(開發(fā)用于特定癌癥的治療劑)實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種鑒定人原發(fā)性腫瘤中的癌癥干細胞標志物的方法，其包括：(a)使所述原發(fā)性腫瘤體內(nèi)傳代許多代以產(chǎn)生第一群傳代腫瘤細胞；并且(b)比較所述原發(fā)性腫瘤的第一群傳代腫瘤細胞與所述原發(fā)性腫瘤的第二群腫瘤細胞中至少一種抗原的水平，其中所述第二群腫瘤細胞是：(i)所述人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞；或(ii)所述人原發(fā)性腫瘤的體內(nèi)傳代細胞，其中所述第二群腫瘤細胞已經(jīng)在體內(nèi)傳代比所述第一群傳代腫瘤細胞少至少一代，其中與第二群腫瘤細胞中所述抗原的量相比，第一群腫瘤細胞中所述抗原的量增加表明在所述人原發(fā)性腫瘤中有癌癥干細胞標志物。如本文中所用，術(shù)語“癌癥干細胞”，(也稱為“CSC”)，是指具有使用異種移植物(Xn)小鼠模型使癌癥再生的能力的細胞。CSC自身可以通過自我更新過程復(fù)制，這可以在連續(xù)移植測定法中進行研究。另外，源自純化CSC的癌癥再現(xiàn)它們所來源的親本癌癥的異源表型，反映了CSC的分化能力。如本文中所用，術(shù)語“腫瘤”是指通過失調(diào)細胞增殖而形成的一類細胞或組織。腫瘤可顯示出部分或完全缺乏結(jié)構(gòu)組織和與正常組織的功能協(xié)調(diào)，并且通常形成不同的組織團塊，該團塊可以是良性的或惡性的。在一個實施方案中，術(shù)語腫瘤是指惡性腫瘤。根據(jù)一個實施方案，術(shù)語“腫瘤細胞”還包含非實體癌細胞如白血病細胞。根據(jù)另一個實施方案，非實體癌的各個細胞未被術(shù)語“腫瘤細胞”所涵蓋。根據(jù)一個特定實施方案，所述腫瘤是具有胚胎干細胞來源的實體瘤(例如小兒的)。此類實體瘤的實例包括但不限于肉瘤和癌，例如但不限于：纖維肉瘤、粘液肉瘤、胸膜肺母細胞瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚性癌、威爾姆氏腫瘤、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和成視網(wǎng)膜細胞瘤。小兒實體瘤的實例包括但不限于：威爾姆氏腫瘤/腎母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、尤文氏家族的腫瘤/原始神經(jīng)外胚層腫瘤、骨肉瘤、外周神經(jīng)外胚層瘤、兒童期生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、腎癌、肝癌、成神經(jīng)細胞瘤、卵巢癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、肉瘤(更具體地，骨肉瘤、橫紋肌肉瘤)、促結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤、肝母細胞瘤、生殖細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤和成神經(jīng)管細胞瘤。短語“原發(fā)性腫瘤”如本文中所用是指從腫瘤進展開始并繼續(xù)產(chǎn)生癌性團塊的解剖部位獲得的細胞。所述抗原可以是與沒有使用異種移植物(Xn)小鼠模型使癌癥再生的能力并且自身無法通過自我更新過程復(fù)制的相同腫瘤的癌細胞相比，在CSC中以不同量存在的任何分子。因此，例如，CSC標志物可為多肽、碳水化合物、肽或RNA分子。所述抗原可位于細胞表面上或者可為細胞內(nèi)分子。根據(jù)一個特定實施方案，CSC標志物為多肽。所述多肽可為細胞表面蛋白(即膜蛋白)。根據(jù)一個特定實施方案，細胞表面蛋白為碳水化合物結(jié)合分子(例如凝集素)。根據(jù)另一個實施方案，所述蛋白為細胞內(nèi)蛋白(例如可溶性蛋白)。所述多肽可起到一定作用，例如用作轉(zhuǎn)錄因子、途徑相關(guān)標志物等。如本文中所用，短語“體內(nèi)傳代”是指包括原發(fā)性腫瘤初始植入動物(例如小鼠)體內(nèi)，等待一段時間直至繼發(fā)性腫瘤發(fā)展，收獲腫瘤細胞并將那些腫瘤細胞植入第二動物體內(nèi)(即連續(xù)移植)的過程。然后可進行后續(xù)連續(xù)傳代。本發(fā)明考慮傳代至少一代、至少兩代、至少三代、至少四代、至少五代、至少六代、至少七代、至少八代、至少九代和至少十代，至少十一代、至少十二代、至少十三代、至少十四代、至少十五代、至少十六代、至少十七代、至少十八代、至少十九代、至少二十代。根據(jù)一個特定實施方案，傳代5代或更多代，例如5-30代或5-20代之間。根據(jù)一個特定實施方案，傳代10代或更多代，例如10-30代或10-20代之間。根據(jù)一個特定實施方案，腫瘤細胞(第一群腫瘤細胞和/或第二群腫瘤細胞)尚未進行體內(nèi)傳代。根據(jù)再一個特定實施方案，腫瘤細胞尚未進行超過一輪體外傳代。用于體內(nèi)傳代的動物的實例包括線蟲、果蠅、斑馬魚；優(yōu)選使用實驗室哺乳動物如小鼠(裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、Beige/SCID小鼠)、大鼠、兔或靈長類動物(例如人)。根據(jù)一個實施方案，免疫缺陷動物。根據(jù)另一個實施方案，用人進行體內(nèi)傳代。通常，在每次體內(nèi)傳代中使用相同種類的動物。因此，例如，如果使用免疫缺陷小鼠進行初始移植，則使用免疫缺陷小鼠進行后續(xù)傳代?？芍踩肴魏瘟康脑l(fā)性腫瘤，只要其在第二動物中引發(fā)繼發(fā)性腫瘤發(fā)展。根據(jù)一個特定實施方案，將原發(fā)性腫瘤切成碎片(例如1-10mm碎片)。優(yōu)選地，不使用酶解離原發(fā)性腫瘤的細胞。另外，優(yōu)選不切碎或研磨原發(fā)性腫瘤的細胞。根據(jù)一個特定實施方案，在移植之前原發(fā)性腫瘤的細胞尚未進行一輪純化(例如免疫分離，如使用特異性結(jié)合NCAM的抗體通過流式細胞術(shù)進行)。進一步地，后續(xù)體內(nèi)傳代的異種移植物的細胞也優(yōu)選尚未進行一輪純化(例如免疫分離，如使用特異性結(jié)合NCAM的抗體通過流式細胞術(shù)進行)?？砂慈魏畏绞皆趧游矬w內(nèi)植入腫瘤，只要其引發(fā)腫瘤發(fā)展。根據(jù)一個實施方案，皮下植入腫瘤。通常，在植入約1-3個月后或在其達到1-3cm的尺寸例如1.5cm直徑時收獲腫瘤?？赏ㄟ^植入異種移植物的單細胞懸液或異種移植物組織碎片來實現(xiàn)后續(xù)異種移植物繁殖。對于單細胞懸液而言，解離細胞的數(shù)量將取決于體內(nèi)傳代中所用的動物和腫瘤的侵襲性。通常使用來自新取回的Xn組織的約0.5-3x106個解離細胞。異種移植物組織碎片通常介于1-10mm之間，更優(yōu)選地介于2-5mm之間?？梢酝ㄟ^在適當(dāng)介質(zhì)(優(yōu)選也含有抗生素)中切碎、研磨或分散，接著用蛋白酶如膠原酶處理來獲得單細胞懸液。然后可以在適當(dāng)介質(zhì)這搗碎經(jīng)酶處理的組織。根據(jù)一個特定實施方案，第二群腫瘤細胞是人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞。根據(jù)另一個實施方案，第二群腫瘤細胞已進行一輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第二群腫瘤細胞已進行兩輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第二群腫瘤細胞已進行三輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第二群腫瘤細胞已進行四輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第二群腫瘤細胞已進行超過五輪傳代。第一群腫瘤細胞至少已進行一輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少兩輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少三輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少四輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少五輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少六輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少七輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少八輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少九輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少十輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少十五輪體內(nèi)傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行至少二十輪體內(nèi)傳代。通常，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的5000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少5倍。如本文這所用，術(shù)語“異種移植”是指將來自一個種、屬或家族的個體的組織或器官手術(shù)移植或植入到另一個種、屬或家族的個體中。優(yōu)選地，在至少2只動物，例如3只動物、5只動物或更優(yōu)選甚至10只動物中測定引發(fā)晚代異種移植的頻率，以便得到統(tǒng)計上顯著的數(shù)字。因此，舉例而言，如果第二群腫瘤細胞在試驗的10小鼠中的1只中引發(fā)晚代異種移植，則第一群腫瘤細胞應(yīng)進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用相同數(shù)量的腫瘤細胞在10小鼠中的至少5只中引發(fā)晚代異種移植。通常，用于引發(fā)晚代異種移植的腫瘤細胞是在單細胞懸液中。試驗是否已經(jīng)引發(fā)晚代異種移植是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的專業(yè)知識范圍內(nèi)?？捎糜跍y定是否已經(jīng)引發(fā)異種移植的示例性方法包括總體腫瘤觸診、卡尺、超聲引導(dǎo)成像等。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的5000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少10倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的5000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少20倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的1000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少5倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的1000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少10倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的1000個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少20倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的500個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少5倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的500個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少10倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的500個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少20倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的100個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少5倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的100個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少10倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的100個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少20倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的50個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少5倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的50個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少10倍。根據(jù)一個實施方案，第一群腫瘤細胞已進行足夠的體內(nèi)傳代，使得使用所述第一群傳代細胞的50個細胞引發(fā)晚代異種移植的頻率與人原發(fā)性腫瘤的非傳代細胞相比增加至少20倍。