本發(fā)明涉及使用激光燒蝕-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法(LA–ICP–MS)或質(zhì)譜細胞術(shù)(mass cytometry)的組織樣品的成像。

背景技術(shù)：

分子靶的單細胞測量和多重定量檢測可以對單獨細胞的狀態(tài)和表現(xiàn)提供洞察。已用于單細胞分析的技術(shù)包括與特異的標記技術(shù)(例如使用免疫細胞化學)、單細胞成像質(zhì)譜法、表面增強的拉曼散射光譜和LA–ICP–MS結(jié)合的顯微術(shù)。

這些技術(shù)中的一些可以容易地延伸到組織的原位成像(例如使用免疫組織化學)，但其他的不能。例如，方法諸如免疫熒光顯微術(shù)(IFM)可用于低至納米分辨率的成像，但實踐中局限于同時測量七個或更少的靶。與之相比，LA–ICP–MS提供單細胞中的抗原表達的高度多重的定量分析，但其目前缺少對于組織樣品內(nèi)的單細胞的成像必需的分辨率。

本發(fā)明的目標是提供用于組織樣品成像的另外的并且改進的技術(shù)，并特別地使LA-ICP-MS適于用作單細胞成像技術(shù)。

詳述

ICP–MS已被用于單細胞分析，但僅用于懸浮液中的細胞[1]。發(fā)明人現(xiàn)已使激光燒蝕(LA)適合于ICP–MS，以使得該技術(shù)適用于組織樣品中的單細胞成像。盡管先前已經(jīng)報道了經(jīng)由LA–ICP–MS的組織成像，公開的過程尚未實現(xiàn)高的空間分辨率。例如，LA-ICP-MS已被用于獲得腦切片的[2]和癌癥組織的[3、4]圖像，但未實現(xiàn)單細胞或亞細胞分辨率。在所有的情況中，分辨率被燒蝕激光的光斑尺寸和/或被在連續(xù)燒蝕中釋放的材料的分析之間的重疊/混合限制。例如，40μm的光斑尺寸[2]不能以對組織樣品中單細胞成像足夠高的分辨率燒蝕材料。類似地，如果燒蝕的材料不能在少于100ms內(nèi)運輸?shù)絀CP-MS，那么以10Hz的頻率燒蝕將導致重疊信號；例如，參考文獻3中使用的以該燒蝕頻率的燒蝕單元具有大大超過1秒的沖洗時間(作者未提示)。

現(xiàn)在發(fā)明人提供了LA–ICP–MS系統(tǒng)，其克服了這些缺點并且能夠?qū)崿F(xiàn)亞細胞分辨率，因此第一次使適用于組織的單細胞成像的LA–ICP–MS技術(shù)可用。因此，本發(fā)明提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個不同的標記原子標記所述組織樣品中的多個不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經(jīng)受具有亞細胞分辨率的激光燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此檢測所述煙流中的標記原子允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。本發(fā)明的一個一般的優(yōu)勢是其與已在免疫組織化學(IHC)中使用的技術(shù)和方案兼容，但通過LA-ICP-MS檢測的標記物的使用現(xiàn)在允許更多的靶定位在樣品中。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個不同的標記原子標記所述組織樣品中的多個不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受使用飛行時間質(zhì)量分析器的電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標記原子的檢測允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用不同的標記原子標記所述組織樣品中的至少四種不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標記原子的檢測允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個不同的標記原子標記所述組織樣品中的多個不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)劃分所述樣品中的單獨的細胞；(iii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個煙流；(iii)和使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標記原子的檢測允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用標記原子標記所述組織樣品中的一個或更多個靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使用4μm或更少的激光光斑尺寸使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標記原子的檢測允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)提供標記的組織樣品，其中多個不同的靶分子已用多個不同的標記原子標記；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經(jīng)受具有亞細胞分辨率的激光燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標記原子的檢測允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了用四種或更多種(例如5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或更多)不同的過渡金屬原子標記組織樣品的方法。這些原子與特定的細胞靶相關(guān)，因此允許通過LA-ICP-MS的下游檢測。然后，來自LA-ICP-MS的數(shù)據(jù)可被用于創(chuàng)建樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了使組織樣品成像的方法，其中所述組織樣品的多個細胞經(jīng)受為亞細胞分辨率的質(zhì)譜細胞術(shù)。

本發(fā)明還提供了LA-ICP-MS的方法，其中單個標記的細胞的基本所有的內(nèi)含物被用單一激光射出燒蝕，并且然后經(jīng)受ICP-MS。因此，完整細胞的基本所有內(nèi)含物可被質(zhì)譜細胞術(shù)分析。燒蝕提供含有基本所有的細胞的內(nèi)含物的煙流，并且然后該煙流可以被引入到ICP并且經(jīng)受MS，因此檢測標記的材料并且允許在單個分析中對完整細胞的多重分析。

LA-ICP-MS和質(zhì)譜細胞術(shù)

本發(fā)明在組織樣品成像方法中使用耦合到電感耦合等離子體質(zhì)譜法的激光燒蝕(LA-ICP-MS)。用不同的標記原子標記樣品中的不同的靶分子，并且然后LA-ICP-MS跨越標記的組織樣品的多個細胞使用。通過將所檢測的信號與引起那些信號的激光燒蝕的已知位置聯(lián)系起來，方法允許將所標記的靶分子定位到樣品上的特定位置，并因此構(gòu)造樣品的圖像。

LA-ICP-MS涉及使組織樣品經(jīng)受激光脈沖，所述激光脈沖從樣品生成燒蝕材料的煙流，并且這些煙流被作為氣霧劑傳送到ICP-MS儀器以用于分析。樣品中的標記原子可由MS區(qū)分，并且因此它們的檢測揭示煙流中多個靶的存在或缺乏。

以該方式生成的信號的空間分辨率取決于兩種主要因素：(i)當信號在被燒蝕的總面積上積分時，激光的光斑尺寸；以及(ii)相對于以其正在生成煙流的速度，以其可分析煙流以便避免來自如以上提到的連續(xù)煙流的信號的重疊的速度。

因此，為了分析單獨的細胞，本發(fā)明使用不大于這些細胞的激光光斑尺寸，并且更具體地，使用可燒蝕材料的具有亞細胞分辨率的激光光斑尺寸。該尺寸將取決于樣品中的特定細胞，但通常激光光斑將具有小于4μm的直徑(例如，在范圍0.2--4μm、0.25-3μm或0.4-2μm之內(nèi))。因此，激光光斑可具有大約3μm、2μm、1μm或0.5μm的直徑。在優(yōu)選的實施方案中，激光光斑直徑在0.5--1.5μm的范圍內(nèi)，或為大約1μm。可使用縮小的較寬激光束和近場光學器件來實現(xiàn)小的光斑尺寸。1μm的激光光斑直徑對應(yīng)于1μm的激光聚焦點，但由于將激光束傳送到樣品表面上的物鏡的數(shù)值孔徑，激光聚焦點可改變±20％。

為了組織樣品的快速分析，需要高頻率(例如，10Hz或更大(即，每秒10次燒蝕，每秒產(chǎn)生10次煙流))的燒蝕。在優(yōu)選實施方案中，燒蝕的頻率在范圍10-200Hz內(nèi)、在范圍15-100Hz內(nèi)或者在范圍20-50Hz內(nèi)。至少20Hz的燒蝕頻率允許在合理的時間中實現(xiàn)典型組織樣品的成像。如以上所指出的，在這些頻率下，儀器必須能夠足夠快速地分析燒蝕的材料，以便避免連續(xù)燒蝕之間的大量信號重疊。優(yōu)選地是，源自連續(xù)煙流的信號之間的重疊在強度上<10％(更優(yōu)選地<5％，并且理想地<1％)。煙流的分析所需的時間將取決于燒蝕單元的沖洗時間、煙流氣霧劑到達和通過ICP的渡越時間、以及分析電離的材料所花費的時間。

因此，具有短的沖洗時間(例如100ms或更少)的燒蝕單元與本發(fā)明一起使用是有利的。具有長沖洗時間的單元將限制可以生成圖像的速度，或?qū)е聛碜赃B續(xù)樣品斑點的信號之間的重疊(例如，參考文獻5，其具有超過10秒的信號持續(xù)時間)。因此，氣霧劑沖洗時間是對于實現(xiàn)高分辨率而不增加總掃描時間的關(guān)鍵限制因素。具有<100ms的沖洗時間的燒蝕單元在本領(lǐng)域是已知的。例如，參考文獻6公開了具有低于100ms的沖洗時間的燒蝕單元。在參考文獻7中公開了特別地適合的燒蝕單元(還參見參考文獻8)，其具有30ms或更少的沖洗時間，因此允許高燒蝕頻率(例如在20-40Hz之間)并且因此快速分析。本文的實例論證，由20Hz激光燒蝕射出生成的煙流的信號可被該燒蝕單元完全分離，因此使短時間中大面積成像能夠?qū)崿F(xiàn)。因此使用本發(fā)明的方法，實現(xiàn)最終的圖像中每空間分辨的像素的時間小于100ms是可能的。

