本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種中藥組合物制劑的指紋圖譜的建立方法，所述中藥組合物為壯腰健腎丸。
背景技術(shù)：
：中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的質(zhì)量檢測手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價(jià)中藥材以及中藥制劑質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評價(jià)其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)。因此，中藥指紋圖譜的研究和建立，對于提高中藥質(zhì)量，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。中藥組合物指紋圖譜的建立，應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為依托，體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性三個(gè)基本原則。才能保證指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、客觀化，從而便于推廣和應(yīng)用。高效液相色譜法(hplc)具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，樣品中大多數(shù)成分均可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測，是構(gòu)建指紋圖譜的主要方法之一。2010版《中國藥典》收載了中成藥品種共計(jì)1069個(gè)，但是僅收載了高效液相指紋圖譜9項(xiàng)，其中中成藥僅6項(xiàng)?？梢娭谐伤幹讣y圖譜的建立，絕非易事，需要解決眾多的技術(shù)問題，花費(fèi)大量的勞動(dòng)。壯腰健腎丸，由狗脊、雞血藤、黑老虎等九味中藥材組成，具有壯腰健腎，養(yǎng)血，祛風(fēng)濕的作用，用于腎虧腰痛，膝軟無力，小便頻數(shù)，遺精夢泄，風(fēng)濕骨痛，神經(jīng)衰弱。壯腰健腎丸收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第三冊，標(biāo)準(zhǔn)編號：ws3-b-0538-91，標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別、化學(xué)鑒別。顯然，上述藥品標(biāo)準(zhǔn)無法全面表征壯腰健腎丸的化學(xué)特征和質(zhì)量情況。因此，有必要研究如何建立壯腰健腎丸的指紋圖譜，從而更好地保證臨床用 藥的質(zhì)量和治療效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種中藥組合物制劑指紋圖譜的建立方法，其中所述中藥組合物為壯腰健腎丸。本發(fā)明利用hplc-uv技術(shù)，建立了壯腰健腎丸指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了43個(gè)共有峰，其中，確定了5個(gè)峰的化學(xué)成分歸屬：原兒茶酸、原兒茶醛、特女貞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木質(zhì)素。經(jīng)檢測，10批樣品與共有模式之間相似度均大于0.9。以本發(fā)明提供的方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，從而提供了比現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法更深層次和更全面的質(zhì)量評價(jià)依據(jù)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：一種中藥組合物制劑的指紋圖譜建立方法，所述中藥組合物以狗脊、黑老虎、千斤拔、蒸桑寄生、蒸女貞子、雞血藤、金櫻子、牛大力、鹽水制菟絲子為原料，通過本領(lǐng)域常用的方法，與藥學(xué)上可以接受的輔料，制備成臨床上可以接受的制劑；所述指紋圖譜建立方法包括采用高效液相色譜法檢測所述中藥組合物制劑中化合物的保留時(shí)間，其中所述高效液相色譜的條件如下：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；流動(dòng)相由a、b和c相組成，其中a相為乙腈，b相為甲醇，c相為體積百分濃度0.05％～0.1％的磷酸水溶液，流速1ml/min，0～150min按照如下程序進(jìn)行梯度：0～10min，按照體積百分比，a：b：c＝5％：0％：95％勻速地變化為a：b：c＝10％：0％：90％，10～20min，按照體積百分比，a：b：c＝10％：0％：90％，20～65min，按照體積百分比，a：b：c＝10％：0％：90％勻速地變化為a：b：c＝35％：5％：60％，65～70min，按照體積百分比，a：b：c＝35％：5％：60％勻速地變化為a：b：c＝40％：10％：50％，70～95min，按照體積百分比，a：b：c＝40％：10％：50％勻速地變化為a：b：c＝45％：15％：40％，95～130min，按照體積百分比，a：b：c＝45％：15％：40％勻速地變化為a：b：c＝80％：5％：15％，130～150min，按照體積百分比，a：b：c＝80％：5％：15％勻速地變化為a：b：c＝90％：0％：10％；柱溫為20℃～40℃；紫外檢測波長為210～280nm。優(yōu)選的，所述c相為體積濃度0.1％的磷酸水溶液。優(yōu)選的，所述柱溫為30℃。優(yōu)選的，所述檢測波長為230nm。優(yōu)選的，所述指紋圖譜建立方法還包括通過以下方法制備供試品溶液：取所述中藥組合物制劑5g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入極性有機(jī)溶劑20～30ml，超聲提取、冷浸提取或回流提取，濾過，取續(xù)濾液，即得。