通常，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行一輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行兩輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行三輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行四輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行五輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行六輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行七輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行八輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行九輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行十輪傳代。根據(jù)另一個實施方案，第一群腫瘤細胞已經(jīng)比第二群腫瘤細胞多進行十輪以上的傳代。在一個實施方案中，第一群腫瘤細胞已經(jīng)傳代，使得使得存在至少連續(xù)兩代不顯著增加的明顯腫瘤侵襲性表型。應(yīng)認識到在初始傳代期間，腫瘤侵襲性表型的增長率很高。經(jīng)過后續(xù)傳代，腫瘤侵襲性表型的增長率減緩，直到特定代數(shù)，達到穩(wěn)定狀態(tài)。此時腫瘤侵襲性表型的水平保持不變或者經(jīng)過后續(xù)傳代甚至可能降低。發(fā)明人考慮使腫瘤傳代許多代，使得腫瘤侵襲性表型達到穩(wěn)定狀態(tài)。穩(wěn)定狀態(tài)下腫瘤侵襲性表型的變化優(yōu)選不大于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或甚至1％?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的這個方面測量的腫瘤侵襲性表型的實例包括但不限于：癌細胞標志物的水平、基因表達譜、侵入性水平、轉(zhuǎn)移能力、轉(zhuǎn)移水平、獲取異種移植物的時間(即在動物模型中異種移植物產(chǎn)生特定尺寸的腫瘤的時間)、在動物模型中產(chǎn)生特定尺寸的異種移植物所需的細胞數(shù)量?？蓽y量的另外的腫瘤侵襲性表型包括染色體穩(wěn)定性、激酶活性、細胞粘附、凋亡、癌細胞生長、細胞周期蛋白生成、細胞增殖、癌細胞生長、測量克隆形成(clonogenicity)(軟瓊脂測定法)、測量錨定不依賴性生長、測量細胞周期調(diào)控、測量癌細胞運動性、測量血管生成及測量細胞死亡等。測量可以在體內(nèi)(即在動物模型中)或在體外(例如在細胞培養(yǎng)物中)實現(xiàn)。細胞增殖測定法包括但不限于MTT測定法(例如，VybrantRTMMTT細胞增殖測定試劑盒(Invitrogen))；BrdU摻入測定法(例如，Absolute-SSBIP測定法(Invitrogen))；測量細胞內(nèi)ATP水平(該測定法的商業(yè)形式包括ATPLiteTM-M、1,000測定試劑盒(PerkinElmer)和ATP細胞活力測定試劑盒(BioVision))；DiOc18測定法，一種可透過膜的染料(Invitrogen)；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定法(例如，Vibrant細胞毒性測定法(Invitrogen))；測量細胞LDH活性；及3H-胸腺嘧啶核苷摻入法和細胞滴度Glo測定法(Promega)。細胞周期進展可以通過溴脫氧尿苷(BRDU)摻入法來測定。此類測定法通過將BRDU摻入到新合成的DNA中來鑒定正在進行DNA合成的細胞群。然后可使用抗BRDU抗體(Hoshino等，1986,int.J.Cancer38,369；Campana等，1988,J.Immunol.Meth.107,79)，或通過其它方式檢測新合成的DNA。也可以通過磷酸化組蛋白H3染色來測定細胞增殖，這樣通過組蛋白H3的磷酸化鑒定出正在進行有絲分裂的細胞群。使用對組蛋白H3的絲氨酸10殘基的磷酸化形式有特異性的抗體來檢測組蛋白H3在絲氨酸10處的磷酸化。(Chadlee,D.N.1995,J.Biol.Chem.270:20098-105)。也可以使用3H-胸腺嘧啶核苷摻入法來檢查細胞增殖(Chen,J.,1996,Oncogene13:1395-403；Jeoung,J.,1995,J.Biol.Chem.270:18367-73)。這種測定法允許定量表征S-期DNA合成。在這種測定法中，合成DNA的細胞將使3H-胸腺嘧啶核苷摻入到新合成的DNA中。然后可以通過標準技術(shù)，例如通過在閃爍計數(shù)器(例如，BeckmanLS3800液體閃爍計數(shù)器)中對放射性同位素的計數(shù)來測量摻入。另一種增殖測定法使用染料AlamarBlue(可從BiosourceInternational得到)，其在活細胞中被還原時發(fā)熒光并且提供對細胞數(shù)量的間接測量(Voytik-HarbinSL等，1998,InVitroCellDevBiolAnim34:239-46)。再一種增殖測定法，即MTS測定法，是基于對工業(yè)化學(xué)品的體外細胞毒性評估，并且使用可溶性四唑鹽(MTS)。MTS測定法可商購并且包括PromegaCellTiter96.RTM.AQueousNon-RadioactiveCellProliferationAssay(產(chǎn)品目錄號G5421)。也可以通過軟瓊脂中的菌落形成來測定細胞增殖(Sambrook等，MolecularCloning,ColdSpringHarbor(1989))。也可以通過測量作為代謝活性細胞指標的ATP水平來測定細胞增殖。此類測定法可商購并且包括CellTiter-Glo.TM.((Promega)。也可以通過流式細胞術(shù)來測定細胞周期增殖(GrayJW等(1986)IntJRadiatBiolRelatStudPhysChemMed49:237-55)?？捎玫饣榧毎旧⑶以诹魇郊毎麅x中進行估計以測量在細胞周期的不同階段細胞的積累。可測量的腫瘤侵襲性表型的另一實例穿過屏障的能力。優(yōu)選地防止腫瘤細胞穿過屏障。腫瘤細胞的屏障可以是體外的人工屏障或體內(nèi)的天然屏障。體外屏障包括但不限于細胞外基質(zhì)涂層膜，如Matrigel。因此，然后如Parish,C.R.等，"ABasement-MembranePermeabilityAssaywhichCorrelateswiththeMetastaticPotentialofTumourCells,"Int.J.Cancer(1992)52:378-383所詳述，可以在Matrigel侵入測定系統(tǒng)中測試腫瘤細胞抑制腫瘤細胞侵入的能力。Matrigel是一種重組基底膜，其含有IV型膠原、層粘連蛋白(laminin)、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(如基底膜聚糖(perlecan)，其特異性結(jié)合并定位bFGF、玻連蛋白(vitronectin)以及轉(zhuǎn)化生長因子-.β.(TGF-.β.))、尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、組織纖溶酶原激活物(tPA)和稱為纖溶酶原激活物抑制劑1型(PAI-1)的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)。其它體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移測定法在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，參見，例如1999年8月10日發(fā)布的美國專利第5,935,850號，其通過引用并入本文。體內(nèi)屏障是指受試者體內(nèi)存在的細胞屏障。腫瘤的生長特征也可以用作腫瘤侵襲性表型(例如，群體倍增能力、倍增時間、至衰老的代數(shù))?；虮磉_譜(例如，基因芯片陣列；聚合酶鏈式反應(yīng)(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實時PCR和常規(guī)PCR))也可用于分析腫瘤侵襲性表型。本發(fā)明考慮到的另外的測定法在PouliotN、PearsonHB、BurrowsA.InvestigatingMetastasisUsingInVitroPlatforms.In:MadameCurieBioscienceDatabase[Internet].Austin(TX):LandesBioscience；2000有概述—其內(nèi)容通過引用并入本文。與腫瘤侵襲性相關(guān)性增加的癌細胞標志物的實例包括增殖標志物(例如KI67、E2F2和CDK1)、自我更新多梳基因(例如BMI1、TOP2A和EZH2)和轉(zhuǎn)移標記基因(例如SPARC、CXCR4和LTBP1)。應(yīng)認識到，進行根據(jù)本發(fā)明這個方面的方法，允許相對于第二群癌細胞在第一群癌細胞中富集癌癥干細胞。本發(fā)明考慮到癌癥干細胞富集水平為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或甚至100倍以上。第二群腫瘤細胞中的癌癥干細胞數(shù)量可為1000個腫瘤細胞中少于1個，2000個腫瘤細胞中少于1個，3000個腫瘤細胞中少于1個，4000個腫瘤細胞中少于1個，5000個腫瘤細胞中少于1個，6000個腫瘤細胞中少于1個，7000個腫瘤細胞中少于1個，8000個腫瘤細胞中少于1個，9000個腫瘤細胞中少于1個，10000個腫瘤細胞中少于1個。第一群腫瘤細胞中的癌癥干細胞數(shù)量通常為1000個腫瘤細胞中多于1個，900個腫瘤細胞中多于1個，800個腫瘤細胞中多于1個，700個腫瘤細胞中多于1個，600個腫瘤細胞中多于1個，500個腫瘤細胞中多于1個，400個腫瘤細胞中多于1個，300個腫瘤細胞中多于1個，200個腫瘤細胞中多于1個，100個腫瘤細胞中多于1個或甚至10個腫瘤細胞中多于1個。優(yōu)選地，第一群腫瘤細胞中癌癥干細胞:非癌癥干細胞的比率(即癌癥干細胞的頻率)使得可能通過用可接受的信噪比進行基因表達分析而檢測出標志物。應(yīng)認識到，抗原量的增加可能是由于每個細胞中抗原的量(例如每個細胞中多肽的表達水平)的增加和/或可能是由于包含抗原的細胞的頻率(例如表達所述多肽的細胞的數(shù)量)的增加。與第二群腫瘤細胞中抗原的量相比，第一群腫瘤細胞中抗原的量的總體增量通常為至少2倍、至少3倍、至少4倍或甚至至少5倍。包含抗原的細胞頻率的增加可以是增加2倍、增加3倍、增加4倍、增加5倍、增加6倍、增加7倍、增加8倍、增加9倍、增加10倍、增加20倍、增加30倍、增加40倍、增加50倍、增加60倍、增加70倍、增加80倍、增加90倍、增加100倍或更多。下文提供了分析蛋白質(zhì)表達的方法。應(yīng)認識到該方法可以在RNA水平或蛋白質(zhì)水平進行。檢測RNA表達水平的方法在本發(fā)明一些實施方案的細胞中RNA的表達水平可以使用本領(lǐng)域已知的方法測定。Northern印跡分析：這種方法涉及檢測RNA混合物中的特定RNA。通過用防止堿基對之間氫鍵結(jié)合的試劑(例如，甲醛)處理使RNA樣品變性，確保所有RNA分子具有未折疊的線性構(gòu)象。然后根據(jù)尺寸通過凝膠電泳分離單獨的RNA分子并轉(zhuǎn)移到基于硝酸纖維素或尼龍的膜上，變性RNA附著于該膜。然后將該膜暴露于標記DN探針?？墒褂梅派湫酝凰鼗蛎嘎?lián)核苷酸來標記探針?？梢允褂梅派渥燥@影術(shù)、比色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光進行檢測。這種方法允許量化特定RNA分子的量并通過膜上表示電泳期間在凝膠中的遷移距離的相對位置測定其同一性。RT-PCR分析：這種方法使用相對罕見RNA分子的PCR擴增。首先，從細胞中純化RNA分子并使用逆轉(zhuǎn)錄酶(如MMLV-RT)和引物(如寡dT、隨機六聚體或基因特異性引物)轉(zhuǎn)化為互補DNA(cDNA)。然后通過應(yīng)用基因特異性引物和TaqDNA聚合酶，在PCR儀中進行PCR擴增反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇基因特異性引物的長度和序列及適于檢測特定RNA分子的PCR條件(即，退火溫度、循環(huán)次數(shù)等)。應(yīng)認識到，可通過調(diào)節(jié)PCR循環(huán)次數(shù)并且將擴增產(chǎn)物與已知對照做比較而采用半定量RT-PCR反應(yīng)。RNA原位雜交染色：在這種方法中DNA或RNA探針附著于細胞中存在的RNA分子。通常，首先將細胞固定至顯微鏡載玻片以保護細胞結(jié)構(gòu)和防止RNA分子降解，然后經(jīng)受含有標記探針的雜交緩沖液。雜交緩沖液包括使得DNA或RNA探針與其原位靶mRNA分子的特異性雜交成為可能，同時避免探針的非特異性結(jié)合的試劑，如甲酰胺和鹽(例如，氯化鈉和檸檬酸鈉)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)μ囟ㄌ结樅图毎愋驼{(diào)節(jié)雜交條件(即，溫度、鹽和甲酰胺的濃度等)。雜交之后，洗掉所有未結(jié)合的探針并且使用已知方法檢測結(jié)合的探針。例如，如果使用放射性標記探針，則使載玻片經(jīng)受照相乳劑，其顯示使用放射性標記探針產(chǎn)生的信號；如果探針用酶標記，則添加酶特異性底物以形成比色反應(yīng)；如果探針使用熒光標記來標記，則使用熒光顯微鏡來顯示結(jié)合的探針；如果探針使用標簽(例如地高辛(digoxigenin)、生物素等)來標記，則可以在與可使用已知方法檢測的標簽特異性抗體的相互作用之后檢測結(jié)合的探針。