通過將燒蝕單元定位在ICP附近以及通過確保足夠的氣體流用于以適當?shù)乃俣葘忪F劑直接運輸?shù)絀CP來簡單地控制煙流氣霧劑到達和通過ICP的渡越時間。使用如參考文獻7中描述的氬氣和氦氣的運輸提供良好的結(jié)果。

分析電離的材料所花費的時間將取決于用于離子的檢測的質(zhì)量分析器的類型。例如，使用法拉第杯的儀器通常對于分析快速信號來說太慢。總的來說，期望的成像速度(并因此燒蝕頻率)、分辨率(并因此激光光斑尺寸和燒蝕單元)以及多路復用的程度將指示應(yīng)使用的質(zhì)量分析器的一種類型或多種類型(或相反地，質(zhì)量分析器的選擇將決定可實現(xiàn)的速度、分辨率和多路復用)。

例如使用點離子檢測器，每次檢測在僅一個質(zhì)荷比(m/Q，在MS中通常被稱為m/z)的離子的質(zhì)譜儀儀器將給出使用多個標記物的單個細胞成像中的不良結(jié)果。第一，在質(zhì)荷比之間切換所花費的時間限制以其可確定多個信號的速度，并且第二，如果離子處于低豐度，那么當儀器聚焦于其他質(zhì)荷比時，信號可被遺漏。因此，盡管在參考文獻2和3中使用的儀器(Agilent 4500)是靈敏的，其基于四極的檢測器不很好地適用于多個標記物成像，因為通過設(shè)計，不同質(zhì)荷比的離子順序地通過并且所以對于多個標記物的數(shù)據(jù)獲得是慢的。類似的，在參考文獻4和7中使用的儀器(Thermo Fisher ElementXR and Element2)一次僅分析一個m/Q，并且當測量在超過靜電場跳躍的范圍的范圍內(nèi)的多個m/Q值時，具有關(guān)于磁體跳躍(magnet jump)的大的建立時間。

因此，優(yōu)選地使用該技術(shù)，其提供具有不同m/Q值的離子的基本同時檢測。例如，可能使用陣列檢測器(例如，參見參考文獻9的29章)而不是使用點離子檢測器?？墒褂枚嗍占魃刃螆鯥CP-MS儀器(例如，Thermo ScientificNeptune Plus、Nu Plasma II和Nu Plasma 1700系統(tǒng))，并且特別是具有Mattauch-Herzog幾何結(jié)構(gòu)的那些儀器(例如，SPECTRO MS，其可使用半導體直接電荷檢測器在單個測量中同時記錄從鋰到鈾的所有元素)。這些儀器可基本同時測量多個m/Q信號?？赏ㄟ^在檢測器中包括電子倍增器來增加它們的靈敏度。然而，陣列扇形儀器不是理想的，因為盡管它們對檢測正在增大的信號有用，但是當信號水平正在減小時，它們不太有用，并且因此它們不很好地適用于其中標記物以高度可變的濃度存在的情況中。

用于與本發(fā)明一起使用的最優(yōu)選的MS方法基于飛行時間(TOF)檢測，其可準同時地在單個樣品中記錄多個質(zhì)量。理論上，由于它們的空間電荷特征，TOF技術(shù)并不理想地適用于ICP離子源，但發(fā)明人已經(jīng)示出TOF儀器可足夠快速地和足夠靈敏地分析ICP離子氣霧劑，以允許可行的單細胞成像。然而，TOF質(zhì)量分析器對于原子分析來說通常是不受歡迎的，這是因為用于處理TOF加速器和飛行管中的空間電荷效應(yīng)所需的折衷，本發(fā)明的組織成像方法通過檢測僅標記的原子可為有效的，并且因此可移除其他原子(例如，具有低于100的原子質(zhì)量的那些原子)。這導致富集于(例如)100-250道爾頓區(qū)域中的質(zhì)量的不那么密集的離子束，其可被更有效地操縱和聚集，從而促進TOF檢測并利用TOF的高光譜掃描率。因此，可通過使TOF檢測與選擇樣品中不常見的標記原子結(jié)合以及例如通過使用較高質(zhì)量過渡元素理想地使質(zhì)量高于未標記樣品中所看到的質(zhì)量來實現(xiàn)快速成像。使用標記物質(zhì)量的較窄窗口因此意味著TOF檢測將被用于有效的成像。

合適的TOF儀器可獲得自Tofwerk、GBC科學儀器(例如，Optimass9500ICP-TOFMS)和加拿大富魯達(例如，CyTOF^TM和CyTOF^TM2儀器)。這些CyTOF^TM儀器具有比Tofwerk和GBC儀器更大的靈敏度，并且由于它們可快速地和靈敏地檢測稀土金屬的質(zhì)量范圍中的離子(特別在100-200的m/Q范圍中)[10]，因此已知被用于質(zhì)譜細胞術(shù)。因此這些為用于本發(fā)明的優(yōu)選儀器，并且它們可用于通過本領(lǐng)域中已知的儀器設(shè)置進行成像，例如參考文獻11&12。它們的質(zhì)量分析器可以以高頻率激光燒蝕的時間標度上的高質(zhì)譜獲取頻率準同時地檢測大量的標志物[4]。它們可測量標記原子的豐度，其中每個單元的檢測極限約為100，從而允許組織樣品的圖像的靈敏構(gòu)造。由于這些特征，質(zhì)譜細胞術(shù)可現(xiàn)在用于滿足以亞細胞分辨率的組織成像的靈敏度和多路復用需要。先前，質(zhì)譜細胞術(shù)僅被用于分析懸浮液中的細胞，并且關(guān)于組織或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細胞-細胞相互作用的信息已經(jīng)因此丟失。通過使質(zhì)譜細胞術(shù)儀器與高分辨率激光燒蝕系統(tǒng)和快速渡越低分散燒蝕腔室結(jié)合，可能允許通過實際時間標度上的高多路復用來構(gòu)造組織樣品的圖像。可在參考文獻1和13中找到關(guān)于質(zhì)譜細胞術(shù)的進一步細節(jié)。

用于樣品的燒蝕的激光器的波長和功率的選擇可遵循通過ICP-MS的細胞分析的正常使用。激光必須具有足夠的能量密度(fluence)，以導致燒蝕到達所需的深度，而基本上不燒蝕支撐樣品保持器。以20Hz的在2-5J/cm²之間的激光能量密度(例如，從3-4J/cm²或大約3.5J/cm²)通常為合適的。理想地，單個激光脈沖將足以燒蝕細胞材料以用于分析，使得激光脈沖頻率匹配通過其生成燒蝕煙流的頻率。激光器將通常為準分子激光器或復合受激態(tài)激光器?？墒褂梅瘹寮す馄?λ＝193nm)獲得合適的結(jié)果。使用25μm的孔徑，通過25倍的縮小可將該激光成像到組織樣品上，以便產(chǎn)生具有1μm直徑的光斑尺寸。這些激光器的10-15ns的脈沖持續(xù)時間可實現(xiàn)充分的燒蝕。還可使用飛秒激光器(即，脈沖持續(xù)時間<1ps)，并且由于傳送到樣品中的熱量減少，所述飛秒激光器將是有益的，但它們非常昂貴且可在沒有它們的情況下實現(xiàn)良好的成像結(jié)果。

總的來說，結(jié)合MS檢測器的響應(yīng)特征來選擇激光脈沖頻率和強度，以便允許區(qū)分單獨的激光燒蝕煙流。結(jié)合使用小的激光光斑以及具有短沖洗時間的燒蝕單元，快速和高分辨率成像現(xiàn)在是可行的。

構(gòu)造圖像

LA-ICP-MS可為煙流中的多個標記原子提供信號。煙流中的標記的檢測揭示其同源靶在燒蝕位置處的存在。通過在樣品的表面上的已知空間位置處生成一系列煙流，MS信號揭示樣品上標記的位置，并且因此信號可被用于構(gòu)造樣品的成像。通過用可區(qū)分的標記物來標記多個靶，可能使標記原子的位置與同源靶的位置相關(guān)聯(lián)，所以本發(fā)明可以構(gòu)建復雜圖像，從而達到遠超過使用現(xiàn)在技術(shù)可實現(xiàn)的那些的多路復用水平。發(fā)明人已經(jīng)示出通過本發(fā)明的方法所生成的圖像可重現(xiàn)染色模式以及如通過IFM確定的表達給定標志物的細胞的比例，從而證實本發(fā)明適合用于成像。