優(yōu)選的，所述極性有機(jī)溶劑為體積濃度50％～100％的甲醇或體積濃度50％～95％的乙醇；更優(yōu)選的，所述極性有機(jī)溶劑為100％甲醇。優(yōu)選的，提取方式為超聲提取，提取時(shí)間40～50min。更優(yōu)選的，通過如下方法制備所述供試品溶液：取所述中藥組合物制劑5g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲45min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。優(yōu)選的，所述指紋圖譜建立方法還包括通過如下方法制備對照品溶液：分別精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛、特女貞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木質(zhì)素對照品，加甲醇制成濃度為原兒茶酸120μg/ml、原兒茶醛130μg/ml、特女貞苷140μg/ml、日本南五味子素甲40μg/ml和(2′s)-南五味子木質(zhì)素30μg/ml的混合對照品溶液，即得。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明提供所述中藥組合物制劑的指紋圖譜建立方法，具體的操作步驟包括：1)對照品溶液的制備：分別精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛、特女貞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木質(zhì)素對照品，加甲醇制成濃度為原兒茶酸120μg/ml、原兒茶醛130μg/ml、特女貞苷140μg/ml、日本南五味子素甲40μg/ml和(2′s)-南五味子木質(zhì)素30μg/ml的混合對照品溶液，即得；2)供試品溶液的制備：取所述中藥組合物制劑5g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，超聲45min，放冷至室溫，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；3)測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測定，記錄150min內(nèi)的色譜圖，得到指 紋圖譜：色譜柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色譜柱(規(guī)格：250×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：由a、b和c相組成，其中a相為乙腈，b相為甲醇，c相為體積百分濃度0.05％～0.1％的磷酸水溶液，流速1ml/min，0～150min按照如下程序進(jìn)行梯度：0～10min，按照體積百分比，a：b：c＝5％：0％：95％勻速地變化為a：b：c＝10％：0％：90％，10～20min，按照體積百分比，a：b：c＝10％：0％：90％，20～65min，按照體積百分比，a：b：c＝10％：0％：90％勻速地變化為a：b：c＝35％：5％：60％，65～70min，按照體積百分比，a：b：c＝35％：5％：60％勻速地變化為a：b：c＝40％：10％：50％，70～95min，按照體積百分比，a：b：c＝40％：10％：50％勻速地變化為a：b：c＝45％：15％：40％，95～130min，按照體積百分比，a：b：c＝45％：15％：40％勻速地變化為a：b：c＝80％：5％：15％，130～150min，按照體積百分比，a：b：c＝80％：5％：15％勻速地變化為a：b：c＝90％：0％：10％；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：230nm；4)共有峰的標(biāo)定：以原兒茶酸吸收峰為參照峰，共有峰包括原兒茶醛吸收峰、特女貞苷吸收峰、日本南五味子素甲或(2′s)-南五味子木質(zhì)素吸收峰中的一個(gè)或多個(gè)，相對保留時(shí)間為：原兒茶醛吸收峰：1.384±0.04％，特女貞苷吸收峰：3.729±0.07％，日本南五味子素甲吸收峰：7.854±0.06％，(2′s)-南五味子木質(zhì)素吸收峰：10.305±0.06％。優(yōu)選的，上述指紋圖譜建立方法中，所述的中藥組合物制劑的原料由如下重量份的藥材組成：狗脊1876重量份，黑老虎1125重量份，千斤拔450重量份，蒸桑寄生563重量份，蒸女貞子94重量份，雞血藤1125重量份，金櫻子600重量份，牛大力750重量份，鹽水制菟絲子94重量份。還優(yōu)選的，所述中藥組合物為丸劑。更優(yōu)選的，所述中藥組合物為壯腰健腎丸，通過如下方法制備：1)準(zhǔn)備如下重量份的藥材：狗脊1876重量份，黑老虎1125重量份，千斤拔450重量份，蒸桑寄生563重量份，蒸女貞子94重量份，雞血藤1125重量份，金櫻子600重量份，牛大力750重量份，鹽水制菟絲子94重量份；2)狗脊876重量份和黑老虎的木部、以及全部重量份的雞血藤、金櫻子、千斤拔和牛大力加水煎煮二次，第一次4小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏；狗脊1000重量份、黑老虎的皮部和全部重量份的蒸桑寄生、蒸女貞子和鹽水制菟絲子共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混勻，干燥，粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻；每100g粉末用煉蜜50～60g與適量的水泛丸，以藥用活性炭包衣，干燥，拋光，制成濃縮水蜜丸，即得。