原位RT-PCR染色：在NuovoGJ等[Intracellularlocalizationofpolymerasechainreaction(PCR)-amplifiedhepatitisCcDNA.AmJSurgPathol.1993,17:683-90]和KomminothP等[EvaluationofmethodsforhepatitisCvirusdetectioninarchivalliverbiopsies.Comparisonofhistology,immunohistochemistry,insituhybridization,reversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT-PCR)andinsituRT-PCR.PatholResPract.1994,190:1017-25]中描述了這種方法。簡言之，通過將標記的核苷酸摻入到PCR反應(yīng)中對固定細胞進行RT-PCR反應(yīng)。該反應(yīng)使用特定原位RT-PCR裝置如可從ArcturusEngineering(Mountainview,CA)獲得的激光捕獲顯微解剖PixCellILCM系統(tǒng)進行。DNA微陣列/DNA芯片：可以使用DNA微陣列同時分析成千上萬個基因的表達，允許分析生物在特定發(fā)育過程或生理反應(yīng)期間的完整轉(zhuǎn)錄程序。DNA微陣列由成千上萬個附著在支撐物如顯微鏡載玻片表面上的密集區(qū)的單獨基因序列組成。已經(jīng)開發(fā)了各種方法用于制備DNA微陣列。在一種方法中，單獨PCR擴增每個基因的編碼區(qū)的大約1千堿基片段。采用機器人裝置將每種擴增的DNA樣品涂敷到顯微鏡載玻片表面上的密集區(qū)，隨后通過熱和化學(xué)處理以使DNA序列與支撐物表面結(jié)合并使其變性。通常，此類陣列為約2x2cm并且含有約6000個單獨的核酸點。在該技術(shù)的變型中，由與支撐物表面共價結(jié)合的初始核苷酸合成了通常長度為20個核苷酸的多個DNA寡核苷酸，使得在支撐物表面上的小正方形區(qū)域中合成數(shù)以萬計的相同寡核苷酸。在載玻片的相鄰區(qū)域中合成來自單個基因的多個寡核苷酸序列，以分析該基因的表達。因此，在一張載玻片上可以展示成千上萬個基因。合成寡核苷酸的此類陣列在本領(lǐng)域中可稱為“DNA芯片”，與如上所述的“DNA微陣列”相對[Lodish等(編輯).章節(jié)7.8：DNAMicroarrays:AnalyzingGenome-WideExpression.In:MolecularCellBiology,，第4版，W.H.Freeman,NewYork.(2000)]。寡核苷酸微陣列-在這種方法中，能夠與本發(fā)明一些實施方案的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸探針附著于固體表面(例如，玻璃晶片)。每個寡核苷酸探針長度為大約20-25個核酸。為檢測特定細胞樣品(例如，血細胞)中本發(fā)明一些實施方案的多核苷酸的表達模式，使用本領(lǐng)域已知的方法(使用例如TRIZOL溶液，GibcoBRL,USA)從細胞樣品中提取RNA。雜交可以使用經(jīng)標記的寡核苷酸探針(例如，5'-生物素化探針)或經(jīng)標記的互補DNA(cDNA)或RNA(cRNA)片段進行。簡言之，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(例如，SuperscriptIIRT)、DNA連接酶和DNA聚合酶I，全部根據(jù)生產(chǎn)商的說明(InvitrogenLifeTechnologies,Frederick,MD,USA)由RNA制備雙鏈cDNA。為制備經(jīng)標記cRNA，使雙鏈cDNA在生物素化核苷酸的存在下使用(例如)BioArray高產(chǎn)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物標記試劑盒(Enzo,Diagnostics,AffymetixSantaClaraCA)進行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。為了有效雜交，可通過在94℃下在40mMTris乙酸鹽(pH8.1)、100mM乙酸鉀和30mM乙酸鎂中孵育RNA35分鐘使經(jīng)標記cRNA片段化。雜交后，洗滌微陣列并且使用共聚焦激光熒光掃描儀掃描雜交信號，該掃描儀測量與探針陣列結(jié)合的經(jīng)標記cRNA發(fā)射的熒光強度。例如，在Affymetrix微陣列(SantaClara,CA)中，陣列上的每個基因由一系列不同的寡核苷酸探針代表，其中，每個探針對由完美匹配的寡核苷酸和錯配寡核苷酸組成。雖然完美匹配探針具有與特定基因精確互補的序列，從而使得特定基因的表達水平的測量成為可能，但錯配探針與完美匹配探針的差異之處在于中心堿基位置處的單個堿基取代。使用Agilent掃描儀掃描雜交信號，并且MicroarraySuite軟件將錯配探針產(chǎn)生的非特異性信號從完美匹配探針產(chǎn)生的信號中減去。檢測蛋白質(zhì)表達和/或活性的方法可以使用本領(lǐng)域已知的方法測定在本發(fā)明一些實施方案的培養(yǎng)物的細胞中表達的蛋白質(zhì)的表達和/或活性水平。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：這種方法涉及將含有蛋白質(zhì)底物的樣品(例如，固定細胞或蛋白質(zhì)溶液)固定到表面如微量滴定板孔。涂敷與酶偶合的底物特異性抗體并使其與底物結(jié)合。然后采用與抗體偶合的酶通過比色反應(yīng)監(jiān)測并量化抗體的存在。這種方法中通常所采用的酶包括辣根過氧化酶和堿性磷酸酶。若良好校準并且在反應(yīng)的線性范圍之內(nèi)，樣品中存在的底物的量與產(chǎn)生的顏色的量成正比。通常采用底物標準品以提高定量精確性。蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)：這種方法涉及借助于丙烯酰胺凝膠將底物與其它蛋白質(zhì)分開，接著將底物轉(zhuǎn)移到膜(例如，尼龍(nylon)或PVDF)上。然后通過對底物有特異性的抗體檢測底物的存在，轉(zhuǎn)而用抗體結(jié)合試劑來檢測所述抗體。抗體結(jié)合試劑可以是，例如蛋白A或其它抗體?？贵w結(jié)合試劑可以如上文所述經(jīng)放射性標記或經(jīng)酶聯(lián)。可以使用放射自顯影術(shù)、比色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光進行檢測。這種方法允許量化底物的量并通過膜上表示電泳期間在丙烯酰胺凝膠中的遷移距離的相對位置測定其同一性。放射免疫測定法(RIA)：在一種型式中，這種方法涉及用固定在可沉淀載體如瓊脂糖珠粒上的特異性抗體和放射性標記的抗體結(jié)合蛋白(例如，經(jīng)I125標記的蛋白A)使所需蛋白(即，底物)沉淀。沉淀團中的計數(shù)數(shù)量與底物的量成正比。在RIA的替代性型式中，采用經(jīng)標記的底物和未標記的抗體結(jié)合蛋白。按不同量添加含有未知量的底物的樣品。來自經(jīng)標記的底物的沉淀計數(shù)的減少與所加樣品中底物的量成正比。熒光活化細胞分選(FACS)：這種方法涉及通過底物特異性抗體檢測細胞內(nèi)的原位底物。底物特異性抗體與熒光團聯(lián)接。借助于細胞分選儀進行檢測，細胞分選儀讀取當(dāng)細胞穿過光束時從細胞發(fā)射的光的波長。這種方法可同時采用兩種或更多種抗體。免疫組織化學(xué)分析：這種方法涉及通過底物特異性抗體檢測固定細胞內(nèi)的原位底物。底物特異性抗體可經(jīng)酶聯(lián)或與熒光團聯(lián)接。通過顯微鏡檢查法和主觀或自動評價進行檢測。如果采用酶聯(lián)抗體，則可需要比色反應(yīng)。應(yīng)認識到常常在免疫組織化學(xué)分析之后，使用例如蘇木精或吉姆薩染液(HematoxylineorGiemsastain)為細胞核復(fù)染。原位活性測定法：根據(jù)這種方法，在含活性酶的細胞上涂敷生色底物并且所述酶催化底物被分解生成通過光學(xué)或熒光顯微鏡可見的生色產(chǎn)物的反應(yīng)。體外活性測定法：在這些方法中測量提取自細胞的蛋白質(zhì)混合物中特定酶的活性。該活性可以在分光光度計孔中使用比色法測量或者可以在非變性丙烯酰胺凝膠(即，活性凝膠)中測量。電泳后，將凝膠浸入含有底物和比色試劑的溶液中。所產(chǎn)生的染色條帶與目標蛋白的酶活性相對應(yīng)。如果良好校準并且在反應(yīng)的線性范圍之內(nèi)，樣品中存在的酶的量與產(chǎn)生的顏色的量成正比。通常采用酶標準品以提高定量精確性。一經(jīng)鑒定了癌癥干細胞標志物，發(fā)明人就提出此類標志物可用于分離癌癥干細胞。考慮到的方法包括基于離心的方法、淘析(elutriation)、密度梯度分離、分離性輸血(apheresis)、親和性選擇、淘選(panning)、基于免疫學(xué)的系統(tǒng)如熒光活化細胞分選(FACS)；免疫親和性交換；非光學(xué)細胞分選方法，包括使用結(jié)合特定細胞類型的抗體涂層磁珠以分離所需細胞的磁性細胞分選。另外，發(fā)明人考慮到為了治療的目的而靶向CSC標志物。進一步地，發(fā)明人提出為了診斷、確定最佳治療、監(jiān)測治療功效和/或分期的目的而分析標志物的存在和/或水平。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過了一種診斷受試者中的癌癥的方法，其包括分析所述受試者腫瘤中抗原的存在，其中所述抗原的存在表明為癌癥，其中腫瘤的體內(nèi)傳代細胞:腫瘤的原代細胞中所述抗原的量的比率高于預(yù)定水平。如本文中所用，術(shù)語“診斷”是指將受試者分類為患有癌癥并且包括為癌癥分類，確定癌癥的嚴重程度(等級或時期)，監(jiān)測癌癥進展，預(yù)測癌癥的結(jié)果和/或恢復(fù)的希望。本發(fā)明的方法在檢測表面上健康的個體的早期癌癥中特別有用。受試者可以是正在進行常規(guī)健康檢查的健康動物或人類受試者?？蛇x地，受試者可處于患上癌癥的風(fēng)險中(例如，有遺傳素因的受試者、有癌癥醫(yī)療史和/或家族史的受試者、已經(jīng)暴露于致癌物、職業(yè)性危害、環(huán)境危害的受試者]和/或顯示出癌癥可疑臨床體征的受試者[例如，便血或黑糞癥、不明原因的疼痛、發(fā)汗、不明原因的發(fā)熱、不明原因的體重減輕至厭食、排便習(xí)慣改變(便秘和/或腹瀉)、里急后重(排便不全的感覺，特別是對于直腸癌而言)、貧血和/或全身無力)。CSC的量將取決于癌癥的類型和時期。在一些實施方案中，CSC標志物的水平表明為癌癥。在其它實施方案中，CSC標志物的存在(與其水平無關(guān))表明為癌癥。腫瘤的體內(nèi)傳代細胞:腫瘤的原代細胞中所述抗原的表達比率至少高于2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、50:1或甚至100:1。腫瘤的體內(nèi)傳代細胞優(yōu)選已經(jīng)傳代至少一代、至少兩代、至少三代、至少四代、至少五代、至少六代、至少七代、至少八代、至少九代和至少十代，至少十一代、至少十二代、至少十三代、至少十四代、至少十五代、至少十六代、至少十七代、至少十八代、至少十九代、至少二十代。分析CSC標志物的表達可以使用上文描述的方法進行。根據(jù)一個特定實施方案，所述分析使用識別CSC標志物的抗體實現(xiàn)。各種類型的可檢測或報告部分可與抗體綴合。這些包括但不限于放射性同位素(如[125]碘)、磷光化學(xué)品、化學(xué)發(fā)光化學(xué)品、熒光化學(xué)品(熒光團)、酶、熒光多肽、親和性標簽和可通過正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)(PET)或磁共振成像(MRI)檢測的分子(造影劑)。合適的熒光團的實例包括但不限于藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)、Cy-鉻、若丹明(rhodamine)、綠色熒光蛋白(GFP)、藍色熒光蛋白(BFP)、德州紅(Texasred)、PE-Cy5等。另外的關(guān)于熒光團選擇的指導(dǎo)、使熒光團聯(lián)接到各種類型的分子的方法，參見RichardP.Haugland,“MolecularProbes:HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals1992–1994”，第5版，MolecularProbes,Inc.(1994)；OncoimmuninInc.的美國專利第6,037,137號；Hermanson,“BioconjugateTechniques”,AcademicPressNewYork,N.Y.(1995)；KayM.等，1995.Biochemistry34:293；Stubbs等，1996.Biochemistry35:937；GakamskyD.等，“EvaluatingReceptorStoichiometrybyFluorescenceResonanceEnergyTransfer,”在“Receptors:APracticalApproach,”第2版中，StanfordC.和HortonR.(編輯)，OxfordUniversityPress,UK.(2001)；Targesome,Inc.的美國專利第6,350,466號]。與熒光可檢測部分綴合時，可用于檢測抗體的熒光檢測方法包括，例如熒光活化細胞分選(FACS)、免疫熒光共聚焦顯微鏡檢查法、熒光原位雜交(FISH)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。許多類型的酶可附著于抗體[例如，辣根過氧化酶(HPR)、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶(AP)]并且可以使用ELISA(例如，在溶液中)、酶聯(lián)免疫組織化學(xué)測定法(例如，在固定組織中)、酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光測定法(例如，在電泳分離的蛋白質(zhì)混合物中)或本領(lǐng)域已知的其它方法[參見例如，KhatkhatayMI.和DesaiM.,1999.JImmunoassay20:151-83；WisdomGB.,1994.MethodsMolBiol.32:433-40；IshikawaE.