理想地，將通過在組織樣品上執(zhí)行激光的光柵掃描來構(gòu)造圖像。光柵掃描中連續(xù)燒蝕的間距(步長)以及光柵掃描中相鄰線之間的間距理想地與所使用的激光光斑尺寸相同(例如，對于1μm激光光斑，間距為1μm)，以便實現(xiàn)感興趣的區(qū)域的完整覆蓋。然而，在一些實施方案中，方法可使用小于激光光斑尺寸的步長(例如，至少2倍、4倍或5倍更小)，因為這可導致更小的燒蝕面積并因此提高成像分辨率。為了實現(xiàn)掃描，可能移動激光器，但通常移動燒蝕單元(或單元的內(nèi)含物)是更方便的。移動速度將取決于燒蝕頻率和光柵間距，例如，在1μm光柵間距和20Hz燒蝕的情況下，燒蝕單元將具有20μm/s的平移速度?？蓪崿F(xiàn)1μm或更小的步長的支撐平臺是可用的(例如，具有500nm或200nm步長(或甚至更小))。

通?；跓g表面層的內(nèi)含物，本發(fā)明的方法用于創(chuàng)建樣品的二維(2D)圖像。可通過組合來自在z軸中相鄰的單個樣品的切片的大量的2D圖像的堆疊(在x,y平面中)來制備組織的3D圖像。然而，作為以該方式組合2D圖像的可選方案，本發(fā)明方法還可用于直接3D成像。這可以以多種方式來實現(xiàn)。例如，如果燒蝕導致具有基本恒定深度的氣化，然后在單一x,y點的重復的燒蝕揭示z軸中逐漸地更深的信息。如果燒蝕不具有基本上恒定的深度，那么可測量燒蝕材料的體積(例如，相對于已知體積標準)，并且該體積可被容易地轉(zhuǎn)化為z軸深度。在執(zhí)行3D成像的情況下，可能執(zhí)行多個z軸燒蝕，同時維持x,y位置(“鉆孔”)，或者逐層燒蝕樣品(即，在移動到更深的z軸層之前執(zhí)行x,y區(qū)域的燒蝕)。逐層燒蝕為優(yōu)選的。3D成像的準確性由諸如燒蝕材料的再沉積、維持恒定燒蝕深度的能力以及標記物刺入樣品中的能力的因素限制，但仍可在這些限制的范圍內(nèi)實現(xiàn)有用的結(jié)果。

將信號組合為圖像將使用計算機，并且可使用已知的技術(shù)和軟件包來實現(xiàn)。例如，參考文獻3使用來自Kylebank軟件的GRAPHIS包，但還可使用諸如TERAPLOT的其他包。使用來自諸如MALDI-MSI的技術(shù)的MS數(shù)據(jù)的成像在本領(lǐng)域中是已知的，例如，參考文獻i公開了用于在Matlab平臺上查看和分析MS成像文件的“MSiReader”界面，并且參考文獻14公開了兩種軟件儀器(例如，“Datacube Explorer”程序)，其用于全空間和光譜分辨率中2D MSI數(shù)據(jù)集和3D MSI數(shù)據(jù)集兩者的快速數(shù)據(jù)探索和可視化。

可以進一步分析(例如以分析IHC結(jié)果的相同的方式)使用本發(fā)明的方法獲得的圖像。例如，圖像可用于描繪樣品內(nèi)的細胞亞群體，并且可提供對臨床診斷有用的信息。類似地，SPADE分析可用于從本發(fā)明方法提供的高維細胞術(shù)數(shù)據(jù)提取細胞層次結(jié)構(gòu)[16]。

組織樣品的標記

本發(fā)明提供了已經(jīng)用多個不同的標記原子標記的樣品的圖像，其中在激光燒蝕的煙流中通過ICP-MS檢測標記原子。對多個不同原子的提及意味著多于一個的原子種類用于標記樣品?？墒褂肐CP-MS區(qū)分這些原子種類(例如，它們具有不同的m/Q比)，使得煙流內(nèi)兩種不同標記原子的存在產(chǎn)生兩種不同的MS信號。

本發(fā)明適合用于比兩種多得多的不同的標記原子的同時檢測，從而允許多重標記物檢測(例如，至少3種、4種、5種、10種、20種、30種、32種、40種、50種或甚至100種不同的標記原子)。標記原子還可以以組合方式來使用，以便甚至進一步增加可區(qū)分的標記物的數(shù)目。實例論證成像方法中32種不同標記原子的使用，但LA-ICP-MS本質(zhì)地適用于較高數(shù)目的不同原子的并行檢測(例如，甚至超過100種不同原子種類[10])。通過以不同的標記原子來標記不同的靶，在單個圖像中確定多個靶的細胞位置是可能的。

可與本發(fā)明一起使用的標記原子包括任何種類，其通過LA-ICP-MS是可檢測的并且基本上不存在于未標記的組織樣品中。因此，例如，¹²C原子將不適于用作標記原子，因為它們是自然界大量存在的，而¹¹C原子在理論上可以使用，因為其為不自然發(fā)生的人造同位素。然而，在優(yōu)選實施方案中，標記原子為過渡金屬，諸如稀土金屬(15號鑭系元素，加上鈧和釔)。這些17種元素提供可容易地被ICP-MS區(qū)分的許多不同的同位素。可獲得以濃縮同位素的形式的這些元素的很多種，例如，釤具有6種穩(wěn)定同位素，并且釹具有7中穩(wěn)定同位素，其全部以濃縮形式可獲得。15號鑭系元素提供具有非冗余唯一質(zhì)量的至少37種同位素。適于用作標記原子的元素的實例包括鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)、鈧(Sc)和釔(Y)。例如，本發(fā)明可使用如表1至5中列出的鑭系元素的任何同位素。除了稀土金屬之外，其他金屬原子(例如，金(Au)、鉑(Pt)、銥(Ir)、鐒(Rh)、鉍(Bi)等等)適用于通過ICP-MS進行檢測。放射性同位素的使用不是優(yōu)選的，因為它們不便于處理且不穩(wěn)定，例如，在鑭系元素當中，Pm不是優(yōu)選的標記原子。

為了促進TOF分析(參見以上)，使用具有在范圍80-250內(nèi)(例如，在范圍80-210內(nèi)或在范圍100-200內(nèi))的原子質(zhì)量的標記原子是有用的。該范圍包括全部的鑭系元素，但排除Sc和Y。100-200的范圍通過使用不同的標記原子允許理論上的101-重(plex)分析，同時允許本發(fā)明利用TOF MS的高光譜掃描率。如以上所提及的，通過選擇其質(zhì)量位于高于未標記樣品中所看到的那些的窗口中的標記原子(例如，在100-200的范圍內(nèi))，TOF檢測可用于提供生物學顯著水平的快速成像。

標記組織樣品通常要求標記原子附接到特定結(jié)合對(sbp)的一個成員。該標記的sbp與組織樣品接觸，使得其可與sbp的另一個成員(靶sbp成員)交互(如果其存在)，從而將標記原子定位到樣品中的特定位置。本發(fā)明的方法然后檢測標記原子在該特定位置的存在，并且將該信息轉(zhuǎn)化為其中靶sbp成員在所述位置存在的圖像。稀土金屬和其他標記原子可通過已知的技術(shù)結(jié)合到sbp成員，例如，參考文獻17描述鑭系元素原子到用于ICP-MS檢測的寡核苷酸探針的附接，參考文獻18描述使用釕以標記寡核苷酸，并且Fluidigm Canada出售MaxPar^TM金屬標記試劑盒，其可用于將超過30種不同的標記原子結(jié)合到蛋白質(zhì)(包括抗體)。

各種數(shù)目的標記原子可附接到單個sbp成員，并且當更多標記原子附接到任何sbp成員時，可實現(xiàn)更大的靈敏度。例如，大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個標記原子可附接到sbp成員。例如，可使用包含多個單體單元的單分散性聚合物，每個包含諸如DTPA的螯合劑。例如，DTPA結(jié)合具有解離常數(shù)為大約10^-6M的3+鑭系元素離子[1]。這些聚合物可在巰基反應(yīng)性基團(例如，馬來酰亞胺)中終止，所述巰基反應(yīng)性基團可用于附接到sbp成員。例如，巰基反應(yīng)性基團可結(jié)合到抗體的Fc區(qū)域。其他功能性基團(例如，諸如N-羥基琥珀酰亞胺酯的胺反應(yīng)性基團，或者針對羧基或針對抗體的糖基化具有反應(yīng)性的基團)還可用于這些聚合物的結(jié)合。任何數(shù)目的聚合物可結(jié)合到每個sbp成員。可使用的聚合物的特定實例包括直鏈(“X8”)聚合物或第三代樹枝狀(“DN3”)聚合物，這兩者都可用作MaxPar^TM試劑。金屬納米顆粒的使用還可用于增加標記物中原子的數(shù)目。

