本發(fā)明一般性涉及結(jié)直腸癌(CRC)和定位腫瘤干細胞病灶及鑒定具有癌癥干細胞(CSC)樣區(qū)和/或具有腫瘤細胞顯著擴大的能力的結(jié)腸腫瘤的方法。

發(fā)明背景

結(jié)腸具有多種簡單和管狀的腺體和分泌粘液的杯狀細胞和吸水細胞的混合物。這些腺體稱為腺體是由于其將粘液分泌入結(jié)腸腔。當這些腺體在基因水平經(jīng)歷多種變化時，其以可預(yù)測的方式進展，即從良性進展為侵襲性、惡性結(jié)腸癌。

眾所周知，遺傳變化的逐步取得可表征CRC中腫瘤進展的發(fā)展。將腺瘤轉(zhuǎn)化至腺癌的事件的順序始于調(diào)節(jié)細胞分裂和細胞凋亡的基因中的多重突變。在一系列的細胞分裂中，突變在細胞中變得越來越普遍，導(dǎo)致異常增生和最終的癌癥。這些突變事件與從增生區(qū)域至腺瘤區(qū)域的離散形態(tài)的過渡相關(guān)，隨后是原位轉(zhuǎn)化和最終的侵襲性癌癥。然而該過程每個階段的遺傳驅(qū)動因子并未得到完全確認。

結(jié)腸組織包含稱為隱窩的特定隔室的層，其包含數(shù)種不同類型的細胞，包括干細胞。低數(shù)目的干細胞存在于這些隱窩的基底處。正常地，這些干細胞產(chǎn)生新的、增殖的細胞，當其轉(zhuǎn)移至隱窩之上并替換較老的細胞凋亡細胞(死細胞)時，其成為分化細胞。正常結(jié)腸中上皮的受調(diào)節(jié)生長由這些定位于隱窩的在休眠和增殖狀態(tài)間交替變化的腸干細胞(ISC)驅(qū)動[1]。Wnt相關(guān)的β-連環(huán)蛋白(CTNNB1)復(fù)合物和通過轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β和PTEN/PIK3CA/AKT通路的信號傳輸?shù)膩喖毎ㄎ恢械囊莆灰扬@示為影響ISC循環(huán)[2,3]。

通過與ISC的類推，已推測癌癥干細胞(CSC)的表型和功能上相似的群體在CRC和其他腫瘤中發(fā)生[4,5]。然而，如概念性Vogelgram所表示的，CRC中的腫瘤進展更頻繁地模式化為：從增生型的粘膜變化至腺瘤區(qū)域至原位惡性轉(zhuǎn)化和最終的侵襲性癌癥的逐步形態(tài)學(xué)可觀察的過渡[6,7]。遺傳變化的逐步獲得還表征CRC的發(fā)展，且在該模型中，增加的增殖速率和遺傳不穩(wěn)定性導(dǎo)致逐漸更多的異常調(diào)節(jié)和非生長因子依賴性生長。

至今，CSC模型背后的增殖和休眠的不連續(xù)模型如何能容易地與由Vogelgram表示的遞增演化模型相協(xié)調(diào)，這仍然是個問題[8]。此外，Vogelgram過程的每個階段的遺傳驅(qū)動因子尚未完全確定且可由于腫瘤異質(zhì)性而混淆。結(jié)直腸腺瘤對比腺癌和癌癥通常由評估在腫瘤和周邊組織中觀察到的多重形態(tài)特征的存在或不存在而加以區(qū)分。例如，具有腺體良性錯位的結(jié)直腸腺瘤通常缺少顯著的架構(gòu)和/或細胞非典型且在上皮巢周圍持續(xù)呈現(xiàn)強IV型膠原蛋白。相比之下，包含侵襲性腺癌的結(jié)直腸腺瘤通常呈現(xiàn)顯著的架構(gòu)和/或細胞非典型和弱的、非連續(xù)的IV型膠原蛋白。然而，用于區(qū)分這些生長類型的方法是多層面的且具有挑戰(zhàn)性。

相應(yīng)地，對容易地評估的結(jié)腸腫瘤中關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生過渡的生物標記物進行鑒定是有益的，如在CRC中存在的那些。額外地鑒定發(fā)生侵襲性CRC的指征的能力將是理想的。

發(fā)明概述

本文提供了用于在結(jié)腸腫瘤中鑒定癌癥干細胞(CSC)樣區(qū)的方法，其包括測定結(jié)腸腫瘤樣品的PTEN表達和檢測結(jié)腸腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式(alternating spatial pattern)。依據(jù)所述方法，PTEN表達的交替空間模式的存在對CSC樣區(qū)的存在是指示性的。

公開了用于在結(jié)腸腫瘤中鑒定腺瘤-腺癌(Ad-ACA)過渡區(qū)和用于鑒定包含高度腺瘤和早期腺癌區(qū)的結(jié)腸腫瘤的方法。這些方法包括測定結(jié)腸腫瘤樣品的PTEN表達和檢測所述結(jié)腸腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式。PTEN表達的交替空間模式的存在表明所述腫瘤中的高度腺瘤和早期腺癌區(qū)并進一步鑒定所述腫瘤中的腺瘤-腺癌(Ad-ACA)過渡區(qū)。

還提供了在結(jié)腸腫瘤(如存在于CRC中的)中鑒定CSCS的方法，其包括測定結(jié)腸腫瘤樣品的PTEN表達和檢測所述結(jié)腸腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式。在其中檢測到PTEN表達的交替空間模式的結(jié)腸腫瘤中鑒定CSC，因此表明CSC的存在。在一些實施方案中，將鑒定的CSC進一步從腫瘤組織分離(如從腫瘤組織切片使用例如手動宏觀解剖或激光捕獲顯微切割)。

本發(fā)明進一步提供用于診斷具有高度結(jié)腸腺瘤和/或早期腺癌的受試者的方法，和用于確定受試者中的結(jié)腸腫瘤若不進行治療將經(jīng)歷侵襲性轉(zhuǎn)化的可能性的方法。這些方法包括測定結(jié)腸腫瘤樣品的PTEN表達和檢測所述結(jié)腸腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式。PTEN表達的交替空間模式表明高度結(jié)腸腺瘤和早期腺癌的存在且其還表明所述腫瘤若不進行治療將可能經(jīng)歷侵襲性轉(zhuǎn)化。

在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，PTEN表達通過在所述結(jié)腸腫瘤樣品的組織切片上用特異性結(jié)合PTEN的抗體實施免疫組化來測定，以檢測PTEN蛋白表達。

在一些實施方案中，從具有CRC的受試者中獲得結(jié)腸腫瘤樣品，且所述結(jié)腸腫瘤樣品是結(jié)直腸癌腫瘤樣品。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供的方法進一步包括測定結(jié)腸腫瘤的SMAD4表達，和檢測結(jié)腸腫瘤中SMAD4表達的交替空間模式。測定的SMAD4表達可以是SMAD4蛋白表達且可通過在所述結(jié)腸腫瘤樣品的組織切片上用特異性結(jié)合SMAD4的抗體實施免疫組化來測定。

在一些實施方案中，交替空間的SMAD4表達與交替的PTEN空間表達是負相關(guān)的。

在一些實施方案中，由本發(fā)明提供的方法進一步包括測定結(jié)腸腫瘤的TP53表達，并檢測所述結(jié)腸腫瘤中TP53表達的交替空間模式；和/或測定結(jié)腸腫瘤的CD44表達，并在其中不存在PTEN蛋白表達的區(qū)域中檢測下調(diào)并重新分布至基底上皮邊界的CD44的表達；和/或測定結(jié)腸腫瘤的ALDH1和EZH2表達，并檢測與PTEN蛋白表達平行下調(diào)的這些標記物的表達。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括測定結(jié)腸腫瘤的β-連環(huán)蛋白表達和檢測腫瘤細胞中的β-連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)位。核β-連環(huán)蛋白表達可與PTEN表達相關(guān)。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括測定結(jié)腸腫瘤的下述至少一項：Ki-67表達、MYC表達、MGMT表達和Rel A/p65表達，并檢測所述進一步測定的表達中的區(qū)域變化。

在一些實施方案中，測定的結(jié)腸腫瘤的基因組DNA呈現(xiàn)SMAD4單倍型不足和PTEN單倍型不足的至少一種。

本發(fā)明進一步提供用于鑒定具有結(jié)直腸癌(CRC)的受試者可能積極響應(yīng)于用靶向NF-kB通路的療法的治療的方法，其包括測定來自受試者的CRC腫瘤樣品的PTEN表達和RelA/p65表達，檢測所述腫瘤樣品中的PTEN表達的交替空間模式和RelA/p65表達的交替空間模式，且當檢測到PTEN表達和RelA/p65表達的交替空間模式時將受試者鑒定為可能積極響應(yīng)于用靶向NF-kB通路的療法的治療，由此表明所述受試者可能積極響應(yīng)于用靶向NF-kB通路的療法的治療。