等，1983.JImmunoassay4:209-327；OellerichM.,1980.JClinChemClinBiochem.18:197-208；SchuursAH.和vanWeemenBK.,1980.JImmunoassay1:229-49)進行酶綴合抗體的檢測。示例性的可檢測部分包括但不限于綠色熒光蛋白、堿性磷酸酶、過氧化物酶、組氨酸標簽、生物素、橙色熒光蛋白和鏈霉親和素。應(yīng)認識到，CSC的鑒定具有多種應(yīng)用，其涉及單獨優(yōu)化癌癥治療、監(jiān)測受試者中的抗癌治療、為受試者確定抗癌治療及鑒定能夠治療癌癥的試劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種監(jiān)測受試者中的癌癥治療的方法，其包括分析在所述癌癥治療施用之后所述受試者的原發(fā)性腫瘤中抗原的水平，其中與所述癌癥治療施用之前所述抗原的水平相比，所述抗原的水平降低表明為治療性治療，其中腫瘤的體內(nèi)傳代細胞中所述抗原的量:腫瘤的原代細胞中所述抗原的量高于預(yù)定水平。根據(jù)本發(fā)明的這個方面分析的癌癥治療可以是如下文所進一步描述的試劑或條件。如本文中所用，術(shù)語“試劑”是指包含生物試劑或化學(xué)試劑的試驗組合物。可根據(jù)本發(fā)明的方法作為潛在抗癌劑測試的生物試劑的實例包括但不限于核酸，例如多核苷酸、核酶、siRNA和反義分子(包括但不限于具有改變的骨架和/或bass結(jié)構(gòu)或其它化學(xué)修飾的RNA、DNA、RNA/DNA雜種、肽核酸和多核苷酸類似物)；蛋白質(zhì)、多肽(例如肽)、碳水化合物、脂質(zhì)和“小分子”藥物候選物?！靶》肿印笨梢允牵?，分子量小于約10,000道爾頓，優(yōu)選小于約5,000道爾頓，及最優(yōu)選小于約1,500道爾頓的天然存在的化合物(例如，源自植物提取物、微生物發(fā)酵液等的化合物)或合成有機或有機金屬化合物?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法作為潛在抗癌劑測試的條件的實例包括但不限于輻射暴露(如γ輻射、UV輻射、X輻射)。根據(jù)本發(fā)明這個方面的一個實施方案，“CSC標志物”也在接觸癌癥治療之前受測定，以便可在治療前后進行比較。根據(jù)本發(fā)明這個方面的另一個實施方案，使所述試劑經(jīng)受癌細胞足夠長的時間才具有抗癌效果。正如所提到的那樣，對癌癥干細胞標志物的鑒定也允許治療表達此類標志物的癌癥。如本文中所用，術(shù)語“治療”包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)病狀的進展，基本上改善病狀的臨床或美學(xué)癥狀或基本上防止病狀的臨床或美學(xué)癥狀的出現(xiàn)。應(yīng)認識到，如果癌癥干細胞標志物為細胞表面抗原，則發(fā)明人考慮使用能夠結(jié)合標志物的分子(例如抗體)，使治療性部分靶向那些分子。治療性部分可以是，例如，細胞毒性部分、毒性部分、細胞因子部分和包含對本發(fā)明抗體的不同特異性的二次抗體部分。優(yōu)選地，所述抗體特異性結(jié)合CSC標志物的至少一個表位。如本文中所用，術(shù)語“表位”是指抗原上與抗體互補位結(jié)合的任何抗原決定簇。表位決定簇通常由諸如氨基酸或碳水化合物側(cè)鏈等分子的化學(xué)活性表面基團(groupings)組成并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。術(shù)語“抗體”如本文中所用包括能夠結(jié)合巨噬細胞的完整分子及其功能片段，如Fab、F(ab')2和Fv。這些功能抗體片段定義如下：(1)Fab，含有抗體的單價抗原結(jié)合片段的片段，可以通過下述方式產(chǎn)生：用木瓜蛋白酶消化全抗體以產(chǎn)生完整輕鏈和一條重鏈的一部分；(2)Fab'，抗體分子的片段，可以通過下述方式產(chǎn)生：用胃蛋白酶處理全抗體，接著還原以產(chǎn)生完整輕鏈和一部分重鏈；每個抗體分子獲得兩個Fab'片段；(3)(Fab')2，抗體分子的片段，可以通過下述方式產(chǎn)生：用胃蛋白酶處理全抗體，無需后續(xù)還原；(Fab')2是通過兩個二硫鍵結(jié)合在一起的兩個Fab'片段的二聚體；(4)Fv，定義為含有作為兩條鏈表達的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程化片段；及(5)單鏈抗體(“SCA”)，含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，通過合適的多肽接頭連接成基因融合單鏈分子的基因工程化分子。下文，表1中提供了可與本發(fā)明的抗體綴合的治療性部分的非限制性實例。表1核酸序列氨基酸序列治療性部分EU090068ABU63124假單胞菌外毒素AY820132.1AAV70486白喉毒素A02159CAA00227白細胞介素2X03884P07766CD3NM_000569.6NP_000560.5CD16NM_000589.2NP_000580.1白細胞介素4K02883P01892HLA-A2M57627P22301白細胞介素10EQ975183EEF27734蓖麻毒素表1也可以使用本領(lǐng)域中廣泛實踐的標準化學(xué)合成技術(shù)[參見例如，hypertexttransferprotocol://worldwideweb(dot)chemistry(dot)org/portal/Chemistry)]，例如使用任何合適的化學(xué)連接(直接或間接的)，如經(jīng)由肽鍵(當(dāng)功能部分為多肽時)或經(jīng)由與插入接頭元件(如接頭肽)或其它化學(xué)部分(如有機聚合物)的共價鍵合，使治療性部分附著于本發(fā)明的抗體。嵌合肽可經(jīng)由在肽的羧基(C)或氨基(N)末端鍵合，或經(jīng)由與內(nèi)部化學(xué)基團如直鏈、支鏈或環(huán)狀側(cè)鏈、內(nèi)部碳原子或氮原子等鍵合而聯(lián)接。在美國專利第3,940,475、4,289,747和4,376,110號中詳細地提供了抗體熒光標記的描述。識別CSC標志物的抗體可附著于包含細胞毒性劑的顆粒。如本文中所用，短語“封裝顆?！笔侵柑卣髟谟诖嬖谟尚纬梢粋€或多個內(nèi)部孔隙的脂質(zhì)和/或脂肪酸配制的一種或多種壁或膜的實體。該壁或膜可以是同心的或另外的。囊泡的壁或膜可基本上為固體(均勻)，或稱為，例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)球、納米脂質(zhì)體、顆粒、膠束、氣泡、微泡、微球、納米球、納米結(jié)構(gòu)、微珠、微膠囊、氣凝膠、籠形包合物結(jié)合囊泡、六角/立方體/六角II相結(jié)構(gòu)等。封裝顆粒中所包括的脂質(zhì)組分可包括經(jīng)靶向分子衍生化的脂質(zhì)，或具有可以根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)預(yù)成型顆粒中的靶向分子衍生化的極性頭部化學(xué)基團的脂質(zhì)。使靶向部分與封裝顆粒共價附著的其它方法包括使用酰胺、酯或醚鍵、鏈霉親和素和生物素(參見，例如美國專利第5,171,578號)及肽經(jīng)碳二亞胺活化，接著偶合至活化羧基(例如美國專利第5,204,096號)。美國專利第5,258,499號中公開了可用于使肽與脂質(zhì)共價結(jié)合的方法的其它實例。另外，本發(fā)明考慮使用能夠下調(diào)CSC標志物的表達的試劑下調(diào)CSC標志物的表達以治療癌癥。下調(diào)可以在蛋白質(zhì)水平(例如使用中和抗體)或RNA水平(例如使用siRNA、DNA酶、核酶、miRNA等)實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個特定方面，所述癌癥為非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤(ATRT)?？捎糜谥委熯@種癌癥的示例性試劑是靶向(并下調(diào))下列多肽中的至少一種的那些試劑：信號素3C(SEMA3C)、賴氨酰氧化酶(LOX)、糖蛋白M6A(GPM6A)、肝細胞生長因子(HGF/SF)和醛脫氫酶1(ALDH1)，從而治療ATRT。因此，可用于治療ATRT的示例性試劑是靶向(并下調(diào))賴氨酰氧化酶(LOX)的一種試劑–例如β-氨基丙腈(BAPN)。該試劑可自身或作為藥物組合物的一部分施用。如本文中所用，“藥物組合物”是指本文所述一種或多種活性成分與其它化學(xué)組分如生理上合適的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的用途是利于向生物施用化合物。在本文中術(shù)語“活性成分”是指可說明生物學(xué)效應(yīng)的組分。在下文中，可互換使用的短語“生理上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”是指不會對生物產(chǎn)生明顯刺激并且不會消除所施化合物的生物學(xué)活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。在這些短語下包括佐劑。在本文中術(shù)語“賦形劑”是指添加到藥物組合物中以進一步促進活性成分的施用的惰性物質(zhì)。賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各類淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。在通過引用并入本文的“Remington’sPharmaceuticalSciences,”MackPublishingCo.,Easton,PA最新版中可以找到用于藥物配制和施用的技術(shù)。合適的施用途徑可以(例如)包括口服、直腸、經(jīng)粘膜，尤其是經(jīng)鼻、腸道或腸胃外遞送，包括肌肉內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、心臟內(nèi)注射到(例如)右或左室腔、常見冠狀動脈，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)遞送藥物的常規(guī)方法包括：神經(jīng)外科策略(例如，腦內(nèi)注射或腦室內(nèi)輸注)；對試劑的分子操作(例如，產(chǎn)生包含對內(nèi)皮細胞表面分子有親和力的轉(zhuǎn)運肽連同自身不能穿過BBB的試劑的嵌合融合蛋白)以試圖開拓BBB的其中一條內(nèi)源轉(zhuǎn)運途徑；設(shè)計用于增加試劑的脂溶性的藥理學(xué)策略(例如，水溶性試劑與脂質(zhì)或膽固醇載體綴合)；及通過高滲破壞(由于向頸動脈輸注甘露醇溶液或使用生物活性劑如血管緊張肽而引起)來暫時性破壞BBB完整性。然而，這些策略中的每一種都有局限性，如與侵入性手術(shù)相關(guān)的固有風(fēng)險，內(nèi)源轉(zhuǎn)運系統(tǒng)固有的局限性所強加的尺寸局限性，與全身性施用由可在CNS外有活性的載體基序組成的嵌合分子相關(guān)的潛在不良生物副作用，及在BBB被破壞的腦部區(qū)域內(nèi)有腦部損傷的可能性風(fēng)險，這致使所述策略成為次優(yōu)遞送方法?？蛇x地，藥物組合物可以局部而非全身性方式施用，例如經(jīng)由向患者的組織區(qū)域直接注射藥物組合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的工藝，例如借助于常規(guī)混合、溶解、?；?、制糖丸、淘洗、乳化、封裝、包埋或凍干工藝來生產(chǎn)本發(fā)明的藥物組合物。因此供根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可按常規(guī)方式使用一種或多種生理上可接受的載體，包括利于將活性成分加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑的賦形劑和助劑配制。適當(dāng)?shù)呐浞饺Q于所選施用途徑。對于注射而言，藥物組合物的活性成分可配制于水溶液，優(yōu)選生理上相容的緩沖液如漢克氏液(Hank’ssolution)、林格氏液(Ringer’ssolution)或生理鹽緩沖液中。對于經(jīng)粘膜施用而言，在配制中使用適于待透過屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。對于口服施用而言，可通過將活性化合物與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體合并而容易地配制藥物組合物。此類載體使得能夠?qū)⑺幬锝M合物配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、混懸劑等，供患者口服。供口服用的藥理學(xué)制劑可以使用固體賦形劑制成，任選地在添加合適助劑之后(若需要)研磨所得混合物，并且加工顆?；旌衔?，以獲得片劑或糖衣丸核。合適的賦形劑尤其是填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可以添加崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽如藻酸鈉。為糖衣丸核提供合適的包衣。為此，可以使用濃糖汁，其可任選地含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠(carbopolgel)、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液及合適的溶劑溶劑或溶劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蛱且峦璋轮刑砑尤玖匣蛏匾澡b別或表征活性化合物劑量的不同組合?？煽诜褂玫乃幬锝M合物包括由明膠制成的推入配合膠囊以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)制成的軟、密封膠囊。推入配合膠囊可含有與填充劑(如乳糖)、粘合劑(如淀粉)、潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)和任選地穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性成分可溶解或懸浮在合適的液體，如脂肪油、液體石蠟或液體聚二乙醇中。