如以上所提及的，標記原子附接到sbp成員，并且該標記的sbp成員與組織樣品接觸，其中其可發(fā)現(xiàn)靶sbp成員(如果存在的話)，從而形成標記的sbp。標記的sbp成員可包括任何化學結(jié)構(gòu)，其適用于附接到標記原子并然后根據(jù)本發(fā)明用于成像。

一般來說，本發(fā)明的方法可基于任何sbp，所述任何sbp已經(jīng)已知用于在確定組織樣品中靶分子的位置(例如，如在IHC中或熒光原位雜交FISH中使用)中使用，但與樣品接觸的sbp成員將攜帶通過ICP-MS可檢測的標記原子。因此可容易地通過使用可用的IHC和FISH試劑、僅僅通過修改標記物來實施本發(fā)明，所述標記物先前已經(jīng)用于例如修改FISH探針以便攜帶可被ICP-MS檢測的標記物。

sbp可包括以下項中的任一項：核酸雙鏈體；抗體/抗原復合物；受體/配體對；或適體/靶對。因此，標記原子可附接到核酸探針，其然后與組織樣品接觸，使得探針可在其中與互補核酸雜交(例如，以便形成DNA/DNA雙鏈體、DNA/RNA雙鏈體或RNA/RNA雙鏈體)。類似地，標記原子可附接到抗體，抗體然后與組織樣品接觸，使得其可結(jié)合到其抗原。標記原子可附接到配體，配體然后與組織樣品接觸，使得其可結(jié)合到其受體。標記原子可附接到適體配體，適體配體然后與組織樣品接觸，使得其可結(jié)合到其靶。因此，標記的sbp成員可用于檢測樣品中的多種靶(包括DNA序列、RNA序列、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)或代謝物)。

在本發(fā)明的典型實施方案中，標記的sbp成員為抗體。可以通過將結(jié)合分子的一個或更多個標記原子結(jié)合到抗體來實現(xiàn)抗體的標記(例如，使用如以上所描述的MaxPar^TM結(jié)合試劑盒)。識別對成像有用的細胞蛋白質(zhì)的抗體已經(jīng)廣泛地可用于IHC用途，并且通過使用標記原子而不是當前標記技術(shù)(例如，熒光)，這些已知的抗體可容易地適用于本發(fā)明的方法，但具有增加的多重能力的益處。與本發(fā)明一起使用的抗體可識別細胞表面上的靶或細胞內(nèi)的靶?？贵w可識別多種靶，例如，它們可特異地識別單獨的蛋白質(zhì)，或可識別共享共同表位的多個相關(guān)蛋白質(zhì)，或可識別蛋白質(zhì)上的特定翻譯后修飾(例如，以便在感興趣的蛋白質(zhì)上的酪氨酸和磷酸-酪氨酸之間進行區(qū)分、以便在賴氨酸和乙?；?賴氨酸之間進行區(qū)分、以便檢測泛素化等等)。在結(jié)合到其靶之后，結(jié)合到抗體的標記原子可被檢測以揭示樣品中該靶的位置。

標記的sbp成員通常將直接與樣品中的靶sbp成員相互作用。然而，在一些實施方案中，標記的sbp成員與靶sbp成員間接地相互作用是可能的，例如，在夾心分析法模式中，第一抗體可結(jié)合到靶sbp成員，并且標記的第二抗體可然后結(jié)合到第一抗體。然而，本發(fā)明通常依賴于直接相互作用，因為所述直接相互作用可更容易地實現(xiàn)并允許較高的多重化。然而，在兩種情況下，樣品與可結(jié)合到樣品中的靶sbp成員的sbp成員接觸，并且在稍后階段，檢測附接到靶sbp成員的標記物。

本發(fā)明的一個特征是其檢測樣品中多個(例如，10個或多于10個，并且甚至高達100個或多于100個)不同靶sbp成員的能力(例如，以便檢測多個不同的蛋白質(zhì)和/或多個不同的核酸序列)。為了允許這些靶sbp成員的差異檢測，它們各自的sbp成員應(yīng)攜帶不同的標記原子，使得它們的信號可由ICP-MS區(qū)分。例如，在檢測十種不同蛋白質(zhì)的情況下，可使用十種不同的抗體(每個對不同的靶蛋白質(zhì)特異)，其每個攜帶獨特的標記物，使得來自不同抗體的信號可被區(qū)分。在一些實施方案中，期望的是針對單個靶使用多個不同的抗體(例如，所述多個不同的抗體識別相同蛋白質(zhì)上的不同表位)。因此，由于該類型的冗余性，方法可使用多于靶的抗體。然而，通常，本發(fā)明將使用多個不同的標記原子以檢測多個不同的靶。

如果多于一個標記抗體與本發(fā)明一起使用，那么優(yōu)選的是，抗體應(yīng)具有針對它們各自抗原的類似親和性，因為這幫助確保通過LA-ICP-MS檢測的標記原子的數(shù)量和組織樣品中靶抗原的豐度之間的關(guān)系將在全部不同sbp內(nèi)更加一致(特別在高掃描頻率下)。

如果靶sbp成員位于細胞內(nèi)，則通常有必要在樣品與標記物接觸之前或期間透化細胞膜。例如，當靶為DNA序列但標記的sbp成員不能透過活細胞的膜時，可固定和透化組織樣品的細胞。然后標記的sbp成員可進入細胞并與靶sbp成員形成sbp。在這方面，可利用用于IHC和FISH的已知方案。

通常，本發(fā)明的方法將檢測至少一個細胞內(nèi)靶和至少一個細胞表面靶。然而，在一些實施方案中，本發(fā)明可用于檢測多個細胞表面靶同時忽略細胞內(nèi)靶?？偟膩碚f，由于本發(fā)明將提供樣品中所選擇靶的位置的圖像，因此靶的選擇將通過從方法所需的信息來確定。

組織樣品

本發(fā)明提供對組織樣品進行成像的方法。組織樣品包括多個相互作用的細胞，并且方法使多個這些細胞經(jīng)受激光燒蝕，以便提供組織樣品中這些細胞的圖像。通常，本發(fā)明可用于分析目前通過IHC技術(shù)研究但是使用了適用于通過LA-ICP-MS進行檢測的標記的組織樣品。

任何合適的組織樣品可在本文描述的方法中使用。例如，組織可以是上皮組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等等以及它們的組合。出于診斷或預(yù)測目的，組織可來自腫瘤。在一些實施方案中，樣品可來自已知的組織，但樣品是否包含腫瘤細胞可為未知的。成像可揭示指示腫瘤的存在的靶的存在，因此促進診斷。組織樣品可包括乳腺癌組織(例如，人類乳腺癌組織或人類乳腺上皮組織(HMLE))。組織樣品可包含福爾馬林固定的、石蠟包埋(FFPE)組織?？蓮娜魏位畹亩嗉毎袡C體(但通常將是人類)獲得組織。

通常組織樣品將為切片(例如，具有在2-10μm范圍內(nèi)(諸如在4-6μm之間)的厚度)。用于制備此類切片的技術(shù)(例如，使用切片機，包括脫水步驟、包括包埋等等)在IHC的領(lǐng)域是所眾所周知的。因此，組織可為化學上固定的并且然后可在所需平面中制備切片。冷凍切片或激光捕獲顯微切割還可用于制備組織樣品。樣品可被透化(例如，以便允許用于細胞內(nèi)靶的標記的試劑(參見以上內(nèi)容))。

盡管最大尺寸將由激光燒蝕裝置指定，并且特別地由可適合其燒蝕單元的樣品的尺寸指定，但是將被分析的組織樣品的尺寸將類似于當前IHC方法。多達5mm x 5mm的尺寸為典型的，但更小的樣品(例如，1mm x1mm)也是有用的(這些維度指的是切片的尺寸，不是其的厚度)。

除了對組織樣品進行成像是有用的之外，本發(fā)明反而可用于細胞樣品(諸如貼壁細胞單層或固體表面上固定的細胞單層(如在傳統(tǒng)免疫細胞化學中))的成像。這些實施方案對分析貼壁細胞是特別地有用的，所述貼壁細胞不可被容易地溶解用于細胞懸浮液質(zhì)譜細胞術(shù)。因此，和對增強當前免疫組織化學分析有用一樣，本發(fā)明可用于增強免疫細胞化學。

根據(jù)本發(fā)明，在被制備之后，樣品將被放置在激光燒蝕單元中，并且然后經(jīng)受分析。

單細胞分析

本發(fā)明的方法包括樣品中的多個細胞的激光燒蝕，并且因此分析來自多個細胞的煙流，并且將它們的內(nèi)含物映射到樣品中的特定位置，以提供圖像。在大多數(shù)情況中，方法的使用者將需要將信號定位到樣品內(nèi)的特定的細胞，而不是將信號定位到作為整體的樣品。為了實現(xiàn)將信號定位到樣品內(nèi)的特定細胞，可以劃分樣品中細胞的界限(例如質(zhì)膜，或在一些情況中細胞壁)。