還提供了用于確定具有CRC的受試者會積極響應(yīng)于用靶向TGF-β通路的療法的治療的可能性的方法，其包括測定來自受試者的CRC腫瘤樣品的PTEN表達和SMAD4表達，檢測腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式和SMAD4表達的交替空間模式，且當檢測到所述腫瘤樣品中PTEN表達和SMAD4表達的交替空間模式時，將所述受試者鑒定為可能積極響應(yīng)于用靶向TGF-β通路的療法的治療，由此表明所述受試者可能積極響應(yīng)于用靶向TGF-β通路的療法的治療。

本發(fā)明的另一方面提供用于鑒定具有18q/SMAD4基因組缺失的個體的方法，其包括測定來自個體的結(jié)腸腫瘤樣品的SMAD4表達，檢測所述腫瘤樣品中SMAD4表達的交替空間模式，且當檢測到交替空間的SMAD4表達時確定所述個體具有18q/SMAD4基因組缺失。這方面，所述交替的SMAD4空間表達表明腫瘤的基因組DNA可能具有18q/SMAD4基因組缺失。

本發(fā)明的另一方面提供用于鑒定具有10q/PTEN基因組缺失的個體的方法，其包括測定來自個體的結(jié)腸腫瘤樣品，檢測所述腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式的存在，且當檢測到交替空間PTEN表達時確定所述個體具有10q/PTEN基因缺失。這方面，交替PTEN空間表達表明腫瘤的基因組DNA可能具有10q/PTEN基因組缺失。

在一些實施方案中，測定結(jié)腸腫瘤樣品的表達包括測定所述腫瘤樣品的蛋白表達。測定蛋白表達可包括在所述結(jié)腸腫瘤樣品的組織切片上用特異性與所述測定的蛋白特異性結(jié)合的抗體實施免疫組化。

本發(fā)明的另一方面提供試劑盒，其包含至少一種檢測組織樣品中PTEN表達的試劑。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含檢測選自下組的至少一種蛋白或核酸的表達的試劑：SMAD4、TP53、ALDH1和CD44。在一個實施方案中，所述試劑為特異性與記載的蛋白結(jié)合的抗體且所述試劑盒是包含特異性與PTEN結(jié)合的抗體、特異性與SMAD4結(jié)合的抗體、特異性與TP53結(jié)合的抗體和特異性與CD44結(jié)合的抗體的基礎(chǔ)試劑盒。

在一些實施方案中，試劑盒進一步包含選自下組的至少一種抗體：特異性與β-連環(huán)蛋白結(jié)合的抗體、特異性與EZH2結(jié)合的抗體、特異性與MYC級俄和的抗體和特異性與RelA/p65結(jié)合的抗體。

附圖簡述

圖1.腺瘤(Ad)-腺癌(ACA)過渡時Ki-67和PTEN的交替模式。原發(fā)結(jié)腸癌切片的Ki-67免疫組化染色(A/上方小圖)顯示了局限于正常/增生上皮中的隱窩的增殖細胞(左側(cè))、與侵襲性腫瘤的第一區(qū)域相鄰的腺瘤區(qū)中交替的Ki-67+增殖和Ki-67-休眠細胞的延伸(中部)和侵襲性癌的大部的均勻增殖(右側(cè))。(B/下方小圖)來自相同腫瘤的PTEN免疫染色顯示了正常/增生上皮(左側(cè))、大多腺瘤上皮和侵襲性腫瘤中(右側(cè))均勻的PTEN表達。Ad-ACA過渡區(qū)內(nèi)的區(qū)域顯示了開-關(guān)交替的PTEN表達(中部)。

圖2.Ad-ACA過渡區(qū)中增殖的同步調(diào)節(jié)和癌癥干細胞標記物的灶性(focally)表達。另一原發(fā)CRC腫瘤的Ad-ACA過渡區(qū)中的免疫染色顯示腺體相同部分中PTEN、Ki-67、P53和EZH2的灶性喪失，所述腺體的相同部分顯示了SMAD4和MGMT的上調(diào)。

圖3.具有突出的CSC樣Ad-ACA過渡區(qū)的腫瘤中多重病灶交替增殖和癌癥干細胞標記物表達(A-D)。鄰近的腺瘤上皮具有PTEN丟失和減少的Ki-67的突出多重病灶區(qū)、具有β-連環(huán)蛋白的核定位和CD44的降低水平及基底膜轉(zhuǎn)位。(E,F)另一腫瘤中的Ad-ACA過渡顯示了具有EZH2丟失和ALDH1表達的腺瘤上皮的多重病灶延伸。

圖4.PTEN缺失與具有突出的CSC樣過渡區(qū)的腫瘤高度相關(guān)。(A)與具有均勻的PTEN下調(diào)或正常表達的那些(白色和黃色背景)相比，寡核苷酸/SNP陣列結(jié)果顯示具有突出的CSC樣過渡的CRC中染色體10(黑色虛線箭頭)上PTEN基因座的頻繁缺失(紅線)/通過IHC表示的交替的PTEN丟失(藍色背景)和完全的PTEN丟失(粉色背景)。涵蓋有TP53的染色體17的p臂缺失(中部)和染色體18缺失(右側(cè))的情況常見于CRC中，無論PTEN IHC的模式如何。(B)CSC樣過渡中PTEN IHC的高度放大(上方)以及系列切片的匹配的PTEN FISH圖像(下方)顯示了上皮細胞中染色體10拷貝數(shù)的異質(zhì)模式與主要的單倍型不足的PTEN丟失一致。

圖5.在CSC樣過渡區(qū)后發(fā)生的結(jié)腸癌中均勻的TP53異常調(diào)節(jié)。P53IHC僅顯示正常上皮和大多數(shù)腺瘤區(qū)域中的單細胞/病灶表達，侵襲前/過渡區(qū)中的交替表達(小圖)和侵襲性腺癌的后期中均勻上調(diào)的P53蛋白表達。該情況與圖1中所述相同。具有突出的CSC樣特征的CRC情形中每種形態(tài)學(xué)過渡的共同特征示于下文。

發(fā)明詳述

定義

如本文使用，短語“交替表達”、“交替空間表達”或“表達的交替空間模式”指蛋白表達或核酸表達的多重病灶區(qū)域性丟失和獲得的空間模式(也描述為空間交替地存在和不存在)。這種交替表達也可以是腺內(nèi)的。在這方面，“交替的PTEN表達”指空間交替的PTEN蛋白的存在和不存在或交替的PTEN核酸的存在和不存在，如在組織切片中所觀察到的(即，和染色的“開/關(guān)”重復(fù)模式)。

與PTEN表達為“負相關(guān)”的“交替的SMAD4表達”指在組織中交替的SMAD4蛋白或核酸表達，其中SMAD4的染色區(qū)域或在組織中的存在對應(yīng)于PTEN不存在的區(qū)域，而組織中SMAD4不存在的區(qū)域?qū)?yīng)于PTEN染色或存在的區(qū)域。

如本文使用的“單倍型不足”意為細胞、組織或生物體中僅存在基因的單功能性拷貝，且其他基因拷貝由于突變失活。

如本文使用的“腺瘤”指從腺體產(chǎn)生或類似于腺體的上皮良性腫瘤，且其通常生長成為器官腔。腺瘤可以是帶蒂的(具有細長莖的小葉頭)或無柄的(廣泛基座)。腺瘤息肉是慢性腺瘤的典型。腺瘤增殖特征為不同程度的細胞異常增生(上皮正常分化的異化或喪失)、具有核深染的不規(guī)則細胞、(假)分層核、核仁、減少的粘液分泌和有絲分裂。架構(gòu)可以是管狀、絨毛狀或管-絨毛狀。基底膜和粘膜肌層是完整的。

“腺癌”是具有腺體來源、腺體特征或兩者的上皮組織的瘤形成且為腺瘤的惡性對應(yīng)物。在本發(fā)明的一些實施方案中，腺癌是未特別說明的腺癌(腺癌NOS)。在一些實施方案中，結(jié)腸腺癌大量表現(xiàn)為團塊，其看起來與周邊組織顏色不同且腫瘤細胞具有大核并帶有突出的核仁。腺癌腫瘤細胞可呈現(xiàn)出有絲分裂發(fā)生率的顯著增加。

如本文所述的“腺瘤-腺癌交界”(也稱為腺瘤-腺癌過渡)指在結(jié)腸腫瘤中與侵襲性癌相鄰的腺瘤上皮區(qū)。

如本文使用的“結(jié)腸腫瘤”指結(jié)腸中組織的異常腫塊，其由細胞的異常生長和分裂導(dǎo)致且包括位于結(jié)腸中的良性、惡性前和惡性腫瘤。CRC腫瘤是結(jié)腸腫瘤的一種類型。腫瘤細胞的生長超過其周圍的正常組織且與周圍的正常組織不協(xié)調(diào)。在一些實施方案中，結(jié)腸腫瘤包括結(jié)腸上皮細胞。