另外，可添加穩(wěn)定劑。供口服施用的所有配制劑應(yīng)該呈適合所選施用途徑的劑量。對于口腔含服施用而言，所述組合物可呈以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。對于通過鼻吸入施用而言，供根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分便于呈氣溶膠噴霧呈現(xiàn)形式使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳從加壓包或霧化器中遞送。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供一閥門以遞送計量的量來確定劑量單位?？膳渲评缬糜诜峙淦髦械拿髂z的膠囊和藥盒，其含有所述化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。本文描述的藥物組合物可配制用于腸胃外施用，例如通過快速濃注或連續(xù)輸注。供注射的配制劑可呈單位劑量形式，例如在安瓿或多劑量容器中任選地與添加的防腐劑一起呈現(xiàn)。該組合物可以是在油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液，并且可含配方劑，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。供腸胃外施用的藥物組合物包括呈水溶性形式的活性制劑水溶液。另外，可將活性成分的混懸液制備成適當(dāng)?shù)挠托曰蛩⑸浠鞈乙骸：线m的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可含有增加混懸液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，混懸液還可含合適的穩(wěn)定劑或增加活性成分的溶解度以允許制備高濃縮溶液的試劑?？蛇x地，活性成分可呈粉末形式以在使用之前，用合適的媒介物，例如無菌、無熱源水基溶液復(fù)水。也可以使用(例如)常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可油或其它甘油酯，將本發(fā)明的藥物組合物配制成直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑。適合用于本發(fā)明情況的藥物組合物包括其中含有有效達到預(yù)期目的的量的活性成分的組合物。更具體地，治療有效量意指有效預(yù)防、減輕或改善病癥癥狀或延遲受治受試者的存活期的活性成分的量。治療有效量的測定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的詳細公開內(nèi)容。對于用于本發(fā)明方法中的任何制劑而言，治療有效量或劑量最初均可由體外和細胞培養(yǎng)測定法估計。例如，在動物模型中可以配制一個劑量以達到所需濃度或滴度。此類信息可用于更精確地測定在人類中的有用劑量。可以通過標準制藥工序在體外、細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y定本文描述的活性成分的毒性和治療功效。從這些體外和細胞培養(yǎng)測定法及動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一系列用于人類的劑量。該劑量可根據(jù)采用的劑量形式和利用的施用途徑而改變。確切的配方、施用途徑和劑量可由個別醫(yī)師鑒于患者的情況來選擇。(參見例如，F(xiàn)ingl等，1975，在"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"，第1章第1頁)。可單獨調(diào)節(jié)劑量和間隔以提供足以誘導(dǎo)或抑制生物學(xué)效應(yīng)的活性成分水平(最低有效濃度，MEC)。MEC對于每種制劑而言將會不同，但是可由體外數(shù)據(jù)估計。達到MEC所必需的劑量將取決于個體特征和施用途徑。檢測測定法可用于測定血漿濃度。根據(jù)待治病狀的嚴重程度和反應(yīng)性，給藥可以是單次或多次施用，療程持續(xù)幾天至幾周，直至實現(xiàn)治愈或達到疾病狀態(tài)減輕。當(dāng)然，要施用的組合物的量將取決于受治受試者、疾患的嚴重程度、施用方式、處方醫(yī)師的判斷等。若需要，本發(fā)明的組合物可以呈現(xiàn)在包裝或分配器裝置，如FDA批準的試劑盒中，其可容納一個或多個含活性成分的單位劑量形式。所述包裝可以，例如包含金屬或塑料箔，如泡罩包裝。所述包裝或分配器裝置可附有施用說明書。所述包裝或分配器也可提供有呈監(jiān)管藥品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)所規(guī)定形式的與容器相關(guān)的通知，該通知反映了該機構(gòu)對組合物形式或人類或獸醫(yī)施用的批準。此類通知，例如，可以具有經(jīng)美國食品和藥物管理局對于處方藥所批準的標簽或具有批準的產(chǎn)品插頁。正如以上進一步詳述的那樣，也可以制備包含配制于相容性藥物載體中的本發(fā)明制劑的組合物，放置在適當(dāng)容器中，并標示用于治療指定病狀。術(shù)語“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其同根詞意為“包括但不限于”。該術(shù)語涵蓋術(shù)語“由……組成”和“基本上由……組成”。短語“基本上由……組成”意指所述組合物或方法可包括附加成分和/或步驟，但只有在附加成分和/或步驟不實質(zhì)性改變要求保護的組合物或方法的基本和新穎特征時。如本文中所用，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式“一”、“一種(個)”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示物。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。在本申請通篇，本發(fā)明的各個實施方案均可呈范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)理解呈范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔而不得解釋為對本發(fā)明范圍的僵化限制。因此，范圍的描述應(yīng)視為已經(jīng)具體公開了所有可能的子范圍以及在該范圍內(nèi)的獨立數(shù)值。例如，范圍的描述如1至6應(yīng)視為已經(jīng)具體公開了子范圍如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該范圍內(nèi)的獨立數(shù)值，例如1、2、3、4、5和6。不管范圍的寬度如何，這都適用。當(dāng)在本文中指定數(shù)值范圍時，這意味著包括指定范圍內(nèi)的任何引用數(shù)值(小數(shù)或整數(shù))。短語“范圍介于”第一指定數(shù)值和第二指定數(shù)值之間及“范圍為”第一指定數(shù)值“至”第二指定數(shù)值在本文中可互換使用并且意為包括第一和第二指定數(shù)值以及之間的所有小數(shù)和整數(shù)數(shù)值。如本文中所用，術(shù)語“方法”是指用于實現(xiàn)指定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和工序，包括但不限于化學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)人員已知或易于由已知方式、手段、技術(shù)和工序開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和工序。詞“示例性”在本文中用于意指“用作實例、例子或說明”。描述為“示例性”的任何實施方案不一定被解釋為優(yōu)先于或優(yōu)于其它實施方案和/或?qū)⑻卣鞯牟⑷霃钠渌鼘嵤┓桨钢信懦Ｔ~“任選地”在本文中用于意指“在一些實施方案中提供而在其它實施方案中未提供”。除非此類特征沖突，否則本發(fā)明的任何特定實施方案均可包括多個“任選”特征。應(yīng)當(dāng)理解，為了清楚起見在單獨實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征也可在單個實施方案中呈組合提供。相反，為簡潔起見在單個實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征也可單獨地或呈任何合適的子組合或如其所應(yīng)在本發(fā)明的任何其它所述實施方案中提供。不得將各個實施方案的上下文中描述的某些特征視為那些實施方案的必需特征，除非沒有那些要素該實施方案無效。如上文所述以及如下面的權(quán)利要求部分所要求保護的本發(fā)明的各個實施方案和方面從以下實施例中得到實驗性支持。實施例現(xiàn)參考以下實施例，與以上描述一起以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實施方案。通常，本文所用的命名和本發(fā)明中利用的實驗室工序包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻中透徹地解釋了此類技術(shù)。參見，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"第I-III卷Ausubel,R.M.編輯(1994)；Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等，"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries"，第1-4卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美國專利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057號中闡述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"，第I-III卷，Cellis,J.E.編輯(1994)；"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第3版；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III版ColiganJ.E.編輯(1994)；Stites等(編輯),"BasicandClinicalImmunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；在專利和科學(xué)文獻中廣泛地描述了可用免疫測定法，參見，例如，美國專利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521號；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.編輯(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.編輯(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"第1-317卷，AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；其全部通過引用并入，如同在本文中全面闡述一樣。在本文件全篇提供了其它一般參考文獻。據(jù)信其中的工序在本領(lǐng)域中眾所周知并且是為了方便讀者而提供。其中所含全部信息通過引用并入本文。實施例1作為鑒定、分離和靶向癌癥干細胞的平臺的非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤異種移植模型的長期繁殖材料和方法原發(fā)性非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤樣品：在1小時手術(shù)內(nèi)從患者獲得原發(fā)性ATRT樣品。根據(jù)赫爾辛基宣言(declarationofHelsinki)由所涉及的患者的法定監(jiān)護人授予知情同意。體內(nèi)異種移植物形成：動物實驗根據(jù)舍巴醫(yī)療中心動物實驗指南(GuidelinesforAnimalExperimentsofShebaMedicalCenter)進行。如先前所述(Dekel等，2006a)，進行對5-8周齡、雌性、非肥胖性糖尿病免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的初始ATRT異種移植。簡言之，將原發(fā)性ATRT組織切成2-5mm碎片并且皮下植入小鼠背部。將小鼠保持在無病原體的環(huán)境中并且每周監(jiān)測腫瘤生長。每周通過觸診檢測繼發(fā)性腫瘤。在植入大約1-3個月后或當(dāng)腫瘤達到1.5cm直徑的尺寸時收獲腫瘤。記錄每個植入Xn的植入時間、切除時間、重量和體積。立即將Xn組織切成小碎片并且如下進行處理用于進一步實驗：(i)速凍以進行提取的分析物的后續(xù)分子表征；(ii)福爾馬林固定和石蠟包埋以進行進一步的免疫組織化學(xué)(IHC)研究；(iii)向NOD/SCID小鼠的側(cè)腹皮下植入組織；及(iv)如下所述制備單細胞懸液以進行后續(xù)Xn繁殖和體外實驗(體外研究、有限稀釋測定法和FACS分選)。通過在含有抗生素(青霉素和鏈霉素)的伊斯考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM)中切碎樣品，接著在37℃下用膠原酶IV處理2小時獲得單細胞懸液。使用為膠原酶溶液兩倍體積的IMDM研磨經(jīng)酶處理的組織并且過濾懸液(100μm細胞濾網(wǎng))并用含抗生素的IMDM洗滌兩次。用ACKRBS裂解緩沖液去除紅細胞。使用兩種方法形成Xn連續(xù)傳代：1.連續(xù)注射大約1x106個來自新取回的ATRTXn的解離細胞；在100μl1:1無血清培養(yǎng)基/Matrigel(BDBiosciences,SanJose,CA)中注射細胞。2.將ATRTXn組織切成2-5mm碎片并且皮下植入小鼠背部。