劃分細胞的界限可以以多種方式實現(xiàn)。例如，可使用可劃分細胞界限的傳統(tǒng)的技術(shù)研究樣品，諸如顯微術(shù)。然后可使用本發(fā)明的方法制備該樣品的圖像，并且該圖像可疊加在較早的結(jié)果上，因此允許LCP-MS信號定位到特定的細胞。

然而，為了避免使用多個技術(shù)的需要，劃分細胞界限作為本發(fā)明的成像方法的一部分是可能的。從IHC和免疫細胞化學此類界限劃分策略是熟悉的，并且通過使用可被ICP-MS檢測的標記物，這些方法可被適用。例如，方法可包括標記已知定位在細胞界限的靶分子，并且然后來自這些標記物的信號可被用于界限劃分。合適的靶分子包括細胞界限的豐富的或普遍的標志物，諸如粘附復合體的成員(例如β-連環(huán)蛋白或E-鈣粘素)。一些實施方案可標記多于一種膜蛋白以便增強劃分。

除了通過包括合適的標記物劃分細胞界限之外，以該方式劃分特定的細胞器也是可能的。例如，抗原諸如組蛋白(例如H3)可被用于鑒定細胞核，并且標記線粒體特異的抗原、細胞骨架特異的抗原、高爾基體特異的抗原、核糖體特異的抗原等也是可能的，因此通過本發(fā)明的方法允許分析細胞的超微結(jié)構(gòu)。

可通過肉眼評價，或可通過計算機使用圖像加工分析劃分細胞(或細胞器)的界限的信號。此類技術(shù)在本領(lǐng)域?qū)τ谄渌上窦夹g(shù)是已知的，例如參考文獻19描述了分割方案，其使用空間濾波從熒光圖像來確定細胞界限，參考文獻20公開了算法，其從明視野顯微鏡圖像確定界限，參考文獻21公開了CellSeT方法來從共聚焦顯微鏡圖像提取細胞幾何形狀，以及參考文獻22公開了CellSegm MATLAB工具箱用于熒光顯微鏡成像?？膳c本發(fā)明一起使用的方法使用分水嶺轉(zhuǎn)化(watershed transformation)和高斯模糊(Gaussian blurring)。這些圖像加工技術(shù)可以獨立地使用，或其可被使用并且然后肉眼檢查。

已劃分細胞的界限后，將來自特定的靶分子的信號分配到單獨的細胞是可能的。定量單獨的細胞中的靶分析物的量也可以是可能的(例如，通過針對定量標準校正方法)。本發(fā)明的方法是高度定量的。與已知的方法比較，本發(fā)明的方法不經(jīng)受樣品的自發(fā)熒光，當與MALDI和SIMS成像中共有的那些方法相比，基體效應(yīng)最小或不存在，不存在對于放大步驟的需要，諸如在IHC中通常采用的，組織可被完全地取樣，并且方法具有～10⁵的寬的動態(tài)范圍。

與其他技術(shù)的結(jié)合

本發(fā)明的方法可以與其他成像技術(shù)結(jié)合，并且從不同技術(shù)獲得的圖像可以結(jié)合以給出更豐富的綜合圖像。例如，首先可以通過傳統(tǒng)的技術(shù)諸如顯微術(shù)使用熒光和/或可見標記物(例如IHC分析)使樣品成像。由于此類技術(shù)是非破壞性的，并且由于它們的標記物通常不包括給出有用的LCP-MS信號的原子(通常它們由與樣品自身相同的原子組成；如果它們確實含有在MS光譜中將是可見的原子，那么它們的存在可在MS步驟中被容易地補償，例如通過不使用這些原子作為標記原子)，然后樣品可通過本發(fā)明的方法成像，并且顯微術(shù)和質(zhì)譜細胞術(shù)結(jié)果可結(jié)合使用。

如果本發(fā)明的方法與另一種破壞性成像技術(shù)(例如MALDI成像[23])結(jié)合，那么對同一組織的相鄰切片使用這兩種技術(shù)是優(yōu)選的。

一般

術(shù)語“包含(comprising)”涵蓋“包括(including)”以及“組成(consisting)”例如“包含”X的組合物可以獨一地由X組成或可包括另外的一些例如X+Y。

與數(shù)值x有關(guān)的術(shù)語“約”是任選地并且意味著例如x+10％。

術(shù)語“基本地(substantially)”不排除“完全地(completely)”例如“基本不含”Y的組合物可以完全沒有Y。必要時，單詞“基本地”可以從本發(fā)明的定義省略。

附圖簡述

圖1a示出了使用識別五種標志物(從上到下：H3；HER2；CK8/18；E-Cad；Vim)的未標記的(左)和金屬標記的(右)抗體，對管腔HER2+亞型(病例號37)的連續(xù)乳腺癌組織切片的IFM。字母指示標記物顏色，其中c＝藍綠色，r＝紅色，y＝黃色。

圖1b示出了使用識別與圖1a相同的五種標志物的金屬標記的抗體，對管腔HER2+亞型(病例號210、23和37)的乳腺癌組織切片的IFM(左)和CyTOF成像質(zhì)譜細胞術(shù)(右)。

圖2a示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號210)的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。細胞角蛋白8/18(紅色)、H3(藍綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖2b示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號210)的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。細胞角蛋白7(紅色)、H3(藍綠色)和CD44(黃色)的疊加。

圖2c示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號210)的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。泛-肌動蛋白(紅色)、孕酮受體(藍色)和CD68(黃色)的疊加。

圖2d示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號23)的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。HER2(紅色)、H3(藍綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖2e示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號23)的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。E-鈣粘蛋白(紅色)、細胞角蛋白7(黃色)和S6上的S235/S236上的磷酸化(藍色)的疊加。

圖2f示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號23)的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。β-連環(huán)蛋白(紅色)、雌激素受體(藍色)和CD68(黃色)的疊加。比例尺，25μm。

圖3示出了通過成像質(zhì)譜細胞術(shù)(上兩行；C)或IFM(下兩行；IFM)的貼壁細胞的分析。顯微照片示出了如用金屬標記的抗體所指示的，標記的和成像的人類乳腺上皮細胞，所述金屬標記的抗體識別一組磷酸化殘基(從左向右：PLCγ2，pY759；ERK，pT202/pY204；p38，pT180/pY182；S6，pS235/pS236)，該人類乳腺上皮細胞經(jīng)(行1&3；+)或未經(jīng)(行2&4；–)酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸酯處理30-min。比例尺，25μm。對于每個對照刺激的比較，保持恒定的曝光，但不同的抗體之間不保持恒定的曝光。

圖4a示出了以指示的標志物模式鑒定重疊的細胞群體的SPADE樹。淺灰色區(qū)域含有在所有通道具有低標志物表達的細胞。Vim，波形蛋白；E-Cad，E-鈣粘蛋白；CK8/18，細胞角蛋白8/18；CK7，細胞角蛋白7；β-Cat，β-連環(huán)蛋白；ER，雌激素受體；CAH IX，碳酸酐酶IX；PR，孕酮受體；med，培養(yǎng)基。

圖4b示出了顯示對腫瘤病例號201的CD20側(cè)群的聚類樹。顏色表示指示的標志物的表達水平，并且結(jié)節(jié)的尺寸對應(yīng)來自給定患者的落在細胞聚類內(nèi)的細胞的百分比。

圖4c到4i示出了聚類樹，所述聚類樹示出了HER2+樣品的細胞亞群。病例號是(c)359(d)254(e)210(f)199(g)201(h)294(i)276，其是管腔樣品。

圖5示出燒蝕小室在20Hz的信號分離。示出的信號是所有感興趣的同位素相加的強度。讀數(shù)是對所有測量的通道相加。

圖6示出了通過IFM(左)和CyTOF成像質(zhì)譜細胞術(shù)(右)對管腔HER2+亞型的乳腺癌組織切片分析的金屬標記的抗體的特異性的比較(PR病例號210、HER2和細胞角蛋白8/18病例號23)。Hoechst 33258和H3以藍綠色示出，而三種特異的標志物以紅色示出(上：PR；中：Her2；下：CK8/18)。指示每激光射出計數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：H3,200(病例號210)和400(病例號23)；PR,10；HER2,50；細胞角蛋白8/18,30。圖像中白色尺寸條指示25μm。

圖7a示出了組織號210的圖像，顯示β-連環(huán)蛋白(紅色)、H3(藍綠色)和pS6(黃色)的疊加。對于圖7a-d，指示每激光射出計數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：pS6，15(組織號210)和20(組織號23)；H3，200(組織號210)和400(組織號23)；β-連環(huán)蛋白，20；HER2，30；CAH IX，15；E-鈣粘蛋白，20；波形蛋白，400；細胞角蛋白8/18,25。圖像中白色尺寸條指示25μm。