如本文使用的“癌癥干細胞(CSC)樣區(qū)”或“癌癥干細胞(CSC)樣腺瘤-腺癌(Ad-ACA)過渡”指Ad-ACA交界區(qū)，其在更均勻的侵襲性CRC克隆出現(xiàn)前呈現(xiàn)高度的遺傳穩(wěn)定性和高度的基因組復(fù)雜性。該區(qū)進一步呈現(xiàn)CSC標記物如β-連環(huán)蛋白和/或MGMT的區(qū)域變化且可呈現(xiàn)基底重分布的CD44。因此該區(qū)的存在表明與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的先導(dǎo)結(jié)腸病變的存在和腺瘤-癌過渡的存在。

如本文使用的術(shù)語"抗體"或"多種抗體"指全部類型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE?？贵w可以是單克隆或多克隆的且可以是任何物種來源，包括例如小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊或人，或可以是嵌合或人源化的抗體。參見例如Walker等人，Molec.Immunol.26:403-11(1989)?？贵w可以是根據(jù)美國專利號4,474,893或美國專利號4,816,567中公開的方法產(chǎn)生的重組單克隆抗體。所述抗體還可以根據(jù)美國專利號4,676,980公開的方法化學(xué)構(gòu)建。所述抗體還可以是單鏈抗體或雙特異性抗體。

“抗體”包括包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體片段，其包括例如Fab、F(ab')2和Fc片段和從非IgG的抗體獲得的相應(yīng)片段。這種片段可通過已知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，F(xiàn)(ab')2片段可通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生，且Fab片段可通過減少F(ab')2片段的二硫橋生成?？商鎿Q地，可構(gòu)建Fab表達文庫以允許具有合意特異性的單克隆Fab片段的快速和容易的鑒定(Huse等,(1989)Science 254:1275-1281)。

單克隆抗體可在雜交瘤細胞系中根據(jù)Kohler和Milstein,(1975)Nature 265:495-97的技術(shù)產(chǎn)生。例如，可將包含適當抗原的溶液注射入小鼠且充足的時間后，處死小鼠并獲得脾細胞。隨后通常在聚乙二醇存在下通過將脾細胞與骨髓瘤細胞或與淋巴瘤細胞融合將脾細胞永生化以產(chǎn)生雜交瘤細胞。雜交瘤細胞隨后在適當?shù)慕橘|(zhì)中生長，并篩選具有合意的特異性的單克隆的上清。單克隆Fab片段可在細菌細胞如大腸桿菌中通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的重組技術(shù)產(chǎn)生。參見例如W.Huse,(1989)Science 246:1275-81。

抗體還可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的噬菌體展示技術(shù)或通過免疫具有包含感興趣表位的細胞的異源宿主獲得。

如本文使用的術(shù)語"特異性結(jié)合"或"特異性地結(jié)合"指抗體、蛋白或肽與第二化學(xué)物質(zhì)的相互作用時，意為所述相互作用依賴于化學(xué)物質(zhì)上特定結(jié)構(gòu)(例如抗原決定簇或表位)的存在。“特異性結(jié)合”或“特異性針對”特定多肽或特定多肽上的表位的抗體是優(yōu)先與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合的那些(即基本上不與任何其他多肽或多肽表位結(jié)合)。例如，抗體識別并特異性結(jié)合特定的蛋白結(jié)構(gòu)而非一般性地結(jié)合所有蛋白。如果抗體特異性針對表位"A"，則在包含標記的"A"和抗體的反應(yīng)中，含有表位A(或游離的非標記的A)的分子的存在會減少與抗體結(jié)合的標記的A的量。

如本文使用的“原位雜交”(ISH)指雜交方法的一種類型，其使用標記的寡核苷酸探針(互補DNA或RNA鏈)以通過與該靶序列雜交在組織的部分或切片(原位)中定位特異性“靶”DNA或RNA序列。所述探針可在與靶序列雜交前或雜交后直接或間接標記。所述標記是可檢測的標記。

“寡SNP基因組陣列”是一類DNA微陣列，其用于檢測群體內(nèi)的多態(tài)性如單核苷酸多態(tài)性(SNP，其為在DNA中單位點的變化)。寡SNP基因組陣列包括含有固定的核酸靶序列的陣列、一種或多種標記的寡核苷酸探針和記錄并解譯雜交信號的檢測系統(tǒng)。一個示例性的寡-SNP陣列是Genomic Alterations,Postnatal,Oligo-SNP Array(Quest Diagnostics,Madison,New Jersey)。

“分離的”細胞，如分離的CSC，是從其天然存在的組織或生物體中移取的細胞。從組織載玻片或切片分離的CSC已從載玻片或切片分離。盡管分離的細胞可進行純化，但“分離的”不必需細胞是純的，而無其他細胞類型或組織組分。

當獲得或活檢的樣品的量不豐富時，組織樣品是“有限的”。

“PTEN”指磷酸酶和張力蛋白同源物。PTEN基因在染色體10上位于堿基對89,623,194至堿基對89,728,531。示例性的PTEN氨基酸序列為NCBI/Genbank登錄號AAH05821。

“SMAD4”指SMAD家族成員4。SMAD4基因在染色體18上位于堿基對48,556,582至堿基對48,611,411。示例性的SMAD4氨基酸序列為NCBI/Genbank登錄號BAB40977。

“TP53”指腫瘤蛋白p53(也稱為腫瘤抑制因子p53)。TP53基因在染色體17上位于堿基對7,571,719至堿基對7,590,867。示例性的TP53氨基酸序列為NCBI/Genbank登錄號AEX20383。

“CD44”指CD44分子。CD44基因在染色體11上位于堿基對35,160,416至堿基對35,253,948且編碼CD44細胞表面糖蛋白。示例性的CD44氨基酸序列是NCBI/Genbank登錄號ACI46596。

“Ki-67”指細胞增殖抗原Ki-67。Ki-67示例性的氨基酸序列是Genbank登錄號B48666。

“MYC”(也稱為c-Myc)指v-myc禽髓細胞瘤病毒致癌基因同源物(homolog)。MYC基因在染色體8上位于堿基對128,748,314至堿基對128,753,679并編碼多功能核磷蛋白。示例性的MYC氨基酸序列是NCBI/Genbank登錄號AAA59887的氨基酸序列。

“MGMT”指O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。示例性的MGMT氨基酸序列是NCBI/Genbank登錄號NP_002403的氨基酸序列。

“Rel A/p65”指v-rel禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增資病毒致癌基因同源物A(也稱為p65或NF-kB p65亞基)。其由在染色體2上位于堿基對61,108,708至堿基對61,171,409的REL基因編碼。

“AKT”指v-akt鼠類胸腺瘤病毒致癌基因同源物1(也稱為AKT1或PKB)。AKT基因在染色體14上位于堿基對105,235,685至堿基對105,262,079且編碼的AKT蛋白為蛋白激酶。

“TCL1”指T-細胞白血病/淋巴瘤蛋白1A。

“EZH2”指zeste同源物2的增強子。其編碼EZH2酶，所述酶形成稱為多梳抑制復(fù)合物-2的蛋白基團的部分。EZH2基因在染色體7上位于堿基對148,504,463至堿基對148,581,440。示例性的EZH2氨基酸序列是NCBI/Genbank登錄號AAS09975的氨基酸序列。

“β-連環(huán)蛋白”指鈣粘蛋白相關(guān)蛋白β1，88kDa。其由CTNNB1基因編碼，所述基因在染色體3上位于堿基對41,236,400至堿基對41,281,938。

“細胞周期蛋白-D1”也稱為CCND1(基因)。CCND1基因編碼細胞周期蛋白-D1蛋白，所述蛋白屬于高度保守的細胞周期蛋白家族，該家族成員特征是在貫穿細胞周期的蛋白豐度上顯著的周期性。CCND1基因在染色體11上位于堿基對69,455,872至堿基對69,469,241。

“ALDH1”指乙醛脫氫酶1家族。

說明

本文描述了用于鑒定結(jié)腸腫瘤的方法，所述結(jié)腸腫瘤呈現(xiàn)快速空間交替增殖性和低增殖性/休眠的結(jié)腸上皮的明顯不同的區(qū)，其中多種腸干細胞(ISC)/癌癥干細胞(CSC)標記物也平行地受到調(diào)節(jié)。該CSC樣過渡區(qū)在與侵襲性腫瘤區(qū)域相鄰的侵襲前腺瘤上皮中發(fā)生(即腺瘤-腺癌(Ad-ACA)交界)。這與更深入的、侵襲性腺癌(ACA)和鄰近于非腫瘤上皮的腺瘤區(qū)域更均勻的增殖和更勻質(zhì)的表達概貌形成對比。

確定結(jié)腸腫瘤是否是與腺癌或侵襲性癌相反的腺瘤對于決定適當?shù)暮罄m(xù)采用的操作和/或治療過程至關(guān)重要(即與更激烈的方法如例如化療相反的簡單的息肉移除)。