腫瘤繁殖細胞相對頻率的估計：為了評價和比較來自低代和高代的Xn細胞的致瘤活性，向NOD/SCID小鼠的側(cè)腹皮下注射懸浮在100μlPBS和100μlMatrigel中的細胞連續(xù)稀釋液(1×106–50個細胞)。使用ELDA在線軟件(bioinfdotwehidotedudotau/software/elda/)在線計算癌癥繁殖細胞的相對頻率的估計值。高ALDH細胞中腫瘤繁殖細胞相對頻率的估計：為了測定高ALDH細胞對應(yīng)于低ALDH細胞中腫瘤繁殖細胞的頻率，如上所述使用有限稀釋測定法。簡言之，根據(jù)得自Xn的細胞中的ALDHA1高表達進行細胞分選后，將分選的群體[ALDH1高、ALDH1低和未分選細胞(US)]收集到無菌DMEM中。使細胞重新懸浮在100μlPBS和100μlMatrigel中并于連續(xù)稀釋液中皮下注入到NOD/SCID小鼠的側(cè)腹。熒光活化細胞分選(FACS)分析：如先前所述(Dekel等，2006a)，進行對原發(fā)性ATRT細胞和后續(xù)Xn來源的新鮮細胞的FACS分析。將小腫瘤碎片解離成單細胞，在4℃下在RBC裂解液(由8.3gNH4Cl、1.0gKHCO3、1.8ml于雙蒸餾H2O中的5％EDTA組成)中按1ml/5ml細胞懸液比率洗滌。然后在最終離心之前通過30μm尼龍網(wǎng)過濾細胞。使全部細胞重新懸浮在由在PBS中的0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich,St.Louis)和0.02％疊氮化鈉組成的FACS緩沖液中。通過按每106個細胞5μg抗體的濃度用熒光染料綴合抗體在4℃下于黑暗中孵育30分鐘來標記表面標志物抗原[CD24(eBiosience,120247-42)、CD34(Miltenyi,3008100)、CD56(eBiosience,1205942)、CD90(BeckmanCoulter,IM3600U)]以防抗體內(nèi)化。另外，使用7-氨基-放線菌素D(7AAD；eBioscience,SanDiego,CA)進行活細胞門控。所有洗滌步驟均在FACS緩沖液中進行。所有定量測量均相比于IgG同型抗體(eBioscience,SanDiego,CA)進行。如先前所述(ChristopheGinestier等，2007；Dylla等，2008)，對具有高ALDH1酶活性的細胞的檢測使用ALDEFLUOR試劑盒(StemCellTechnologies,Durham,NC,USA)進行。使細胞懸浮在含有BODIPY-氨基乙醛(BAAA)(一種不帶電的ALDH1底物)的Aldefluor測定緩沖液中，接著在37℃下于黑暗中孵育30-45分鐘。BAAA僅被活細胞通過被動擴散攝取，然后在細胞內(nèi)被ALDH1轉(zhuǎn)化為BODIPY-氨基乙酸鹽(一種帶負電的反應(yīng)產(chǎn)物)，其保留在表達高水平ALDH1的細胞內(nèi)部，導(dǎo)致這些細胞變得具有明亮的熒光。這些表達ALDH1的細胞(ALDH1+)的熒光可以通過FACSAria(BDBiosciences,SanJose,CA)的綠色熒光通道(520-540nm)來檢測。作為陰性對照，對于每份細胞樣品而言，另外用二乙氨基苯甲醛(DEAB)(一種特異性ALDH1抑制劑)孵育在相同條件下處理的等分試樣。用BAAA孵育細胞，而不添加DEAB，導(dǎo)致定義ALDH1+群體的BAAA熒光的改變。因為只有具有完整細胞膜的細胞保留Aldefluor反應(yīng)產(chǎn)物，所以僅鑒定活性ALDH1+細胞。FACS分選：如上所述收獲細胞，在最終離心之前通過30μm尼龍網(wǎng)過濾細胞，然后重新懸浮在FACS緩沖液或ALDEFLUOR緩沖液中。使用FACSAria以便富集表達表面標志物和ALDH1高活性的細胞。使用100-μm噴嘴(BDBiosciences,SanJose,CA)、20–25磅每平方英寸(PSI)的鞘壓力和1,000–3,000個事件/秒的獲得率作為經(jīng)優(yōu)化用于ATRT細胞分選的條件。在7AAD的基礎(chǔ)上門控單活細胞，然后物理分選到收集管中用于所有后續(xù)實驗。另外使用FlowJo軟件分析和呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。芯片陣列：將芯片陣列存放在公開文庫(GEO)中。所有實驗均使用AffymetrixHUGENE1.0寡核苷酸陣列進行(Pode-Shakked等，2009)。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，使用來自每份樣品的總RNA制備生物素化靶DNA。按照生產(chǎn)商的推薦，使用Affymetrix基因芯片儀系統(tǒng)處理由每份樣品產(chǎn)生的靶cDNA?？稍诰€找到質(zhì)量控制措施的詳情。過濾明顯變化的基因，變化至少兩倍(p值：0.05)。定量實時逆轉(zhuǎn)錄PCR分析-基因表達分析：進行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)以測定一組基因表達的變化倍數(shù)。使用RNeasyMicro試劑盒(QiagenGmbH,Hilden,Germany)根據(jù)生產(chǎn)商的說明從細胞分離總RNA。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AppliedBiosystems,CaliforniaUSA)在總RNA上合成cDNA。使用ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,California,USA)在TaqMan基因表達預(yù)混液(AppliedBiosystems,California,USA)的存在下進行實時PCR。使用基因特異性TaqMan基因表達測定預(yù)制試劑盒(AppliedBiosystems,California,USA)進行PCR擴增。每個分析反應(yīng)進行三次。在整個實驗分析中使用HPRT1或GAPDH作為內(nèi)源對照。使用SDSRQManager1.2軟件分析PCR結(jié)果。使用非配對雙尾T檢驗進行統(tǒng)計分析。在P<0.05時視為統(tǒng)計顯著性。H&E染色：石蠟包埋組織的H&E染色：將石蠟包埋組織的5μm切片固定在superfrost/plus載玻片上并且在60℃下孵育40分鐘。脫蠟后，載玻片在Mayer蘇木精溶液(Sigma-Aldrich)中孵育并且在70％乙醇中用1％HCl孵育1分鐘。然后載玻片在伊紅(Eosin)(Sigma-Aldrich)中孵育10秒。使用OlympusBX51TF成像。原發(fā)性ATRT和ATRTXn的免疫組織化學(xué)染色：從原發(fā)性ATRT和ATRTXn切下4-μm厚的切片用于免疫組織化學(xué)分析。如先前所述(Dekel等，2006b)進行免疫染色。簡言之，處理切片以免抗原氧化。在免疫染色之前，在97℃下用10mM檸檬酸鹽緩沖液，PH6.0處理切片10分鐘以便抗原恢復(fù)，接著用3％H2O2處理10分鐘。隨后使用標記鏈霉親和素-生物素(LAB-SA)方法，使用Histostainplus試劑盒(Zymed,SanFrancisco,CA,USA)為載玻片染色。通過基于HRP的色原/底物體系(液體DAB底物試劑盒–Zymed,SanFrancisco,CA,USA)使免疫反應(yīng)可視化。按1:100稀釋使用抗人ALDH1抗體(BDBiosciences,#611195)。通過基于HRP的色原/底物體系(液體DAB底物試劑盒–Zymed,SanFrancisco,CA,USA)使免疫反應(yīng)可視化。對所有切片的波形蛋白、上皮細胞膜抗原(EMA)、平滑肌肌動蛋白(SMA)、AE1/AE3、NFP和INI1使用常規(guī)免疫組織化學(xué)工序染色。所有抗體稀釋如同染色抗體的生產(chǎn)商所推薦那樣進行。LOX活性測定法：如先前所述(15843371)，使用Amplex紅熒光測定法(AAABioquest,15255)測量LOX酶活性。測定反應(yīng)混合物由50mM硼酸鈉(pH8.2)、1.2M脲、50_MAmplex紅、0.1個單位/ml辣根過氧化物酶和10mM1,5-二氨基戊烷(尸胺)底物組成。將蛋白質(zhì)樣品添加到存在或缺乏100μMBAPN的反應(yīng)混合物中，然后在37℃下孵育30分鐘。在590nm下使用光吸收酶標儀測量熒光產(chǎn)物。MTS-細胞活力測定法：平板接種5x103個細胞，一式三份并且使其在96孔板中生長過夜。第二天，更換培養(yǎng)基并補充不同濃度的BAPN并且進一步孵育細胞48小時。使用CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)根據(jù)生產(chǎn)商的說明測量細胞增殖。簡言之，在37℃下用MTS溶液孵育細胞3小時并且使用酶標儀測定492nm下的吸光度。進行三次獨立實驗。細胞遷移測定法：使細胞生長過夜，之后更換培養(yǎng)基并補充100μMBAPN。48小時后，用1ml塑料移液管尖端通過融合單層進行刮擦。然后在相同時間點(24和48小時)為經(jīng)處理的和對照細胞拍照。統(tǒng)計分析：除非另有說明，否則將結(jié)果表示為平均值±S.E.M。使用學(xué)生t檢驗評價ATRT細胞群之間在基因表達上的統(tǒng)計學(xué)差異。體內(nèi)實驗中的統(tǒng)計學(xué)差異使用ANOVE/卡方檢驗(Chi-squaretest)計算。對于所有統(tǒng)計分析而言，除非另有說明，否則將顯著性水平設(shè)為p<0.05。結(jié)果MRT異種移植模型的建立和細胞培養(yǎng)物表征：從男新生兒的左側(cè)頸部腫塊獲得人惡性橫紋肌樣腫瘤樣品。原發(fā)性腫瘤的H&E染色證明中等至較大多邊形腫瘤細胞具有圓形細胞核、細染色質(zhì)和較大的嗜酸性核仁。腫瘤細胞的形態(tài)特征，結(jié)合免疫組織化學(xué)性質(zhì)，確認了對惡性橫紋肌樣腫瘤的診斷。實際上，大多數(shù)腫瘤細胞未顯示出INI-1蛋白的表達。對原發(fā)性腫瘤細胞進行流式細胞術(shù)分析，證明兩個細胞群在尺寸上不同。對于體外表征，使細胞在兩種不同條件下生長：具有10％FBS的DMEM和補充了生長因子的無血清培養(yǎng)基。觀察到兩種形態(tài)不同的細胞類型：粘附性成纖維細胞樣細胞和松散附著于粘附細胞的原形細胞，與先前所述培養(yǎng)中的MRT細胞的形態(tài)一致。當(dāng)這些細胞在具有10％FBS的DMEM中培養(yǎng)時觀察到明顯的細胞生長。原發(fā)性腫瘤細胞培養(yǎng)物中的形態(tài)保持約8代。原發(fā)性腫瘤移植物通過向4只免疫缺陷小鼠皮下移植2-5mm腫瘤碎片而形成(圖6)。在允許進一步腫瘤繁殖的4/4只小鼠中觀察到腫瘤植入。ATRTXn在NOD/SCID小鼠中的連續(xù)繁殖通過組織樣品移植或利用1x106個固定數(shù)量的細胞進行單細胞懸液移植來進行(表2和圖6)。連續(xù)繁殖允許我們建立低(<P5)、中(P5-P10)和高代(P10-P15)MRTXn傳代，對其進行研究以進行MRTCSC表型表征和闡明與MRT引發(fā)能力相關(guān)的致病途徑(表2、下文和圖6)。表2NOD/SCID小鼠中人ATRTXn模型的產(chǎn)生和建立由連續(xù)注射1x106*個細胞和組織移植產(chǎn)生原發(fā)性人ATRTXn。從新生兒的ATRT獲得原發(fā)性腫瘤組織。MRT的長期繁殖與CSC頻率增加相關(guān)用1x106個固定細胞數(shù)量的細胞連續(xù)繁殖MRTXn與腫瘤植入時間更短和腫瘤生長加速有關(guān)聯(lián)(圖1A和表3)，表明腫瘤侵襲性隨著傳代而提升。表3.繁殖期間的ATRTXn頻率和特征表總結(jié)了從ATRTXn獲得并進一步繁殖的1x106個細胞形成繼發(fā)性腫瘤的頻率和特征。ATRTXn連續(xù)繁殖期間，注意到腫瘤植入時間更短和腫瘤生長加速。在低代和中代Xn之間的比較中，*p<0.01。其次發(fā)明人懷疑CSC能力是否隨MRT繁殖而在功能上加強。他們用源自低、中和高代Xn的MRT細胞進行有限稀釋異種移植實驗。這項分析對于高代Xn中的CSC頻率顯示出明顯積極的選擇(表4)。表4：表示繁殖期間的CSC頻率的有限稀釋異種移植總結(jié)已經(jīng)觀察到高代MRTXn富集更多數(shù)量的CSC，分析了伴隨CSC表型隨傳代的獲得的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)變化(圖1B-C)。H&E染色揭示Xn來源的腫瘤保持基本橫紋肌樣細胞形態(tài)。然而，在高代Xn中觀察到一些形態(tài)差異，包括獲得梭形細胞形態(tài)、大面積壞死、凋亡小體更少且有絲分裂更多(圖1B)。免疫組織化學(xué)(IHC)染色公開原發(fā)性腫瘤和Xn組織兩者強烈表達間葉細胞標志物波形蛋白(圖1C)。然而，與原發(fā)性腫瘤大不相同，高代Xn顯示包括上皮細胞膜抗原(EMA)、細胞角蛋白AE1/AE3和神經(jīng)絲蛋白(NFP)在內(nèi)的分化標志損失(圖1C)。為了驗證IHC結(jié)果，對原發(fā)性腫瘤、早期和晚期Xn進行qRT-PCR?；虮磉_分析證明隨著上皮分化標志物(E-鈣粘蛋白)的損失，波形蛋白保持(圖1D)。因此，CSC頻率增強與保持相似組織病理學(xué)橫紋肌樣特征并顯示出針對間葉細胞表型去分化的MRTXn相關(guān)。與腫瘤引發(fā)活性增強相關(guān)的全基因標記揭示了假定CSC生物標志物接下來發(fā)明人設(shè)法表征了連續(xù)MRTXn的全分子圖譜，其伴隨對CSC表型的選擇。為此，他們進行了微陣列基因表達分析，比較了幾種不同的樣品：1.原代MRT，2.早期MRTXn(P2)，3.中間MRTXn(P7)，4.晚期MRTXn(P16)，5.人胚胎干細胞(hESC)，6.胎腎(FK)，7.成人腎(AK)，8.胎腦(FB)，9.成人腦(AB)。全局表達分析顯示正如通過分級群聚所說明的那樣，繁殖的MRTXn細胞與hESC更緊密地群聚，而不與其來源的原發(fā)性腫瘤群聚(圖2A)。另外，Xn組織與人胎組織存在更大的相似性?？偟膩碚f，這些結(jié)果確認了腫瘤繁殖期間對干細胞表型的選擇。對原發(fā)性MRT和連續(xù)MRTXn(低、中和高代)更仔細的檢查鑒定了多種基因表達模式，包括在整個傳代過程中被上調(diào)和下調(diào)的兩大基因集群(圖2B)。