圖7b示出了組織號210的圖像，顯示HER2(紅色)、H3(藍綠色)和CAH IX(黃色)的疊加。

圖7c示出了組織號210的圖像，顯示E-鈣粘蛋白(紅色)、H3(藍綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖7d示出了組織號23的圖像，顯示細胞角蛋白8/18(紅色)、H3(藍綠色)和S6上磷酸化(黃色)的疊加。

圖8A-E示出了病例號37的連續(xù)切片上金屬標記的抗體(左上)和未標記的抗體(右上)的IFM圖像。示出了金屬標記的抗體(左下)和未標記的抗體(右下)的IFM分析的單細胞強度分布，其描繪針對事件的強度。事件數(shù)目未被標準化。平均信號由紅色線代表。中值信號由綠色方形代表。

圖9a和9b示出了在單重IHC(左側(cè)兩個插圖)和32重成像質(zhì)譜細胞術(shù)(右側(cè)的插圖)測量結(jié)果之間的比較。使用了管腔HER2+腫瘤(病例號210)的切片，但切片不是連續(xù)的。指示每激光射出計數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：HER2，30；PR，10；CK8/18，80；H3，200。圖像中白色尺寸條指示25μm。

進行本發(fā)明的模式

以下提出的實施例論證成像技術(shù)，所述成像技術(shù)延伸基于CyTOF的質(zhì)譜細胞術(shù)的多重分析能力來進行使用LA-ICP-TOFMS的空間分辨的測量。進一步的詳述公開在參考文獻24以及其補充信息中(全部通過引用并入本文)，包括圖1-4和6-9的彩色拷貝。

實施例1-使用質(zhì)譜細胞術(shù)使組織樣品成像

已經(jīng)開發(fā)了將質(zhì)譜細胞術(shù)、ICC和IHC分析與高分辨率激光燒蝕系統(tǒng)耦合的工作流程，以允許貼壁細胞和組織切片的具有1μm的亞細胞分辨率的分析。

第一步中，使用常規(guī)ICC和IHC方案，制備細胞樣品或組織切片用于抗體標記[25]。選擇抗體以靶向與乳腺癌相關(guān)的32種蛋白和蛋白修飾。在染色之前，用限定原子質(zhì)量的獨特稀土金屬同位素對抗體加標簽。

空氣干燥后，將樣品安置在參考文獻7中描述的激光燒蝕小室內(nèi)，該激光燒蝕小室使氣霧劑分散最小化，用于高分辨率、高通量和高靈敏度分析。然后，逐光斑和逐行燒蝕組織，并且然后通過混合的氬氣和氦氣的流將燒蝕的材料運輸?shù)紺yTOF質(zhì)譜細胞儀。

圖5示出了，對所有測量的通道相加的、在20Hz的單獨的激光射出的信號被完全地分開。假設(shè)泊松統(tǒng)計，檢測的極限是近似六個離子計數(shù)(對應(yīng)～500分子)。

在數(shù)據(jù)預(yù)處理之后，使用每個單一激光射出的坐標描繪32個瞬時的、單一的同位素信號，并且通過疊加所有分析的測量通道生成樣品的高維度圖像。下一步，使用分水嶺算法在計算機上分割單細胞特征，并且使標志物表達數(shù)據(jù)與單獨的細胞匹配。單細胞數(shù)據(jù)被用于所有的下游數(shù)據(jù)分析，并且來研究總共來自20個乳腺癌患者的一組21個腫瘤和正常樣品內(nèi)的細胞亞群。

患者和標本特征

組織微陣列(TMA)含有如先前描述的[26]主要亞型的FFPE乳腺癌組織和正常的乳腺組織。通過成像質(zhì)譜細胞術(shù)分析的所有腫瘤被兩個有經(jīng)驗的臨床病理學家通過蘇木精和曙紅染色再評價，以鑒定代表性區(qū)域。根據(jù)國際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)和世界衛(wèi)生組織(WHO)標準，分配腫瘤階段和Bloom-Richardson-Elston(BRE)級別。乳腺癌亞型的分類是基于ER、PR和HER2的IHC表達模式。通過HER2IHC和HER2FISH評價HER2狀態(tài)[27]。

準備HMLE細胞用于成像質(zhì)譜細胞術(shù)

使人類乳腺上皮(HMLE)細胞[28]在玻璃蓋玻片上生長到～80％匯合，并且在37℃用模擬物處理或用125μM釩酸酯處理持續(xù)30min。使用標準的ICC方案[25]，準備細胞用于成像質(zhì)譜細胞術(shù)和IFM。

抗體

獲得在無載體/蛋白的緩沖液中的抗體并且然后根據(jù)供應(yīng)商的說明書[29]使用抗體綴合試劑盒制備。在我們通過在280nm的吸光度的測量，確定百分產(chǎn)率之后，在穩(wěn)定液中稀釋金屬標記的抗體用于在4℃的長期儲存。在該研究中使用的抗體在表1至5中列出。

準備乳腺癌組織切片用于IHC、IFM和成像質(zhì)譜細胞術(shù)

這些實施例中論證的TMA的所有經(jīng)典IHC染色在Ventana Benchmark XT上使用Ventana預(yù)稀釋的抗體和標準的方案進行。將樣品對HER2、PR、細胞角蛋白8/18和H3染色。對于每個抗體的比較分析，保持給定標志物的曝光時間恒定。通過ImageJ軟件加工圖像。

將組織號23和FFPE乳腺癌TMA及相應(yīng)的健康組織切成5-μm厚度用于成像質(zhì)譜細胞術(shù)。在二甲苯中過夜使切片脫蠟，然后在梯度系列的乙醇中復水(純乙醇、乙醇：去離子水為90:10、80:20、70:30、50:50、0:100；每次10min[30])。在88℃水浴中的pH為9的Tris-EDTA緩沖液中，進行熱誘導的表位修復持續(xù)20min。在立即冷卻之后，用在PBS/0.1％Triton X-100中的1％BSA封閉TMA持續(xù)30min。為了染色，使TMA樣品與抗體預(yù)混液在4℃孵育過夜(表1、4和5)。然后用PBS/0.1％Triton X-100洗滌樣品五次。

對于在圖1b、2和7中示出的TMA核心號210，使用了以下的方案：在92–94℃在pH為9的Tris-EDTA緩沖液中熱誘導的表位修復持續(xù)20min。在立即冷卻之后，用TBS/0.1％Triton X-100中的3％BSA封閉TMA切片持續(xù)45min。使TMA樣品與抗體預(yù)混液在4℃孵育過夜(表2)，該抗體預(yù)混液含有除了抗-pSHP2、抗-CD31、抗-TWIST、抗-CD3、抗-SLUG和抗-EGFR之外的所有抗體。在用2×TBS/0.1％Triton X-100和2×TBS的洗滌步驟之后，添加那些抗體，并且在室溫孵育樣品2.5小時，以及然后在4℃孵育1小時。在洗滌之后，在成像質(zhì)譜細胞術(shù)之前，使樣品在室溫干燥。

高空間分辨率激光燒蝕

通過如以上討論的成像質(zhì)譜細胞術(shù)分析組織切片。修改的ArF準分子GeoLas C激光系統(tǒng)(Coherent)將均質(zhì)的UV激光束(λ＝193nm)遞送到25μm的孔，所述均質(zhì)的UV激光束通過25倍縮小在組織樣品上成像。得到的1μm直徑和3.5J/cm²激光能量密度的激光束被用于以20Hz的頻率燒蝕抗體染色的組織。得到的組織的激光燒蝕坑直徑為～1μm(如通過掃描電子顯微術(shù)確定的)。激光燒蝕小室的平移速度是20μm/s。為了完全取出在感興趣的區(qū)域內(nèi)的組織層，以1-μm距離光柵掃描單獨的線掃描。用于使在激光燒蝕系統(tǒng)上的高空間分辨率、高靈敏度成像成為可能的激光燒蝕小室在參考文獻7中被詳述。燒蝕的樣品氣霧劑通過氬氣和氦氣氣流被直接地運輸?shù)紺yTOF質(zhì)譜細胞儀。CyTOF儀器設(shè)置[11、12]先前被關(guān)于CyTOF軟件版本5.1.598描述。

單細胞分割

在單細胞蛋白表達分析之前，拓撲單細胞分割是必需的。為了檢測圖像中的細胞界限，將細胞膜蛋白β-連環(huán)蛋白、HER2和細胞角蛋白8/18摻入實驗方案；對蛋白H3染色，用于鑒定細胞核。圖像示出了對齊良好的形態(tài)學細胞界限和中央。通過分水嶺轉(zhuǎn)化實現(xiàn)了進一步的細胞分割[31、32]。首先，使膜圖像和陰性細胞核圖像疊加，以產(chǎn)生最大的細胞界限信息。然后圖像被高斯模糊以使成像偽跡和噪音最小化。最后，用Matlab成像工具箱(Matlab R2011b)沿著細胞膜尋找分水嶺。用先前的高斯模糊(3–4.5像素的核心寬度)和用于分水嶺的標準參數(shù)[30]，實現(xiàn)了最佳分割結(jié)果。如果必要的話，視覺評價以及修正所有的單細胞界限。然后，使界限罩的內(nèi)含物經(jīng)受單細胞分析。最后，將單細胞標志物表達對從每個圖像獲得的中值H3信號標準化。