該CSC樣區(qū)在顯著的百分比的具有形態(tài)上完整的Ad-ACA交界的CRC病例中存在。相應(yīng)地，本文公開的是用于其檢測的方法。

不受理論所限，據(jù)信其他CRC情況中的該區(qū)由于侵襲性組分的過度生長而被除去或由于腫瘤的不完整切片而未取樣(且因此而未觀察到)，或由于一些腫瘤的復(fù)雜構(gòu)架而難于可視化。此外，對于任何給定的標記物，由于遺傳突變或基因缺失導(dǎo)致的異常的不存在或過表達可能掩蓋該過渡區(qū)。這對于其中雜合性(LOH)突變或丟失可導(dǎo)致該蛋白表達的均勻的完全喪失的SMAD4是頻繁發(fā)生的。因此，本文公開了用于檢測具有最高敏感性的Ad-ACA過渡區(qū)的標記物組。

在一些情況中，該過渡區(qū)顯示出通過基因組缺失和TGF-β通路的調(diào)節(jié)引起的PTEN的單倍型不足，如通過SMAD表達所檢測的。該過渡區(qū)(其可通過一些腫瘤中的侵襲性組分而過度生長)表現(xiàn)出僅在CRC發(fā)展的特定的臨時空間階段中代表腸干細胞(ISC)樣表型的激活。

檢測方法

相應(yīng)地，本文提供了用于下述的方法：鑒定結(jié)腸腫瘤中CSC樣區(qū)、鑒定CRC腫瘤中的腺瘤-腺癌(Ad-ACA)過渡區(qū)、鑒定包含高度腺瘤和/或早期腺癌區(qū)的結(jié)腸腫瘤、鑒定結(jié)腸腫瘤如CRC腫瘤中的CSC、診斷具有高度結(jié)腸腺瘤和/或早期腺癌的受試者，和確定受試者中的結(jié)腸腫瘤若不進行治療將經(jīng)歷侵襲性轉(zhuǎn)化的可能性，所述方法包括測定結(jié)腸的PTEN表達和檢測所述腫瘤樣品中PTEN表達的交替空間模式。

在一些實施方案中，所述方法包括測定結(jié)腸或CRC腫瘤樣品的PTEN蛋白表達和檢測所述腫瘤樣品中PTEN蛋白表達的交替空間模式。表達的交替空間模式確立CSC樣區(qū)在腫瘤組織中Ad-ACA交界處的位置。

空間交替PTEN表達可與癌癥干細胞/祖細胞標記物的相似交替空間表達相關(guān)，如例如β-連環(huán)蛋白/CTNNB1、ALDH1和/或CD44。此外，在一些具有保留的形態(tài)過渡的實例中，交替的PTEN表達在位于與侵襲性腫瘤組分緊鄰的腺瘤上皮區(qū)中觀察到，且與交替的Ki-67表達的腺內(nèi)延伸以及其他細胞循環(huán)調(diào)節(jié)因子和生長調(diào)節(jié)因子如SMAD4的表達相關(guān)。相應(yīng)地，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括測定至少一、二、三、四種或全部這些蛋白的表達且任選地檢測至少一、二、三、四或全部這些蛋白的交替空間表達。

本發(fā)明的發(fā)明人已鑒定了PTEN-單倍型不足的CRC的不同的CSC樣侵襲前過渡階段，其隨后出現(xiàn)具有異常調(diào)節(jié)的TP53和更穩(wěn)定的增殖模式及表達概貌的一種或數(shù)種侵襲性腫瘤克隆。相應(yīng)地，本發(fā)明的一些實施方案進一步包括測定SMAD4和TP53的至少一種并檢測其在腫瘤樣品中的交替空間表達。在一些實施方案中，還測定了ALDH1、EZH2、Ki-67、MYC和RelA/p65的一種或多種的蛋白表達且發(fā)現(xiàn)其在腫瘤樣品中呈現(xiàn)可替換的空間表達。還可測定CD44且可檢測下調(diào)并重新分布至基底上皮邊界(其處于PTEN蛋白表達不存在的區(qū)域中)的CD44蛋白表達。

在一些實施方案中，當鑒定Ad-ACA形態(tài)學(xué)過渡特別是在組織樣品有限的情況中，測定一種或多種上述蛋白標記物(如例如PTEN和SMAD4)以補充形態(tài)學(xué)檢查。

本發(fā)明的另一方面提供鑒定具有10q/PTEN基因組丟失的個體的方法，其包括測定來自個體的結(jié)直腸癌腫瘤樣品，檢測腫瘤樣品中PTEN蛋白表達的交替空間模式，且當檢測到交替空間的PTEN蛋白表達時確定個體具有10q/PTEN基因組丟失。

本發(fā)明的另一方面提供鑒定具有18q/SMAD4基因組丟失的個體的方法，其包括測定來自個體的結(jié)腸或結(jié)直腸癌腫瘤樣品，檢測腫瘤樣品中SMAD4蛋白表達的交替空間模式，且當檢測到交替空間的SMAD4蛋白表達時確定所述個體具有18q/SMAD4基因組丟失。

本發(fā)明的另一方面提供用于鑒定具有CRC的受試者可能積極響應(yīng)于用靶向TGF-β的療法或靶向NF-kB通路的療法的治療的方法，所述方法通過分別測定結(jié)腸腫瘤樣品或CRC腫瘤樣品中的PTEN和SMAD4或PTEN和p65/RelA并檢測其交替空間表達而進行?！胺e極響應(yīng)”于治療意為至少一種CRC可檢測的指征在治療后至少部分減少。

樣品

本發(fā)明的方法可在結(jié)腸組織樣品上實施，所述樣品如例如結(jié)腸腫瘤樣品、結(jié)腸息肉、CRC腫瘤活檢或結(jié)腸最內(nèi)部的內(nèi)層(粘膜)的另一樣品。優(yōu)選地，測定一個或多個組織樣品切片。在一些實施方案中，測定腫瘤的連續(xù)切片。

在一些實施方案中，從疑似具有結(jié)腸癌的受試者、需要對結(jié)腸癌進行診斷或需要對結(jié)腸腫瘤分期的受試者和/或正在接受結(jié)腸鏡的受試者獲得腫瘤樣品。受試者可以是測試為結(jié)腸息肉陽性的和/或可具有結(jié)直腸癌。

在具體的實施方案中，從人受試者獲得結(jié)腸活檢并根據(jù)本發(fā)明的方法分析。當如本文所公開的來檢測PTEN和/或其他蛋白的交替空間表達時，可確定需要進一步的活檢或探查程序(如例如手術(shù))用于精確診斷或去除未完全切除的息肉的基座或結(jié)腸的其他病變。

測定方法

在一些實施方案中，在本文公開的方法中實施的測定包括通過免疫染色來檢測組織切片上的蛋白(如例如PTEN)。在一些實施方案中，測定包括在組織切片上用特異性結(jié)合感興趣的蛋白(如例如PTEN)的抗體實施免疫組化(IHC)。抗體可以帶有可檢測標記或其可與帶有可檢測標記的化合物結(jié)合。可測定以確定其交替空間表達的存在或不存在的蛋白包括一種或多種選自下組的蛋白：ALDH1、b-連環(huán)蛋白、CD44、EZH2、c-Myc、細胞周期蛋白-D1、EZH2、MGMT、p53、PTEN、p-SMAD1/5/8和SMAD4。

免疫組化方案為本領(lǐng)域熟知?？捎闷渌椒▉頇z測抗體與蛋白直接或間接的特異性免疫性結(jié)合。據(jù)此，抗體-對-蛋白的配對體應(yīng)理解為包括針對待分析蛋白的一抗(例如PTEN或SMAD4)或針對所述一抗的二抗。根據(jù)本發(fā)明的適當?shù)臋z測方法的優(yōu)選實例為冷光，特別是熒光，還有VIS顯色和/或放射性發(fā)射。

冷光涉及化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或光致發(fā)光導(dǎo)致的光的發(fā)射?；瘜W(xué)發(fā)光涉及化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的可見光的發(fā)射，而生物發(fā)光需要熒光素酶的活性。現(xiàn)有的優(yōu)選光致發(fā)光也稱為熒光刺激，其由光子吸收引起，優(yōu)選通過輻射提供，其再次作為具有30-50nm波長躍遷的光子并在約10^-8秒的時期內(nèi)釋放。用于熒光檢測的儀器包括但不限于常規(guī)的臺式熒光計、熒光多孔板讀取器、光纖熒光計、熒光顯微鏡和與熒光檢測偶聯(lián)的芯片/微流體系統(tǒng)。