上調(diào)基因組群包括伴隨所觀察到的CSC表型的獲得的分子，如信號素3C(SEMA3C)、賴氨酰氧化酶(LOX)、糖蛋白M6A(GPM6A)、肝細胞生長因子(HGF/SF)和醛脫氫酶1(ALDH1)(圖2C)。這種基因表達譜也可以證實隨著傳代的腫瘤生物性質(zhì)，正如揭示晚代為高度增殖性(例如KI-67、CDK1和AURKA)的基因熱圖所顯示的那樣(圖2D)。另外，功能分析證明細胞壞死、細胞死亡和細胞分化減少(圖2E)，兩者均支持由H&E和IHC染色獲得的結(jié)果，H&E和IHC染色證明與原發(fā)性腫瘤和低代Xn相比高代Xn中的細胞壞死減少、有絲分裂增加且分化標志物損失。因此，連續(xù)Xn繁殖模型產(chǎn)生了涉及連續(xù)腫瘤引發(fā)和進展及MRT中CSC表型的獲得的假定生物標志物分子。ALDH1作為MRTCSC生物標志物的功能驗證已經(jīng)觀察到目前公開的分子篩選單獨地指出ALDH1為MRT中獲得CSC表型的標志物，發(fā)明人進一步檢查了其表達和功能作用。重要的是，ALDH1已經(jīng)被認為CSC標志物，并且因此可以驗證所述方法。表達分析證明ALDH1比例隨著腫瘤繁殖而顯著增加(圖3A)。用于量化Xn進展的不同階段中ALDH1群體的比例的FACS分析揭示，相比于晚代(10代)中25％的細胞，在低代Xn細胞(4代)中，僅4％的細胞為ALDH1+(圖3B)。另外，ALDH1IHC染色證明ALDH1的表達隨著傳代而增加(圖3C)。此外，表達ALDH1高的細胞主要是大橫紋肌樣細胞(圖3D)。在基因表達水平上，qRT-PCR分析揭示了晚代中的高ALDH1表達，相比于原發(fā)性腫瘤高約40倍(圖3E)。然后發(fā)明人分選ALDH1+成分以便確定它們作為CSC是否合格。癌癥干細胞的定義屬性是它們在體外形成克隆物的功能性能力。菌落形成測定法顯示根據(jù)CSC表型，與ALDH1-MRT細胞相比，在ALDH1+中的克隆物數(shù)量明顯更高且菌落更大(圖4)。另外，通過其在移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后重新形成腫瘤的能力來定義CSC。為研究體內(nèi)ALDH1+細胞的致瘤性，使用有限稀釋分析(18)在NOD/SCID小鼠的側(cè)腹注射遞減量的經(jīng)FACS純化的ALDH1+和ALDH1-細胞。未分選的細胞作為對照注射(表2)。在低代(P3)中，與注射了ALDH1-細胞的小鼠都未形成腫瘤相比，注射了2000個或更少ALDH1+細胞的6只小鼠中有4只形成腫瘤(p<0.05)。在高代(P12)中，注射了1000個或更少ALDH1+細胞的小鼠全部形成繼發(fā)性腫瘤，而注射了ALDH1-細胞的11只小鼠中僅2只發(fā)展出腫瘤(p<0.001)，表明這個群體相對缺乏腫瘤引發(fā)細胞(表2)。重要的是，由ALDH1+細胞產(chǎn)生的腫瘤可進一步連續(xù)移植到二級受者中，與在該群體中存在腫瘤引發(fā)能力一致，證明了ALDH+細胞的體內(nèi)自我更新能力(圖4B)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)證實ALDH1是MRTCSC的標志物，驗證了我們以長期繁殖來定義的CSC表型與特定分子如ALDH1的關(guān)聯(lián)。為了在分子水平上更好地表征分選的ALDH+CSC并確定它們是否富集通過長期繁殖來預(yù)測的CSC生物標志物，對從MRTXn獲得的分選ALDH+和ALDH-細胞進行RNA測序?qū)嶒?圖4C)。有趣的是，發(fā)現(xiàn)相比于ALDH-細胞在ALDH+細胞中上調(diào)最多的基因是相比于原發(fā)性腫瘤在Xn晚代中明顯過表達的那些基因(例如ANXA1、GPM6A、HGF和LOX)(圖4C)。進行qRT-PCR分析，驗證相比于ALDH-細胞在ALDH+中的LOX高表達(圖4E)。這些結(jié)果強調(diào)了我們的Xn繁殖技術(shù)作為鑒定與腫瘤侵襲性和CSC頻率有關(guān)聯(lián)的分子和途徑的有效性。LOX在進行性MRTXn和分選的ALDH+CSC成分中的高表達引導(dǎo)我們檢查LOX是否可以用作治療靶標。LOX抑制劑作為MRTCSC治療劑的功能驗證LOX，一種細胞外基質(zhì)重構(gòu)酶，調(diào)節(jié)諸如染色質(zhì)壓縮(19)、基因轉(zhuǎn)錄(20,21)以及早期細胞分化和組織發(fā)育等事件，并因此與特征在于調(diào)節(jié)類似活性的INI-1損失的MRT有關(guān)。最近的研究已經(jīng)證實LOX在幾種惡性腫瘤，包括乳腺、結(jié)腸和胰腺腫瘤中過表達(23,24)并且與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)(25)。IHC染色分析LOX在原代MRT、早代(P2)、中代(P7)和晚代(P14)Xn中的表達，確認在整個傳代過程中表達廣泛遞增，在橫紋肌樣細胞中顯著表達(圖5A)。先前，證實BAPN，一種LOX抑制劑，對各種癌細胞具有積極作用(23)。因為LOX基因在Xn中在增殖和CSC表型選擇期間以及在分選的MRTCSC中上調(diào)，所以發(fā)明人設(shè)法檢查了LOX抑制對MRT細胞是否有影響。首先，使Xn細胞在不同濃度的BAPN中生長48小時。MTS分析，檢查細胞活力，證明在三次不同實驗中用100μMBAPN處理之后增殖顯著減少(數(shù)據(jù)未示出)。接下來，他們檢查了BAPN對WTXn細胞(在小鼠體內(nèi)連續(xù)繁殖的腎臟常見小兒實體瘤)的影響。結(jié)果證明對WT細胞增殖無影響，表明LOX抑制對MRT細胞的特異性作用(圖5B)。接下來發(fā)明人檢查了由于BAPN處理產(chǎn)生的MRT細胞形態(tài)并且證實處理誘導(dǎo)形態(tài)變化，包括核固縮和細胞吞噬(圖5C)。重要的是，遷移測定揭示與未處理的細胞相比，BAPN處理48小時顯著抑制MRT細胞的遷移能力(圖5D)。因為所有體外結(jié)果都是使用中代Xn(P10)獲得的，所以發(fā)明人著手確定BAPN對更類似于原發(fā)性腫瘤的細胞是否會具有類似作用。對P2細胞進行類似實驗并且揭示了相同結(jié)果(圖7A-C)。LOX活性測量驗證100μMBAPN實際上顯著抑制LOX活性(圖7D)。這些結(jié)果表明，靶向新型MRTCSC生物標志物可以消除腫瘤生長并且保證LOX為可能的MRT治療靶標。實施例1的參考文獻1.Pode-ShakkedN,MetsuyanimS,Rom-GrossE,MorY,FridmanE,GoldsteinI,etal.Developmentaltumourigenesis:NCAMasaputativemarkerforthemalignantrenalstem/progenitorcellpopulation.Journalofcellularandmolecularmedicine.2009Aug；13(8B):1792-808.2.DekelB,MetsuyanimS,Schmidt-OttKM,FridmanE,Jacob-HirschJ,SimonA,etal.Multipleimprintedandstemnessgenesprovidealinkbetweennormalandtumorprogenitorcellsofthedevelopinghumankidney.Cancerresearch.2006Jun15；66(12):6040-9.3.MetsuyanimS,Pode-ShakkedN,Schmidt-OttKM,KeshetG,RechaviG,BlumentalD,etal.Accumulationofmalignantrenalstemcellsisassociatedwithepigeneticchangesinnormalrenalprogenitorgenes.Stemcells(Dayton,Ohio).2008Jul；26(7):1808-17.4.Pode-ShakkedN,DekelB.Wilmstumor—arenalstemcellmalignancy？Pediatricnephrology(Berlin,Germany).2011Sep；26(9):1535-43.5.Pode-ShakkedN,ShukrunR,Mark-DanieliM,TsvetkovP,BaharS,Pri-ChenS,etal.TheisolationandcharacterizationofrenalcancerinitiatingcellsfromhumanWilms’tumourxenograftsunveilsnewtherapeutictargets.EMBOmolecularmedicine.2013Jan；5(1):18-37.6.ShukrunR,DekelB,Pode-ShakkedN,PleniceanuO,OmerD,VaxE,etal.Wilms’TumorBlastemalStemCellsDedifferentiatetoPropagatetheTumorBulk.StemCellReports.2014.7.ParhamDM,WeeksDA,BeckwithJB.Theclinicopathologicspectrumofputativeextrarenalrhabdoidtumors.Ananalysisof42casesstudiedwithimmunohistochemistryorelectronmicroscopy.TheAmericanjournalofsurgicalpathology.1994Oct；18(10):1010-29.8.WickMR,RitterJH,DehnerLP.Malignantrhabdoidtumors:aclinicopathologicreviewandconceptualdiscussion.Seminarsindiagnosticpathology.1995Aug；12(3):233-48.9.VersteegeI,SevenetN,LangeJ,Rousseau-MerckMF,AmbrosP,HandgretingerR,etal.TruncatingmutationsofhSNF5/INI1inaggressivepaediatriccancer.Nature.1998Jul9；394(6689):203-6.10.OlsonTA,BayarE,KosnikE,HamoudiAB,KlopfensteinKJ,PietersRS,etal.Successfultreatmentofdisseminatedcentralnervoussystemmalignantrhabdoidtumor.Journalofpediatrichematology/oncology.1995Feb；17(1):71-5.11.DouglassEC,ValentineM,RoweST,ParhamDM,WilimasJA,SandersJM,etal.Malignantrhabdoidtumor:ahighlymalignantchildhoodtumorwithminimalkaryotypicchanges.Genes,chromosomes&cancer.1990Sep；2(3):210-6.12.RorkeLB,PackerRJ,BiegelJA.Centralnervoussystematypicalteratoid/rhabdoidtumorsofinfancyandchildhood:definitionofanentity.Journalofneurosurgery.1996Jul；85(1):56-65.13.BiegelJA,TanL,ZhangF,WainwrightL,RussoP,RorkeLB.AlterationsofthehSNF5/INI1geneincentralnervoussystematypicalteratoid/rhabdoidtumorsandrenalandextrarenalrhabdoidtumors.ClinCancerRes.2002Nov；8(11):3461-7.14.BiegelJA,ZhouJY,RorkeLB,StenstromC,WainwrightLM,FogelgrenB.Germ-lineandacquiredmutationsofINI1inatypicalteratoidandrhabdoidtumors.Cancerresearch.1999Jan1；59(1):74-9.15.EuskirchenG,AuerbachRK,SnyderM.SWI/SNFchromatin-remodelingfactors:multiscaleanalysesanddiversefunctions.TheJournalofbiologicalchemistry.2012Sep7；287(37):30897-905.16.TomlinsonGE,BreslowNE,DomeJ,GuthrieKA,NorkoolP,LiS,etal.RhabdoidtumorofthekidneyintheNationalWilms’TumorStudy:ageatdiagnosisasaprognosticfactor.JClinOncol.2005Oct20；23(30):7641-5.17.GinestierC,HurMH,Charafe-JauffretE,MonvilleF,DutcherJ,BrownM,etal.ALDH1isamarkerofnormalandmalignanthumanmammarystemcellsandapredictorofpoorclinicaloutcome.Cellstemcell.2007Nov；1(5):555-67.18.HuY,SmythGK.ELDA:extremelimitingdilutionanalysisforcomparingdepletedandenrichedpopulationsinstemcellandotherassays.Journalofimmunologicalmethods.2009Aug15；347(1-2):70-8.19.MelloML,ContenteS,VidalBC,PlandingW,SchenckU.Modulationofrastransformationaffectingchromatinsupraorganizationasassessedbyimageanalysis.Experimentalcellresearch.1995Oct；220(2):374-82.20.DiDonatoA,LacalJC,DiDucaM,GiampuzziM,GhiggeriG,GusmanoR.Micro-injectionofrecombinantlysyloxidaseblocksoncogenicp21-Ha-RasandprogesteroneeffectsonXenopuslaevisoocytematuration.FEBSletters.1997Dec8；419(1):63-8.21.GiampuzziM,BottiG,DiDucaM,ArataL,GhiggeriG,GusmanoR,etal.LysyloxidaseactivatesthetranscriptionactivityofhumancollageneIIIpromoter.PossibleinvolvementofKuantigen.TheJournalofbiologicalchemistry.2000Nov17；275(46):36341-9.22.MakiJM,RasanenJ,TikkanenH,SormunenR,MakikallioK,KivirikkoKI,etal.InactivationofthelysyloxidasegeneLoxleadstoaorticaneurysms,cardiovasculardysfunction,andperinataldeathinmice.Circulation.2002Nov5；106(19):2503-9.23.BondarevaA,DowneyCM,AyresF,LiuW,BoydSK,HallgrimssonB,etal.Thelysyloxidaseinhibitor,beta-aminopropionitrile,diminishesthemetastaticcolonizationpotentialofcirculatingbreastcancercells.PloSone.2009；4(5):e5620.24.MelstromLG,BentremDJ,SalabatMR,KennedyTJ,DingXZ,StrouchM,etal.Overexpressionof5-lipoxygenaseincolonpolypsandcancerandtheeffectof5-LOXinhibitorsinvitroandinamurinemodel.ClinCancerRes.2008Oct15；14(20):6525-30.25.BarkerHE,CoxTR,ErlerJT.TherationalefortargetingtheLOXfamilyincancer.Naturereviews.2012Aug；12(8):540-52.26.FindlayVJ,WangC,WatsonDK,CampER.Epithelial-to-mesenchymaltransitionandthecancerstemcellphenotype:insightsfromcancerbiologywiththerapeuticimplicationsforcolorectalcancer.Cancergenetherapy.2014May2.27.MarjanovicND,WeinbergRA,ChafferCL.Poisedwithpurpose:cellplasticityenhancestumorigenicity.Cellcycle(Georgetown,Tex.2013Sep1；12(17):2713-4.28.LanderAD.The‘stemcell’concept:isitholdingusback？Journalofbiology.2009；8(8):70.29.BertucciF,Bouvier-LabitC,FinettiP,MetellusP,AdelaideJ,MokhtariK,etal.Geneexpressionprofilingofsolitaryfibroustumors.PloSone.2013；8(5):e64497.30.MaLJ,LiYG,HuangL,HanM,MaBJ,SunBJ,etal.[ExpressionofLOXandMMP-2ingastriccancertissueandtheeffectsofLOXandMMP-2ontumorinvasionandmetastasis].Zhonghuazhongliuzazhi[Chinesejournalofoncology].2011Jan；33(1):37-41.31.ThomasC,KarnoubAE.Lysyloxidaseatthecrossroadsofmesenchymalstemcellsandepithelial-mesenchymaltransition.Oncotarget.2013Mar；4(3):376-7.32.KordesU,GeskS,FruhwaldMC,GrafN,LeuschnerI,HasselblattM,etal.Clinicalandmolecularfeaturesinpatientswithatypicalteratoidrhabdoidtumorormalignantrhabdoidtumor.Genes,chromosomes&cancer.2003Feb；49(2):176-81.實施例2人威爾姆氏腫瘤和尤文氏肉瘤異種移植物的長期繁殖材料和方法體內(nèi)異種移植物形成和植入時間計算：動物實驗根據(jù)舍巴醫(yī)療中心動物實驗指南進行。如上文所述，進行對5-8周齡、雌性、非肥胖性糖尿病免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的初始腫瘤異種移植。簡言之，將原發(fā)性腫瘤組織切成2-5mm碎片并且皮下植入小鼠背部。將小鼠保持在無病原體的環(huán)境中并且每周監(jiān)測腫瘤生長。每周通過觸診檢測繼發(fā)性腫瘤。當(dāng)腫瘤達到1.5cm直徑的尺寸時收獲腫瘤。記錄每個植入Xn的植入時間、切除時間、重量和體積。立即將Xn組織切成小碎片并且處理用于向NOD/SCID小鼠側(cè)腹的皮下組織移植及如下所述制備單細胞懸液用于后續(xù)Xn繁殖。通過在含有抗生素(青霉素和鏈霉素)的伊斯考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM)中切碎樣品，接著在37℃下用膠原酶IV處理2小時獲得單細胞懸液。使用為膠原酶溶液兩倍體積的IMDM研磨經(jīng)酶處理的組織并且過濾懸液(100μm細胞濾網(wǎng))并用含抗生素的IMDM洗滌兩次。用ACKRBS裂解緩沖液去除紅細胞。用兩種方法形成Xn連續(xù)傳代：1.連續(xù)注射大約1x106個來自新取回的Xn的解離細胞；在100μl1:1無血清培養(yǎng)基/Matrigel(BDBiosciences,SanJose,CA)中注射細胞。2.將Xn組織切成2-5mm碎片并且皮下植入小鼠背部。結(jié)果尤文氏肉瘤(圖8A)和威爾姆氏腫瘤(圖8B)Xn的連續(xù)繁殖與腫瘤植入時間更短有關(guān)聯(lián)，表明腫瘤行為朝更具侵襲性的表型變化。實施例3人胸膜肺母細胞瘤(PPB)異種移植物的長期繁殖材料和方法體內(nèi)異種移植物形成和植入時間計算：動物實驗根據(jù)舍巴醫(yī)療中心動物實驗指南進行。如上文所述，進行對5-8周齡、雌性、非肥胖性糖尿病免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的初始腫瘤異種移植。簡言之，將原發(fā)性腫瘤組織切成2-5mm碎片并且皮下植入小鼠背部。將小鼠保持在無病原體的環(huán)境中并且每周監(jiān)測腫瘤生長。每周通過觸診檢測繼發(fā)性腫瘤。當(dāng)腫瘤達到1.5cm直徑的尺寸時收獲腫瘤。記錄每個植入Xn的植入時間、切除時間、重量和體積。立即將Xn組織切成小碎片并且處理用于向NOD/SCID小鼠側(cè)腹的皮下組織移植及如下所述制備單細胞懸液用于后續(xù)Xn繁殖。通過在含有抗生素(青霉素和鏈霉素)的伊斯考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM)中切碎樣品，接著在37℃下用膠原酶IV處理2小時獲得單細胞懸液。使用為膠原酶溶液兩倍體積的IMDM研磨經(jīng)酶處理的組織并且過濾懸液(100μm細胞濾網(wǎng))并用含抗生素的IMDM洗滌兩次。用ACKRBS裂解緩沖液去除紅細胞。用兩種方法形成Xn連續(xù)傳代：1.連續(xù)注射大約1x106個來自新取回的Xn的解離細胞；在100μl1:1無血清培養(yǎng)基/Matrigel(BDBiosciences,SanJose,CA)中注射細胞。2.將Xn組織切成2-5mm碎片并且皮下植入小鼠背部。腫瘤繁殖細胞相對頻率的估計：為了評價和比較來自低代和高代的Xn細胞的致瘤活性，向NOD/SCID小鼠的側(cè)腹皮下注射懸浮在100μlPBS和100μlMatrigel中的細胞連續(xù)稀釋液(1×106–50個細胞)。使用ELDA在線軟件(bioinfdotwehidotedudotau/software/elda/)在線計算癌癥繁殖細胞的相對頻率的估計值。芯片陣列：所有實驗均使用AffymetrixHUGENE1.0寡核苷酸陣列進行。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，使用來自每份樣品的總RNA制備生物素化靶cDNA。按照生產(chǎn)商的推薦，使用Affymetrix基因芯片儀系統(tǒng)處理由每份樣品產(chǎn)生的靶cDNA?？稍诰€找到質(zhì)量控制措施的詳情。過濾明顯變化的基因，變化至少兩倍(p值：0.05)。PPBXn的免疫組織化學(xué)染色：從原發(fā)性PPB和PPBXn切下4-μm厚的切片用于免疫組織化學(xué)分析。如上文所述進行免疫染色。簡言之，處理切片以免抗原氧化。在免疫染色之前，在97℃下用10mM檸檬酸鹽緩沖液，PH6.0處理切片10分鐘以便抗原恢復(fù)，接著用3％H2O2處理10分鐘。隨后使用標記鏈霉親和素-生物素(LAB-SA)方法，使用Histostainplus試劑盒(Zymed,SanFrancisco,CA,USA)為載玻片染色。通過基于HRP的色原/底物體系(液體DAB底物試劑盒–Zymed,SanFrancisco,CA,USA)使免疫反應(yīng)可視化。按1:1200稀釋使用抗人NCAM抗體(BDBiosciences,#611195)。通過基于HRP的色原/底物體系(液體DAB底物試劑盒–Zymed,SanFrancisco,CA,USA)使免疫反應(yīng)可視化。定量實時逆轉(zhuǎn)錄PCR分析-基因表達分析：進行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)以測定NCAM表達的變化倍數(shù)。使用RNeasyMicro試劑盒(QiagenGmbH,Hilden,Germany)根據(jù)生產(chǎn)商的說明從細胞分離總RNA。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AppliedBiosystems,CaliforniaUSA)在總RNA上合成cDNA。使用ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)(Perkin-Elmer/AppliedBiosystems,California,USA)在TaqMan基因表達預(yù)混液(AppliedBiosystems,California,USA)的存在下進行實時PCR。使用基因特異性TaqMan基因表達測定預(yù)制試劑盒(AppliedBiosystems,California,USA)進行PCR擴增。每個分析反應(yīng)進行三次。在整個實驗分析中使用HPRT1或GAPDH作為內(nèi)源對照。使用SDSRQManager1.2軟件分析PCR結(jié)果。使用非配對雙尾T檢驗進行統(tǒng)計分析。在P<0.05時視為統(tǒng)計顯著性。結(jié)果PPBXn連續(xù)繁殖與腫瘤植入時間更短和腫瘤生長加速有關(guān)聯(lián)，表明腫瘤侵襲性隨著傳代而提升。如下文表6所示，在早代(1-4代)和晚代(7-12代)Xn之間的比較中，腫瘤植入時間從58天從下降到33天(p<0.02)。表6用源自早代和晚代Xn的PPB細胞進行有限稀釋異種移植實驗。這項分析對于高代Xn中的CSC頻率顯示出明顯積極的選擇。如下文表7所示，在早代和晚代CSC之間的比較中，CSC頻率從1/1581升高到1/304細胞(p＝0.009)。表7圖9中提供了基因熱圖，比較了不同PPB樣品，成人肺(AL)和胎肺(FL)之間，幾種增殖標志物(例如KI67、E2F2和CDK1)、自我更新多梳基因(例如BMI1、TOP2A和EZH2)和轉(zhuǎn)移標記基因(例如SPARC、CXCR4和LTBP1)的表達模式，揭示高代為高度增殖性并且呈現(xiàn)自我更新基因上調(diào)，具有侵入基因標記，預(yù)測了轉(zhuǎn)移性行為。如圖10A所說明的，對幾種Xn傳代(P4、P8、P12和P17)的NCAM1的免疫組織化學(xué)分析(IHC)揭示隨著Xn連續(xù)繁殖而表達增加。qRT-PCR分析揭示相比于成人肺部對照在原發(fā)性腫瘤中NCAM1高度表達(右)并且相比于成人肺部在胎肺中NCAM1高度表達(左)，強調(diào)了NCAM1在癌發(fā)生和進展期間起到重要作用的事實(圖10B)。如圖11A-B所說明的，對幾種Xn傳代(P4、P8、P12和P17)的CD44的IHC分析揭示隨著Xn連續(xù)繁殖而表達增加。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其具體實施方案進行了描述，但是顯然許多替代、修改和變型對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將顯而易見。因此，其意圖在于包括屬于所附權(quán)利要求的精神和寬范圍內(nèi)的所有此類替代、修改和變型。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請在本文中通過引用整體并入本說明書中，其程度如同特別地且單獨地指出將每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用并入本文一樣。另外，本申請中任何參考文獻的引用或標識不應(yīng)解釋為承認此類參考文獻可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。至于所使用的章節(jié)標題，不應(yīng)將其解釋為必要性限制。當(dāng)前第1頁1 2 3