單細胞標志物強度的比較

對于免疫熒光圖像，使用CellProfiler[33]分割流水線進行單細胞分割。所有強度被從0至1重新修改比例，并且移除異常值(<0.1％樣品尺寸)。對于成像質(zhì)譜細胞術(shù)數(shù)據(jù)，分析自分水嶺算法提取的細胞事件(參見以上)。由于正態(tài)分布不能被假定，使用Wilcoxon秩和檢驗作為Student’s t檢驗的可選方案，在Matlab 2013a中進行預(yù)處理和進一步分析。通過對每個方法全局定義的閾值，估計陽性和陰性單細胞。對于每個比較，一個生物學重復是可得的。

計算檢測極限

對于與對單激光射出的積分時間(50ms或一個圖像像素)一致的一段持續(xù)時間中的信號計算檢測極限(LOD)。大多數(shù)通道的平均的背景信號少于每激光射出的一個計數(shù)。然后基于泊松統(tǒng)計，根據(jù)以下的公式確定離子計數(shù)中的LOD[34]:LOD＝3.29×S+2.71，其中S是在該時間持續(xù)期間積分的背景信號的s.d.(假定S是平均背景的平方根；因此，保守地估計，S≈1)。因此，估計圖像的LOD(平均背景修正的)將是每圖像像素六個計數(shù)。

數(shù)據(jù)分析和圖像可視化

使用Matlab常規(guī)(Matlab R2012a)進行所有的數(shù)據(jù)加工。以文本格式從質(zhì)譜細胞器輸出瞬時信號數(shù)據(jù)。文檔由成行的推進數(shù)(即，時間)和成列的質(zhì)量通道組成，并且測量的值作為離子計數(shù)給出。每個通道中記錄的信號經(jīng)768個推進被積分，等于10-ms時間窗(1推進≈13μs)。隨后，瞬時信號中的每個激光生成的脈沖(50-ms持續(xù)時間)被積分成為單激光射出信號。最后，通過以其被記錄的相同的順序描繪激光射出信號，逐行掃描重構(gòu)每個質(zhì)量通道的圖像。對于進一步的數(shù)據(jù)分析，從每個單獨的圖像數(shù)據(jù)集中減去在第一行掃描開始之前獲得的每個單獨的通道經(jīng)～1秒的持續(xù)時間確定的平均背景。

僅為了可視化，每個單獨通道的圖像被放大取樣到1,500像素的寬度，其中使用Adobe Photoshop v.13中的雙立體自動重新取樣保持圖像比。對于圖像偽跡修正，在Adobe Photoshop v.13中用以下的這些設(shè)置實施噪音減少：強度5、保留細節(jié)2％、減少顏色噪音0％和銳化細節(jié)40％。對于PR(病例號23和210)和裂解的半胱天冬酶3(病例號210)，在放大取樣之前，施加“去除雜點”和高斯模糊(核心寬度，0.25像素)。對于所有的數(shù)據(jù)分析步驟，除非另外提出，僅使用原始數(shù)據(jù)。對于圖1b，對于成像質(zhì)譜細胞術(shù)指示每激光射出計數(shù)的比例最大值如下調(diào)整，從上到下：H3，200；HER2，30和H3,200；CK8/18，80和H3，200；E-鈣粘蛋白，40和H3，400；波形蛋白，80和H3，400。對于圖2，指示每激光射出計數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：組織號210:H3，200；CK8/18，80；波形蛋白，400；CK7，25；CD44，50；PR，10；泛-肌動蛋白，40；CD68，20。組織號23:HER2，50；H3，400；波形蛋白，100；E-鈣粘蛋白，30；細胞角蛋白7，25；pS6，20；β-連環(huán)蛋白，40；ER，40；和CD68，10。對于圖3，對于每個蛋白磷酸化位點示出的最大離子計數(shù)在處理和對照條件之間一致，并且指示每激光射出計數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：PLCγ2，600；ERK，100；p38，60和S6，60。

實施例2-標記原子對抗體特異性的影響

使用FFPE乳腺癌樣品進行實驗以確定抗體的標記是否將干擾它們的靶特異性。對來自同一類型的腫瘤的組織號210和號37的連續(xù)切片使用IFM分析，比較未標記的和標記的抗體。圖1a示出，未觀察到由于金屬標記導致的抗體特異性的明顯的變化。

圖1a示出了使用識別指示的標志物的未標記的和金屬標記的抗體，對管腔HER2+亞型(病例號37)的連續(xù)乳腺癌組織切片的IFM。

定量分析示出了，在未標記的和金屬標記的抗體之間的每種標志物的平均單細胞熒光強度的差異，盡管顯著，是小的。這些差異完全在實驗過程中通常觀察到的可變性的范圍內(nèi)并且在連續(xù)組織切片之間是類似但不相同的。通過在所有測試的抗體對的分析的強度范圍內(nèi)的單細胞標志物熒光強度分布的一致性，進一步證實了在未標記的和金屬標記的抗體之間的相似性(圖8a-e)。

圖8a-e示出了在病例號37的連續(xù)切片上，針對H3、HER2、細胞角蛋白8/18、E-鈣粘蛋白和波形蛋白的金屬標記的和未標記的抗體的IFM圖像。這些圖像被用于定量地比較單細胞信號強度。金屬標記的抗體和未標記的抗體的IFM分析的單細胞強度分布是相當?shù)?。事件?shù)目未被標準化。

實施例3-通過與IFM比較驗證成像方法

如被IFM確定的，通過質(zhì)譜細胞術(shù)生成的圖像重現(xiàn)相同的染色模式和表達給定標志物的細胞的百分比。對每個來自相同的管腔HER2+亞型的腫瘤切片使用IFM和成像質(zhì)譜細胞術(shù)；兩種方法給出對該亞型預(yù)期的抗體染色模式(圖1b、圖6和表1和2)。核小體DNA包裝蛋白標志物H3通常在細胞核中觀察到。孕酮受體(PR)、管腔乳腺癌中激活的轉(zhuǎn)錄因子、HER2、表皮生長因子受體家族成員以及細胞角蛋白8/18和上皮細胞-細胞連接組分E-鈣粘蛋白通常在質(zhì)膜中觀察到。波形蛋白指示基質(zhì)區(qū)室。這些模式與通過其他的抗體驗證一致。

表達分析的標志物的腫瘤細胞的百分比在IFM和成像質(zhì)譜細胞術(shù)中的連續(xù)組織切片上是類似的。圖1b示出了對于H3分別為100％和100％；對于HER2為75％和79％；以及對于細胞角蛋白8/18，為63％和66％。圖2和圖7示出了另外的標志物的質(zhì)譜細胞術(shù)圖像。

圖1b示出了使用識別指示的標志物的金屬標記的抗體，對管腔HER2+亞型(病例號210、23和37)的乳腺癌組織切片的IFM和CyTOF成像質(zhì)譜細胞術(shù)。未在連續(xù)切片上分析E-鈣粘蛋白(E-Cad)和波形蛋白(Vim)。

圖6示出了通過IFM和通過CyTOF成像質(zhì)譜細胞術(shù)對管腔HER2+亞型的乳腺癌組織切片分析的金屬標記的抗體的特異性的比較(PR病例號210、HER2和細胞角蛋白8/18病例號23)。未發(fā)現(xiàn)特異性的明顯改變。

實施例4-多重對抗體表現(xiàn)的影響

單重IHC、雙重IFM和32重成像質(zhì)譜細胞術(shù)分析產(chǎn)生一致的結(jié)果。在同一管腔HER2+腫瘤(210號)中使用同一抗體(細胞角蛋白8/18和H3)或使用不同的抗體克隆但針對同一靶(HER2和PR)的單重IHC分析產(chǎn)生類似的染色模式。對于IHC和成像質(zhì)譜細胞術(shù)二者，>90％的上皮細胞表達這些標志物，如圖9a和b中示出的。同一管腔HER2+腫瘤(病例號210)的切片被用于圖9a和9b中示出的質(zhì)譜細胞術(shù)和IHC，但切片不是連續(xù)的。染色模式中未發(fā)現(xiàn)明顯差異。指示每激光射出計數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：HER2，30；PR，10；CK8/18，80；H3，200。對于圖9a，對于成像質(zhì)譜細胞術(shù)和IHC分析使用同一抗體克隆。對于圖9b，對于成像質(zhì)譜細胞術(shù)和IHC分析使用不同抗體克隆(成像質(zhì)譜細胞術(shù)：HER2，BD(3B5)；PR，Epitomics(EP2)和IHC:HER2，Ventana(4B5)；PR，Ventana(1E2))。