VIS顯色指對任何無色物質(zhì)的可視化，使其對裸眼可見。優(yōu)選地，顯色的強度通過光度計測量。

同位素放射性輻射通過閃爍測量。液體閃爍的過程涉及在樣品內(nèi)對β衰變的檢測，所述檢測經(jīng)由稱為閃爍雞尾酒的有機溶劑和溶質(zhì)系統(tǒng)中的β發(fā)射的捕獲而進行。樣品中的放射性同位素如³H、¹⁴C、³²P、³³P和³⁵S發(fā)射的β衰變電子激發(fā)溶劑分子，其轉(zhuǎn)而將能量轉(zhuǎn)移至溶質(zhì)。溶質(zhì)的能量發(fā)射(光子)通過閃爍計數(shù)器內(nèi)的光電倍增管轉(zhuǎn)換為電子信號。雞尾酒必須還作為保持樣品均勻懸浮的增溶劑發(fā)揮作用。γ射線光子經(jīng)常由其他衰變過程(系列衰變)引起，以排除新形成的過剩能量的核。其不具有質(zhì)量且沿其途徑通過碰撞產(chǎn)生極少的直接電離(如果有的話)。吸收γ光子用于檢測并通過下述三種機制的一種或多種將其量化：康普頓效應(yīng)，光電效應(yīng)和配對生產(chǎn)。本發(fā)明有利的γ衰變同位素是¹²⁵I。

直接的標記物包括附著至抗體的熒光或冷光標簽、金屬、染料、放射性核素等。可使用由碘-125(¹²⁵I)標記的抗體。使用特異性針對蛋白的化學(xué)發(fā)光抗體的化學(xué)發(fā)光測定適于蛋白水平的敏感、非放射性檢測。用熒光團標記的抗體也是適當?shù)摹晒鈭F的實例包括但不限于DAPI、熒光素、Hoechst 33258、R-藻藍蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、Texas紅和麗絲胺(lissamine)。

間接標記物包括本領(lǐng)域熟知的多種酶，如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿素酶等?？拐纤乜贵w與酶的共價連接可通過不同的方法實施，如用戊二醛偶聯(lián)。酶和抗體都與戊二醛經(jīng)由游離的氨基互相連接，且去除了交織的(networked)酶和抗體的副產(chǎn)物。在另一方法中，如果其為糖蛋白如過氧化物酶，則酶與抗體經(jīng)由糖殘基偶聯(lián)。酶通過高碘酸鈉氧化并直接與抗體的氨基交聯(lián)。包含糖的其他酶也可以該方式與抗體偶聯(lián)。酶偶聯(lián)還可通過將抗體的氨基與酶如β偶半乳糖苷酶的游離巰基使用異雙功能接頭如琥珀酰亞胺6-(N-馬來酰亞氨基)己酸交聯(lián)實施。可使用辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)，例如與發(fā)色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)一起使用，其在過氧化氫存在下產(chǎn)生在450nm可檢測的可溶性產(chǎn)物。堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)可與例如發(fā)色底物磷酸對硝基苯酯一起使用，其產(chǎn)生在405nm可容易檢測的可溶性產(chǎn)物。相似地，β-半乳糖苷酶檢測系統(tǒng)可與發(fā)色底物鄰硝基苯基β-D-吡喃半乳糖氧化(ONPG)一起使用，其產(chǎn)生在410nm可檢測的可溶性產(chǎn)物。尿素酶檢測系統(tǒng)可與底物一起使用，如尿素溴甲酚紫。

用于在組織切片中檢測蛋白的抗體可用可檢測的部分來標記，其包括但不限于放射性核素、熒光染料例如熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、OregonGreen^TM、羅丹明、Texas紅、叔羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)、Cy3、Cy5等、熒光標記物(例如綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關(guān)蛋白酶活化的自動淬滅熒光化合物、酶(例如螢光素酶、HRP、AP等)、納米顆粒、生物素、地高辛等。

在本文提供的方法的測定步驟中一種或多種蛋白標記物可單獨或以組合(包括作為雙重IHC、三重IHC等)使用。

在一些實施方案中，標記物表達的分析通過熒光原位雜交(FISH)或寡-SNP基因組陣列完成。

在組織切片上檢測標記物蛋白或核酸表達的其他方法為本領(lǐng)域熟知且可用于評估在結(jié)腸組織中公開的標記物的交替空間表達。

試劑盒

本發(fā)明進一步提供用于鑒定結(jié)腸組織樣品中腺瘤-腺癌過渡區(qū)和/或CSC樣區(qū)(如CRC腫瘤)的試劑盒，其包括檢測感興趣的標記物蛋白的一種或多種試劑。

如本文使用的，“試劑盒”指包裝的組分集合，如例如分離的寡核苷酸引物、探針和/或分離的抗體和其他相關(guān)試劑。可將試劑盒組分包裝于其中的材料的非限制性實例包括盒、袋、信封和管，但試劑盒組分可以其他類型的包裝提供給消費者。在一些實施方案中，包含在試劑盒中的其他試劑在試劑盒內(nèi)的管、小瓶或其他類型的容器中提供。

在一些實施方案中，試劑盒進一步包括用于使用試劑盒組分的說明。所述說明可打印在試劑盒內(nèi)的材料上或在試劑盒包裝上或以電子形式提供。在一些實施方案中，說明描述如何檢測表達，例如如何使用包含在試劑盒內(nèi)的特定組分(例如引物、探針、抗體和/或其他試劑)來檢測表達。

在一些實施方案中，試劑盒包含一種或多種檢測PTEN蛋白的試劑，和一種或多種檢測SMAD4蛋白的試劑。

在一些實施方案中，試劑盒進一步包含一種或多種檢測TP53的試劑和/或一種或多種檢測CD44的試劑。

在進一步的實施方案中，擴展的試劑盒可額外地包含一種或多種檢測至少一種選自下組的標記物的試劑：β連環(huán)蛋白、ALDH1、EZH2、MYC和RelA/p65。

在一些實施方案中，試劑特異性檢測具體的標記物蛋白。在一些實施方案中，試劑特異性地檢測編碼具體標記物蛋白的核酸。在一些實施方案中，特異性檢測具體蛋白的試劑包括特異性結(jié)合該蛋白的抗體。一些試劑盒包含檢測一抗的二抗。在一些實施方案中，試劑盒中的抗體包含可檢測的標記物或所述抗體直接或間接與含有可檢測標記物的化合物結(jié)合。

實施例

實施例1-結(jié)直腸癌的基因組進展過程中PTEN的下調(diào)、檢測和再表達

背景/方法：CRC中一般的遺傳變化是AKT調(diào)節(jié)因子PTEN的沉默。然而，發(fā)生不同水平的PTEN表明更加復(fù)雜的階段特異性調(diào)節(jié)。使用免疫組化(IHC)在原發(fā)腺癌(ACA)的FFPE切片上研究CRC的PTEN(6H2.1)和TP53(BP53-11)，并使用CL PTEN/GRID1探針對PTEN實施FISH。在FFPE提取的DNA上使用CytoScan HD 2.6陣列實施寡SNP陣列(OSA)。

表1

[表1]在結(jié)直腸癌中的PTEN發(fā)現(xiàn)

結(jié)果:在原發(fā)CRC中存在4種PTEN表達(表1)。最通常的是在腺瘤區(qū)(AD)中完整的PTEN表達和均勻減少的表達(相比非腫瘤上皮)，伴隨在ACA中逐步衰減的(dimmer)表達。具有PTEN完全丟失的情況不常見且受限于具有最小AD/無AD的ACA。不同的異質(zhì)(het)組顯示PTEN的變化限于ACA中具有PTEN再表達的AD-ACA交界。

通過FISH測得的PTEN基因組缺失在丟失和het組更常見而在完整或下調(diào)的情況中是罕見的。

通過OSA，het PTEN的情況大多在遺傳上是復(fù)雜的，而PTEN基因組缺失(12/18,67％)與18q21/SMAD4(11/18,61％)和17p13/TP53丟失(8/18,44％)相關(guān)。當PTEN蛋白在ACA區(qū)中再表達4/5(80％)時，在宏觀分離的het樣品上實施的OSA證明PTEN基因組丟失的逆轉(zhuǎn)；TP53表達也異常調(diào)節(jié)。

結(jié)論：在絕大多數(shù)原發(fā)CRC中，未觀察到PTEN調(diào)節(jié)或PTEN調(diào)節(jié)顯示在腺瘤階段下調(diào)而無基因組缺失。在該組中，PTEN水平經(jīng)常隨腺瘤-癌過渡而減少，表明逐步的表觀遺傳沉默。PTEN表達的急劇丟失是不常見的，其與PTEN的缺失相關(guān)且處于缺乏Ad-ACA過渡的腫瘤中。在不同的PTEN-het情況中，水平僅在Ad-ACA過渡處波動且再表達隨腫瘤進展發(fā)生，經(jīng)常與TP53的異常調(diào)節(jié)相關(guān)。

實施例2-顯示干細胞和增殖標記物的高度不連續(xù)或快速交替水平的過渡區(qū)表征結(jié)直腸癌的進展

背景:基因變化的逐步取得表征CRC的進展。這些突變事件與離散的形態(tài)學(xué)過渡相關(guān)，所述形態(tài)學(xué)過渡是從增生至腺瘤區(qū)，隨后是原位轉(zhuǎn)化且最終為侵襲性癌。本研究的目的是鑒定CRC中核心形態(tài)學(xué)過渡的容易評估的生物標記物。

方法:

病例選擇和免疫組化：

病例包括提交至Quest Diagnostics Nichols Institute用于分子或免疫分型的原發(fā)CRC病例。使用的材料為過量/丟棄的福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)組織切片，其具有研究招入前已匿名的樣品，不保留鑒定患者的信息。招入的病例是具有充足FFPE組織切片的原發(fā)結(jié)腸腫瘤的隨機選擇。在每個病例中記錄從正常至增生粘膜、增生至腺瘤變化(Ad)和腺瘤變化至原位和侵襲性腺癌(ACA)的形態(tài)學(xué)過渡的位置或不存在。

使用Bond Max III(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany),Ultra Benchmark(Ventana,Tucson,AZ)和Link(Dako,Carpinteria,CA)自動化染色平臺在4微米FFPE切片上實施免疫組化，其中對于Leica(Epitope Retrieval Solution 2,pH 9.0緩沖劑)和Ventana(Cell Conditioner 1,pH 9.0緩沖劑)在儀器上實施表位檢索而對于Dako平臺(TRS,pH 9.0緩沖劑持續(xù)40分鐘)進行離線實施?？贵w克隆的列表和工作稀釋度列于表2。在應(yīng)用抗體前對全部載玻片施以過氧化物酶封閉。一抗溫育在室溫持續(xù)12-32分鐘，使用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)檢測(DAB，對于Leica包括Bond Polymer Refine，對于Ventana為UltraView DAB且對于Dako為Envision)。載玻片用蘇木精復(fù)染并用藍色染劑(bluing)進行后復(fù)染。

表2-用于免疫組化的抗體

抗體記載

免疫染色由作者中的兩位(KA,DJ)半定量評分，其中使用Aperio XT載玻片掃描儀捕獲圖像以評估亞細胞染色定位。對于Ki-67，記錄具有強核陽性的細胞的類型和數(shù)目；PTEN染色評分為：腫瘤中均勻/正常、相比鄰近的正常直腸在腫瘤中下調(diào)、在腫瘤的全部或部分中的完全/區(qū)域性丟失和具有多灶性振蕩(其具有與具有正常模式的腫瘤細胞并列的丟失區(qū)域)(表3)。對于其他標記物包括ALDH1、β-連環(huán)蛋白、CD44、細胞周期蛋白D1、EZH2、MGMT P53、p-SMAD(1/5/8)和SMAD4，針對貫穿腫瘤的水平相對非腫瘤上皮和/或混合淋巴細胞的水平以及亞細胞定位(核、細胞質(zhì)、膜或組合)評估染色。

表3原發(fā)CRC中PTEN免疫組化表達的模式

^#p＜0.0001，具有保存的Ad-ACA的病例中更低(Fisher精確概率)

^*p＜0.0001，具有保存的Ad-ACA的病例中更高(Fisher精確概率)

熒光原位雜交：

包含4-μm FFPE切片的載玻片在56℃烘烤過夜，隨后脫蠟并使用二甲苯和乙醇脫水。在添加FISH探針前使用0.2N HCl、福爾馬林、處理前洗滌和蛋白酶處理載玻片。樣品隨后在72℃變性5分鐘并允許在設(shè)置至37℃的濕度箱中雜交過夜(14-18小時)。載玻片使用Metasystems CL PTEN/GRID1,3-色檢測探針(MetaSystems,D-5971-100-TC)探測。PTEN基因座特異性探針以橙色標記于染色體條帶10q23.3上的315kb區(qū)。雞尾酒中的其他探針包括以綠色標記的針對位于染色體條帶10q23.2的GRID1的基因座特異性探針，和以藍色標記的針對著絲?？刂茀^(qū)(10p11.1-q11.1)的探針。

為建立用于評分的正常截留值，為10個病例計數(shù)100個腫瘤細胞，其中計數(shù)正常的結(jié)腸上皮。如果大于10％的細胞具有單拷貝喪失，則將載玻片分類為雜合缺失，如果大于10％的細胞具有雙等位基因丟失則為純合缺失，且如果少于10％的細胞具有缺失則為正常。通過比較在PTEN/GRID1探針上兩個對照區(qū)的PTEN信號數(shù)評估載玻片(即2R2G2B用于正常、R2G2B用于單倍丟失且2G2B用于雙等位基因丟失)。使用上述標準對載玻片計分，聯(lián)合標記的IHC載玻片以鑒定具有PTEN表達丟失的區(qū)。

寡核苷酸/SNP陣列(OSA):

在宏觀解剖FFPE腫瘤切片后，使用QiaAmp DNA FFPE組織試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)提取基因組DNA，并依照制造商的說明使用CytoScan HD 2.6百萬探針微陣列平臺(Affymetrix,Santa Clara,CA)評估。用限制酶Nsp I消化至多1μg DNA，與配體連接，并用PCR擴增。隨后使用磁性分離技術(shù)純化產(chǎn)物、片段化、并在與微陣列雜交前標記。在PCR純化步驟評估樣品質(zhì)量。在5個病例中，將具有突出的CSC樣Ad-ACA過渡區(qū)的樣品宏觀解剖并獨立于更深入的侵襲性ACA進行分析。

使用Chromosome Analysis Suite(ChAS)軟件(Affymetrix)分析結(jié)果。為比較CSC樣病例與具有完整PTEN的病例的IHC模式的頻率和通過OSA的異?；蜃?，使用Fisher精確測試(Fisher’s exact test)生成p值。

突變分析：

在提取自FFPE切片中宏觀解剖的腫瘤的基因組DNA上通過基于PCR的DNA Sanger測序?qū)嵤〤TNNB1的外顯子3熱點和BRAF的外顯子11和15的突變分析(具有約10-15％突變等位基因的敏感性)，而對于PIK3CA(外顯子9和20中的熱點)和KRAS(密碼子12、13和61)通過焦磷酸測序(具有約2-5％的敏感性)來進行所述突變分析。在具有突出的CSC樣過渡區(qū)的11個病例中，使用Ampliseq癌癥陣列(Life Technologies,Carlsbad,CA)對34個癌癥相關(guān)基因(其額外包括PTEN、SMAD4和TP53)中的突變熱點實施測序。方案為在IonPGM平臺上實施的DNA測序的每個制造商的說明且使用SequencePilot軟件(JSI MedSystems,Germany)來分析數(shù)據(jù)。

結(jié)果:

增殖和PTEN和SMAD4表達的高度不連續(xù)模式表征結(jié)直腸腫瘤亞組中的腺瘤-腺癌過渡

檢查了原發(fā)CR的C良好定向的FFPE腫瘤切片中貫穿形態(tài)學(xué)過渡的多種增殖標記物的表達模式。在CRC亞組中，在與侵襲性癌(ACA)相鄰的區(qū)域中鑒定了顯示腺瘤上皮(Ad)的Ki-67+增殖性和Ki-67-低增殖性延伸間驚人的腺內(nèi)改變的局部區(qū)。這些不連續(xù)的Ki-67表達區(qū)經(jīng)常在10至數(shù)百腫瘤細胞的延伸上發(fā)生(圖1)。盡管IHC模式驚人改變，Ki-67+和Ki-67延伸很大程度在形態(tài)上彼此難于區(qū)別且在正常/增生上皮過渡或在侵襲性癌中不存在。在檢測的亞組中，在這些Ad-ACA過渡區(qū)中還觀察到了包括細胞周期蛋白D1、MYC和P53的多重細胞周期介導(dǎo)因子的平行不連續(xù)表達(圖2但未顯示)。

生長調(diào)節(jié)因子PTEN還證明蛋白水平的相似和重疊的劇烈腺內(nèi)改變，伴隨高度離散/不連續(xù)的開/關(guān)邊界(圖1B)。這在Ad-ACA交界處的相同區(qū)中發(fā)生，其中PTEN表達與Ki-67陽性相關(guān)(圖2)。該通過PTEN IHC測得的開/關(guān)Ad-ACA過渡區(qū)在研究的全部CRC病例的50/735(6.8％)中是突出的但在具有完整Ad-ACA交界的病例的至少75/202(37.1％)中是灶性存在的(表3)。

該交替模式不同于下調(diào)但均勻表達的PTEN IHC模式仍見于大多數(shù)CRC中，且在ACA的較小亞組中觀察到PTEN的完全丟失模式(表3)。此外，即使在Ad-ACA過渡處具有突出的交替PTEN的病例中，侵襲性ACA總是顯示出在侵襲性區(qū)域中的PTEN的再表達。這種模式的交替PTEN表達在20個沒有相關(guān)侵襲性癌的常規(guī)結(jié)腸腺瘤中未觀察到(未顯示)。具有通過IHC測得的PTEN表達的急劇且不可逆轉(zhuǎn)的丟失的幾乎全部的CRC病例不具有可鑒定的Ad-ACA交界(85/89；95.5％)且還缺乏PTEN表達的上述交替開/關(guān)模式。