在IFM分析中以一式兩份測量的抗體在表達給定分析的標志物的腫瘤細胞的空間分布和百分比方面示出與32重CyTOF分析中的那些相當?shù)男再|(zhì)(圖1b和圖6)。總之，這些結(jié)果指示，多重化不導致抗體表現(xiàn)的可觀察的變化。

因此，這些實施例中展示的結(jié)果示出，成像質(zhì)譜細胞術(shù)使具有亞細胞分辨率的同時且高度多重化的組織成像成為可能。在未標記的和標記的抗體之間，或在單重IHC、雙重IFM和使用成像質(zhì)譜細胞術(shù)的多重分析之間不存在特異性和性能的明顯變化。

實施例5-評價ICC方案中的貼壁細胞系

測試成像質(zhì)譜細胞術(shù)以確定其是否可以被用于評價ICC方案中的貼壁細胞系。通過模擬物處理的和磷酸酪氨酸磷酸酶抑制劑處理的HMLE細胞的質(zhì)譜細胞術(shù)的28個標志物的分析揭示了預(yù)期的信號傳導反應(yīng)。表3示出了該分析中使用的標志物和抗體的細節(jié)。如圖3中示出的，在PLCγ2上的Y759上、在ERK1上的T202和Y204上(在ERK2上的T184和Y186上)以及在p38上的T180和Y182上觀察到增加的磷酸化。

圖3示出了通過IFM和成像質(zhì)譜細胞術(shù)對貼壁細胞的分析。圖3中示出的顯微照片中示出了如用識別一組磷酸化殘基的抗體所指示的，標記的且成像的人類乳腺上皮細胞，該人類乳腺上皮細胞未經(jīng)酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸酯(“對照”)和經(jīng)(“刺激”)的30-min的處理。對于每個對照刺激的比較保持恒定的曝光，但不同的抗體之間不保持恒定的曝光。注意，一抗和二抗檢測被分別用于成像質(zhì)譜細胞術(shù)和IFM。

對質(zhì)譜細胞術(shù)獲得的結(jié)果與來自類似地處理的和制備的HMLE細胞的IFM分析的數(shù)據(jù)一致(圖3)。對于其他非酪氨酸磷酸化位點，包括在S6上的S235和S236上，未觀察到誘導。

因此，本發(fā)明的方法適用于成像貼壁細胞單層以及離體樣品。

實施例6-乳腺癌中的腫瘤異質(zhì)性分析

乳腺癌中，HER2、雌激素受體(ER)和PR的表達被用于定義主要的亞型，包括管腔HER2-、管腔HER2+、HER2+和三陰性[35]和[36]。測試本發(fā)明的方法具有以下的目的：(i)使用我們的多重測量結(jié)果描繪細胞亞群的表型和(ii)評價是否可以使用成像質(zhì)譜細胞術(shù)，檢測先前觀察到的在那些亞型內(nèi)和之間的乳腺癌異質(zhì)性[37]、[38]和[39]。使用32重成像大量細胞分析法來分析組織微陣列(TMA)上的21個FFPE樣品，所述21個FFPE樣品先前已被病理學家分類為主要的乳腺癌亞型或為正常的。

使用密度標準化事件的生成樹級數(shù)分析(spanning-tree progression analysis of density-normalized events，SPADE)[16]，鑒定細胞亞群和細胞轉(zhuǎn)變。對于分析的腫瘤的SPADE分析，在http://cytobank.org/上并且使用軟件工具SPADE[16]分析從分水嶺算法中提取的細胞事件。以下概括了在基于成像的該單細胞分析的條件內(nèi)的SPADE算法。首先，進行所有的提取的細胞事件的密度依賴的縮小取樣到預(yù)定的靶數(shù)目。實施以下的設(shè)置：Arcsinh Cofactor＝5，聚類的靶數(shù)目＝150，縮小取樣到事件的靶數(shù)目＝5。通過使用軟件Cytoscape_v.2.8.3，運行分析。然后，根據(jù)19種標志物(ER、PR、CD68、CD20、c-MYC、HER2、pAMPK、H3、pERK、pBad、CD44、β-連環(huán)蛋白、波形蛋白、細胞角蛋白7、CAH IX、E-鈣粘蛋白、pS6、半胱天冬酶3和細胞角蛋白8/18)的表達，將縮小取樣的細胞事件聚類為細胞的表型上類似的團塊。細胞的表型上類似的團塊經(jīng)由邊緣連接，以畫出最小生成樹。下一步，進行放大取樣步驟以將來自初始數(shù)據(jù)集的每個細胞事件分配到最具代表性的團塊。最后，最小生成樹投射到兩個維度，并且代表細胞團塊的樹的圈被給定的測量參數(shù)的中值強度水平著色，允許跨越整個細胞層次的標志物的表達可視化。對于代表細胞群體的SPADE樹，結(jié)節(jié)尺寸作為總百分比被給出(例如，來自給定圖像的細胞的數(shù)目落入細胞聚類)。使用屬性值：0/5/7/15/最大，結(jié)節(jié)尺寸：60/120/150/200/200。圖4中，對于HER2，在4-9的范圍中設(shè)定彩色條具有步長4/4.5/5/6/7/8.5/9。展示了CD20陽性細胞亞群，并且在以下步長的0-9的范圍中設(shè)定彩色條：1/3/5/6/7/8/9。

圖4示出了腫瘤異質(zhì)性的成像質(zhì)譜細胞術(shù)分析。分析了來自20個乳腺癌患者的21個樣品。SPADE樹鑒定了具有指示的標志物模式的重疊細胞群體。淺灰色區(qū)域含有在所有通道中具有低標志物表達的細胞(圖4a)。圖4b示出了顯示對腫瘤病例號201的CD20側(cè)群的聚類樹。圖4c-g示出了通過乳腺癌亞型HER2+細胞亞群反映以下這些細胞的潛在的異質(zhì)性：示出了病例號359(c)、254(d)、210(e)、199(f)和201(g)。圖4h-i示出了聚類樹，所述聚類樹示出了HER2+(病例號294；h)和管腔HER2+樣品(病例號276；i)的細胞亞群。顏色表示指示的標志物的表達水平，并且結(jié)節(jié)的尺寸對應(yīng)來自給定患者的落在細胞聚類內(nèi)的細胞的百分比。

SPADE樹反映表達波形蛋白的基質(zhì)細胞亞群、表達寬范圍的標志物的上皮腫瘤細胞亞群、和CD20+免疫細胞(圖4a和b)。HER2(圖4a、c–i)、波形蛋白、PR、ER、β-連環(huán)蛋白、碳酸酐酶(CAH)IX、E-鈣粘蛋白、c-MYC和其他的水平變化相當大(圖4a)。甚至在同一腫瘤內(nèi)，可見表達的明顯差異，特別對于細胞角蛋白8/18、細胞角蛋白7、HER2和E-鈣粘蛋白染色(圖2)。當分支被用于患者分類的標志物驅(qū)動時，鑒定的細胞亞群還部分地反映預(yù)期的乳腺癌亞型：例如，HER2+和管腔HER2+(圖4e、f、h、i)。

SPADE分析部分地反映了腫瘤亞型，如圖4中可見的。然而，這不減損SPADE工具對于高維度單細胞數(shù)據(jù)的強大的可視化能力，允許細胞亞群的人工分配并且因此描繪如以上示出的乳腺癌細胞亞群的圖。

七個樣品被分類為HER2+或管腔HER2+。這些樣品構(gòu)成SPADE樹中的HER2陽性分支，但還存在在細胞角蛋白8/18、E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白和c-MYC的表達中不同的獨特亞群(圖4a)。例如，管腔HER2+腫瘤號210(圖4e)，其過量表達c-MYC。在同一乳腺癌亞型內(nèi)的這些差異指示患者間的腫瘤異質(zhì)性(圖4e、f、h、i)。

執(zhí)行本發(fā)明的這些模式證實，質(zhì)譜細胞術(shù)使細胞類型標志物、癌癥的信號傳導活性和標志諸如缺氧的同時成像成為可能?？傊?，這些分析描繪在分析的FFPE樣品中存在的乳腺癌細胞亞群，鑒定了它們的空間排列，并且揭示了在同一患者內(nèi)和患有同一腫瘤分類的患者之間的差異。

將理解的是，以上僅通過實施例的方式描述了本發(fā)明，并且可作出修改，同時保持在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。

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表1-用于腫瘤病例號23的抗體(圖1和2)

表2-用于腫瘤病例號210的抗體(圖1、2和6)

表3-用于粘附細胞成像的抗體(圖3)

表4-用于組織成像的抗體(TMA1)

表5-用于組織成像的抗體(TMA2)