在檢查的病例的較小亞組中，SMAD4，一種TGF-β信號傳輸調(diào)節(jié)因子，在這些相同的區(qū)中也顯示開-關(guān)蛋白調(diào)節(jié)(圖2)。連續(xù)切片染色和PTEN-SMAD4雙重免疫染色(未顯示)顯示SMAD+和PTEN+細胞間很大程度上可逆的關(guān)系。通過在這些區(qū)的磷酸化-SMAD1/5/8IHC染色中的核/細胞質(zhì)轉(zhuǎn)變還提示了TGF-β通路信號傳輸?shù)膭討B(tài)交替(未顯示)。

在Ad-ACA過渡處的多重癌癥干細胞標記物和β-連環(huán)蛋白/EZH2復(fù)合物顯示隨PTEN的快速交替

鑒于PTEN/AKT信號傳輸在介導(dǎo)ISC周期循環(huán)中的作用，檢查了CSC標記物[4,9]在這些過渡區(qū)中的水平和亞細胞定位。PTEN-交替增殖/低增殖區(qū)也顯示干細胞標記物ALDH1、EZH2和MGMT表達、CD44的水平和定位和β-連環(huán)蛋白的細胞質(zhì)/膜的轉(zhuǎn)變及核定位的顯著不連續(xù)性(圖2和3)。在具有低-至-不存在的PTEN和Ki-67陽性的細胞延伸中，β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)移至核(圖3A-C)。遠離Ad-ACA過渡區(qū)，β-連環(huán)蛋白在幾乎全部的細胞中完全轉(zhuǎn)位至核或存在于膜/細胞質(zhì)定位中(其中僅疏散的單細胞或小細胞簇具有核定位的蛋白)。在PTEN區(qū)中CD44下調(diào)且重新分布至基底上皮邊界(圖3D)。MGMT在顯示EZH2和ALDH1染色的下調(diào)/不存在的區(qū)中上調(diào)。

交替標記物表達的準確階段在腫瘤的Ad-ACA過渡處是可變的。一般而言，Ki-67+增殖區(qū)顯示PTEN+P53+EZH2低ADLH1-MGMT高SMAD4-的免疫表型(在Ki-67-休眠區(qū)中具有相反的表型)，如圖2中所示。然而，Ad-ACA過渡區(qū)中每個標記物的開/關(guān)邊界的精確重疊是不常見的。更典型地，如圖3中所示，為區(qū)域關(guān)聯(lián)，其表明對于一些標記物的稍不同的下調(diào)或上調(diào)階段。

具有突出的CSC樣過渡區(qū)的CRC與PTEN的單倍型不足高度相關(guān)

在具有突出的CSC樣過渡區(qū)的CRC病例中，通過OSA檢查了整體的基因組發(fā)現(xiàn)(表4)并通過對包括PTEN、SMAD4、TP53和CTNNB1的集合進行測序來檢查了突變發(fā)現(xiàn)。

表4:在原發(fā)CRC中通過OSA的基因組發(fā)現(xiàn)：具有突出的CSC樣過渡的腫瘤與具有完整均勻的PTEN表達的那些的比較

^*使用Fisher精確概率(雙尾)測試計算p值.使用2x2偶然性表:行為改變的基因座或正常的基因座且列為pTEN IHC丟失/CsC組或下調(diào)組.

在具有突出的CSC樣擴增的CRC中，如通過PTEN IHC模式所定義的，通過OSA評估的在10q/PTEN的基因組丟失頻率(10/16；62.5％)比具有完整/非振動PTEN表達的病例中高得多(6.3％(1/16；6.3％,p＝.0007)(圖4A)。在CSC樣的病例中，當通過FISH評估時，PTEN缺失的頻率甚至更高(13/17；76.4％)。使用FISH，還評估了在CSC樣區(qū)內(nèi)的個體細胞中的遺傳互補。在具有快速交替的PTEN和其他標記物的區(qū)中，通過FISH注意到了數(shù)個染色體拷貝數(shù)的變化以及PTEN拷貝數(shù)的變化(圖4B/C)。

通過IHC，CSC樣腫瘤中PTEN缺失的高頻率在這些病例中與顯示完全的PTEN丟失的那些相似。然而，在后者的組中，在病例亞組中通過OSA的10q丟失水平與雙等位基因缺失一致(未顯示)。在全部的組中，可檢測的PTEN突變都是不常見的。

在CSC樣病例到具有其他PTEN表達模式的病例中，chr 18q/SMAD4 12/16(75％)和chr 17p/TP53 9/16(56.3％)的遺傳變化頻率相似(圖4A)。KRAS突變存在于CSC樣病例的83/178(46.7％)中，該頻率并不顯著區(qū)別于其他PTEN表達亞群。在11個具有突出的CSC樣過渡區(qū)的病例亞組中，TP53(3/11,27.3％)、SMAD4(2/11,18.1％)、APC和CTNNB1突變的頻率與未選擇的CRC病例中所預(yù)期的相似。

表達遠離CSC樣區(qū)的侵襲性CRC中P53的表型性轉(zhuǎn)變；在Ad-ACA交界處和侵襲性腫瘤區(qū)室中的表達狀態(tài)

除了在大多腫瘤中顯示更復(fù)雜的可變開/關(guān)表達模式的MGMT之外，所研究的在Ad-ACA過渡區(qū)內(nèi)交替的標記物在其他腫瘤位置均勻表達。如上文所述，在過渡處具有突出的交替PTEN表達的情況總是在侵襲性腫瘤中再表達蛋白；對于ALDH1和EZH2觀察到了相似的模式。然而，SMAD4和CD44表達在侵襲性腫瘤中偶爾完全丟失。然而更驚訝地是P53的表達，在遠離Ad-ACA過渡的侵襲性ACA中存在TP53表達的高比率完全丟失(50％)或均勻獲得(41.7％)(圖5)。在這些腫瘤中，不再觀察到CSC樣過渡區(qū)內(nèi)所見的交替的P53表達。

檢查了CRC的726例中貫穿不同形態(tài)學(xué)過渡區(qū)的生長調(diào)節(jié)因子和干細胞標記物的增殖和表達模式。在具有保存下來的腺瘤-癌形態(tài)學(xué)過渡的病例中，鑒定了經(jīng)常位于緊鄰侵襲性組分并延伸其中的腺瘤上皮的特征區(qū)，其顯示Ki-67+和Ki-67-細胞的快速振蕩腺內(nèi)延伸。該模式與其他細胞周期介導(dǎo)因子和生長調(diào)節(jié)因子PTEN和SMAD4的振蕩表達相關(guān)聯(lián)。腺瘤上皮的這些多重灶性延伸顯示交替的陽性/陰性表達邊界。其還證明了在多重癌癥干細胞(CSC)標記物(包括β-連環(huán)蛋白/CTNNB1、MGMT和CD44)的水平和/或亞細胞定位的相似急劇腺內(nèi)振蕩。

相比之下，大多數(shù)這些標記物的表達水平在過渡區(qū)周圍的近端腺瘤和更深入的侵襲性癌中很大程度上是均質(zhì)性的。該CSC樣過渡區(qū)，如通過PTENIHC檢測，在全部CRC的50/726(6.9％)中是突出的但在具有完整的腺瘤癌交界的97/201(48.2％)病例中至少是灶性存在的。在具有突出的CSC樣擴張的CRC上的基因組陣列(ONCOSCAN^TM HD)和突變分析(AMPLISEQ^TM)證明了在10/16(62.5％)中的復(fù)雜基因組變化，而KRAS、BRAF和CTNNB1突變的頻率與未選擇的CRC病例中所預(yù)期的相似。這些病例中的過渡區(qū)還頻繁地證明了細胞到細胞的不穩(wěn)定基因組(如通過FISH所評估)，其表明在這些區(qū)中的高度遺傳不穩(wěn)定性。

討論/結(jié)論：通過在大量原發(fā)CRC腫瘤中檢查形態(tài)學(xué)過渡區(qū)，發(fā)現(xiàn)了影響多重干細胞和細胞周期的標記物(包括Ki-67、ALDH1、β-連環(huán)蛋白、CD44、EZH2、MGMT、MYC、PTEN、P53和SMAD4)的多重灶性交替休眠/增殖腺瘤上皮的局部CSC樣過渡區(qū)。PTEN-單倍型不足的CRC中的CSC樣侵襲前過渡區(qū)呈現(xiàn)PTEN/AKT、TGF-β/SMAD和Wnt/β-連環(huán)蛋白通路趨同的開-關(guān)調(diào)節(jié)。該瓶頸樣區(qū)之后是具有完整PTEN表達但具有異常調(diào)節(jié)的TP53和均勻的高增殖率的侵襲性腫瘤的出現(xiàn)。該過渡區(qū)在與侵襲性腫瘤區(qū)相鄰的侵襲前腺瘤上皮中集中，且與更深入的ACA和與非腫瘤上皮相鄰的腺瘤區(qū)更均勻的增殖和更均勻的表達概貌形成對比。

盡管如圖3中該CSC樣區(qū)僅在小百分比的CRC中是突出的，其在具有形態(tài)學(xué)完整的Ad-ACA過渡的情況中以顯著的百分比灶性存在，如圖2。這些不連續(xù)的CSC樣區(qū)在許多原發(fā)CRC中的Ad-ACA交界處的存在表明其檢測可作為先兆病變發(fā)揮作用，預(yù)測初期侵襲性轉(zhuǎn)化。廣泛存在的標記物如PTEN和SMAD4可單獨或組合使用(包括作為雙重IHC)以在對有限的組織樣品中的Ad-ACA形態(tài)學(xué)過渡的鑒定中補充形態(tài)學(xué)檢查。

該區(qū)在其他CRC病例中的證據(jù)疑似通過侵襲性組分的過度生長而去除或由于不完全的腫瘤切片而未取樣，或由于一些腫瘤的復(fù)雜結(jié)構(gòu)而難于看到。此外，對于任何給定的標記物，由于基因突變或基因缺失導(dǎo)致的異常不存在或過表達都可掩蓋過渡區(qū)。其在SMAD4中發(fā)生頻繁，其中突變或LOH可導(dǎo)致該蛋白表達的均勻完全丟失。因此，需要標記物的集合以檢測具有最高敏感性的Ad-ACA過渡區(qū)。

多種標記物的開/關(guān)邊界共定位而非完美重疊表明增殖/休眠過渡的調(diào)節(jié)可能在這些區(qū)相當迅速。在一些病例中看到的這些非同步的邊界可能是由于不同的半衰期和每種蛋白的不同下調(diào)機制所致，所述下調(diào)機制包括蛋白水解性裂解、轉(zhuǎn)錄下調(diào)和蛋白體清除[10,11]。雖然如此，Ki-67+/PTEN+/MYC+/TP53+區(qū)與Ki-67-/MGMT+/β-連環(huán)蛋白nuc/SMAD+區(qū)交替是在許多病例中可見的特征性模式。

PTEN缺失/單倍型不足與具有突出CSC樣區(qū)的CRC病例的高度顯著相關(guān)表明PTEN蛋白的較低水平和導(dǎo)致的作為CSC表型的一個觸發(fā)因素的AKT激酶活性的差異調(diào)節(jié)。細胞系和小鼠遺傳模型中的多項研究支持了PTEN的單倍型不足或減少的水平在促進癌癥進展中的作用[12–14]。此外，由于PTEN的變化或其他因素如TCL1振蕩，AKT活性的循環(huán)也是癌癥相關(guān)和非腫瘤干細胞功能及胚胎發(fā)生中的共同發(fā)現(xiàn)[15–18]。然而，在這些CSC樣腫瘤的侵襲性組分中無區(qū)域性改變的PTEN朝正常水平的回復(fù)表明了在Ad-ACA交界處其他通路的協(xié)調(diào)性異常調(diào)節(jié)。

在這方面，在具有總體PTEN IHC丟失的CRC中可檢測的Ad/ACA交界的不存在和CSC樣交替的表型的不存在表明具有完全的PTEN失活的結(jié)腸腫瘤的自然史是不同的[19]。

鑒于在過渡區(qū)中觀察到的交替的標記物模式，TGF-β/SMAD、PI3K/Akt和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳輸通路間的激活和抑制性相互作用是有利的[20]。如此處針對PTEN和SMAD4注意到的AKT和BMP/TGF-β信號間的相互作用，在一些模型中是干細胞表型的特征[21–23]。在多個CSC樣病例中SMAD信號傳輸(如通過磷酸化-SMAD抗體所評估的)和SMAD4表達的調(diào)節(jié)與PTEN相反，可能反映了交界的上皮對BMP/TGF-β信號傳輸?shù)母叨软憫?yīng)性。為幫助驅(qū)動過渡區(qū)的周期性增殖/休眠特征，SMAD激活對Wnt信號傳輸?shù)囊种谱饔肹24,25]可抵抗增加的EZH2對驅(qū)動β-連環(huán)蛋白活性的作用[26]。

在Ad-ACA過渡處的CSC樣表型的另一可能的共調(diào)節(jié)因子是MYC，其也與PTEN、Ki-67和SMAD4平行交替。在細胞系模型中，MYC過表達可通過抑制AKT驅(qū)動PTEN上調(diào)和EZH2下調(diào)[27]。一旦PTEN水平和AKT活性開始振蕩，可能發(fā)生更廣泛的干細胞轉(zhuǎn)錄程序效應(yīng)[28]。PTEN不存在時的AKT活性也已顯示出促進遺傳不穩(wěn)定性，其在CSC樣過度處觀察到且趨于促進遺傳進展[29]。

應(yīng)該注意的是在大多數(shù)具有突出的CSC樣區(qū)的CRC中，如通過均勻的P53IHC丟失或獲得所證實的，TP53異常調(diào)節(jié)在遠離過渡區(qū)的侵襲性腫瘤中發(fā)生。這表明主導(dǎo)的侵襲性CRC克隆的TP53-驅(qū)動性衍生物(outgrowth)經(jīng)常隨后發(fā)生且可能由CSC樣過渡區(qū)內(nèi)的遺傳選擇所驅(qū)動。可能的是這些過渡區(qū)是癌癥生成的侵襲前階段的一般現(xiàn)象，其中AKT和Wnt/Beta-連環(huán)蛋白周期循環(huán)性調(diào)節(jié)。波動的TP53水平和高度調(diào)節(jié)的增殖-休眠過渡表明該區(qū)可能在更均勻的TP53異常調(diào)節(jié)侵襲性亞克隆出現(xiàn)前作為腫瘤瓶頸階段發(fā)揮功能。

使用大量的原發(fā)性CRC腫瘤，顯示出在良好定向的組織切片中，結(jié)腸腫瘤顯示快速交替增殖和低增殖的結(jié)腸上皮的明顯不同的區(qū)，其中多種ISC/CSC標記物也受到平行調(diào)節(jié)。該過渡區(qū)經(jīng)常在與具有更均勻的增殖和更均勻的基因和表達概貌的侵襲性腫瘤區(qū)相鄰的侵襲前腺瘤上皮中開始。該容易評估的表型看起來代表CRC演進中通常發(fā)生的遺傳不穩(wěn)定的先兆或過渡階段。此外，在與腫瘤的侵襲性區(qū)緊鄰的腺瘤過渡中發(fā)生的該區(qū)顯示出經(jīng)基因缺失和TGF-β通路的調(diào)節(jié)的PTEN單倍型不足，如通過SMAD表達所測得的。可能通過一些腫瘤中的侵襲性部分過度生長的該過渡區(qū)看起來僅在CRC進展的特定暫時性空間階段代表ISC樣表型的激活。

多重免疫組化標記物包括PTEN、SMAD4、CD44和CTNNB1，強調(diào)了該局部CSC樣過渡區(qū)。

其他實施方案：因此，應(yīng)該理解的是盡管本發(fā)明已由優(yōu)選的實施方案和其中涵蓋的本發(fā)明任選的特征、修飾、改進和變化進行了具體公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可采取本公開，且這些修飾、改進和變化應(yīng)視為在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本文提供的材料、方法和實施例所代表優(yōu)選的實施方案是示例性的，且并非意在作為對本發(fā)明保護范圍的限制。

本發(fā)明已在本文進行廣泛和一般性地描述。落入上位內(nèi)容的較窄種類和亞群也形成本發(fā)明的一部分。其包括具有限制條件或從種類中去除任何對象的負向限制的本發(fā)明的一般性描述，無論刪去的材料具體記載于本文與否。

此外，當本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組描述時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認可本發(fā)明也由此就任何單獨成員或馬庫什組成員的亞群進行了描述。

本文提及的全部發(fā)表物、專利申請、專利和其他參考文獻通過提述以其整體明確地并入，正如其分別通過提述并入的相同程度一樣。在沖突的情況中，以本說明書(包括定義)為準。

闡述性地描述于本文的本發(fā)明可在不存在任何非本文所具體公開的元素、限制的情況下適當?shù)貙嵺`。因此例如，術(shù)語"包含"、"包括"、"含有"等將擴大性應(yīng)當讀入而不受限制。此外，本文采用的術(shù)語和表述用作說明的術(shù)語而非限制的術(shù)語，且并非意在使用這些術(shù)語和表述來排除任何顯示和描述的特征的任何等同或其部分，但應(yīng)該認可的是在本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)的多種修飾是可能的。

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