上述丸劑按照本發(fā)明所述指紋圖譜建立方法建立的指紋圖譜，包括43個(gè)特征峰，以原兒茶酸吸收峰為參照，所述特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積分別為：峰1：相對保留時(shí)間0.341±0.19％，相對峰面積0.1628±21.25％；峰2：相對保留時(shí)間0.565±0.1％，相對峰面積1.0443±20.51％；峰3：相對保留時(shí)間0.719±0.14％，相對峰面積0.0912±36.29％；峰4：相對保留時(shí)間0.750±0.08％，相對峰面積0.1571±40.04％；峰5：相對保留時(shí)間0.841±0.09％，相對峰面積0.1776±25.56％；峰6：相對保留時(shí)間1，相對峰面積1；峰7：相對保留時(shí)間1.167±0.07％，相對峰面積0.1055±13.84％；峰8：相對保留時(shí)間1.278±0.06％，相對峰面積0.1386±16.88％；峰9：相對保留時(shí)間1.384±0.04％，相對峰面積0.5889±9.37％；峰10：相對保留時(shí)間1.895±0.1％，相對峰面積0.1271±23.68％；峰11：相對保留時(shí)間2.145±0.08％，相對峰面積0.0824±22.33％；峰12：相對保留時(shí)間2.920±0.08％，相對峰面積0.0636±18.71％；峰13：相對保留時(shí)間3.382±0.04％，相對峰面積0.098±42.96％；峰14：相對保留時(shí)間3.458±0.03％，相對峰面積0.8493±41.7％；峰15：相對保留時(shí)間3.729±0.07％，相對峰面積0.7333±15.64％；峰16：相對保留時(shí)間3.933±0.03％，相對峰面積0.1746±38.14％；峰17：相對保留時(shí)間3.997±0.05％，相對峰面積0.2380±30.55％；峰18：相對保留時(shí)間4.285±0.05％，相對峰面積0.2705±37.45％；峰19：相對保留時(shí)間4.677±0.04％，相對峰面積0.3391±37.86％；峰20：相對保留時(shí)間4.735±0.04％，相對峰面積0.3952±75.3％；峰21：相對保留時(shí)間4.835±0.04％，相對峰面積0.1043±44.77％；峰22：相對保留時(shí)間5.016±0.04％，相對峰面積0.4085±62.55％；峰23：相對保留時(shí)間5.269±0.04％，相對峰面積0.3366±81.79％；峰24：相對保留時(shí)間6.461±0.04％，相對峰面積0.1103±22.39％；峰25：相對保留時(shí)間7.575±0.07％，相對峰面積0.9041±29.95％；峰26：相對保留時(shí)間7.854±0.06％，相對峰面積0.909±24.99％；峰27：相對保留時(shí)間8.155±0.07％，相對峰面積0.6081±15.7％；峰28：相對保留時(shí)間8.264±0.07％，相對峰面積0.2334±47.51％；峰29：相對保留時(shí)間8.389±0.09％，相對峰面積0.4306±58.1％；峰30：相對保留時(shí)間9.646±0.05％，相對峰面積0.3649±21.13％；峰31：相對保留時(shí)間9.787±0.07％，相對峰面積0.1107±26.47％；峰32：相對保留時(shí)間9.862±0.06％，相對峰面積0.1695±17.05％；峰33：相對保留時(shí)間9.987±0.06％，相對峰面積0.6084±21.68％；峰34：相對保留時(shí)間10.099±0.06％，相對峰面積0.581±21.96％；峰35：相對保留時(shí)間10.176±0.06％，相對峰面積0.8761±27.34％；峰36：相對保留時(shí)間10.305±0.06％，相對峰面積1.304±18.95％；峰37：相對保留時(shí)間11.325±0.04％，相對峰面積0.6154±20.77％；峰38：相對保留時(shí)間11.393±0.05％，相對峰面積0.1246±33.31％；峰39：相對保留時(shí)間11.758±0.05％，相對峰面積0.5035±23.77％；峰40：相對保留時(shí)間11.899±0.06％，相對峰面積0.1423±16.51％；峰41：相對保留時(shí)間12.007±0.06％，相對峰面積0.2552±30.64％；峰42：相對保留時(shí)間12.171±0.07％，相對峰面積0.1463±30.08％；峰43：相對保留時(shí)間12.256±0.06％，相對峰面積0.2524±30.03％。從化學(xué)成分的比對來看，其中峰6是原兒茶酸吸收峰，峰9是原兒茶醛吸收峰，峰15是特女貞苷吸收峰，峰26是日本南五味子素甲吸收峰，峰36是(2′s)-南五味子木質(zhì)素吸收峰。本發(fā)明的另一目的在于提供上述指紋圖譜建立方法在一種中藥組合物制劑的真?zhèn)舞b別和成分檢測中的應(yīng)用；所述中藥組合物的原料組成為狗脊、黑老虎、千斤拔、蒸桑寄生、蒸女貞子、雞血藤、金櫻子、牛大力、鹽水制菟絲子。優(yōu)選的，所述中藥組合物制劑為壯腰健腎丸。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種檢測原料組成為狗脊、黑老虎、千 斤拔、蒸桑寄生、蒸女貞子、雞血藤、金櫻子、牛大力、鹽水制菟絲子的中藥組合物的成分的方法，包括采用上述指紋圖譜建立方法建立的指紋圖譜。優(yōu)選的，所述中藥組合物制劑為壯腰健腎丸。本發(fā)明提供的指紋圖譜建立方法，以高效液相色譜和紫外光譜聯(lián)用為分離和鑒別手段，得到的指紋圖譜具有系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性，具體體現(xiàn)在：1.系統(tǒng)性：所述中藥組合物制劑，優(yōu)選為壯腰健腎丸，原料組成為狗脊、黑老虎、千斤拔、蒸桑寄生、蒸女貞子、雞血藤、金櫻子、牛大力、鹽水制菟絲子，在指紋圖譜中，體現(xiàn)了原兒茶酸、原兒茶醛、特女貞苷、日本南五味子素甲、(2′s)-南五味子木質(zhì)素等指標(biāo)性成分。2.特征性：采用本發(fā)明所述方法建立的指紋圖譜，是基于本發(fā)明所述中藥組合物制劑的特定的原料藥以及在制劑過程中化學(xué)成分間的相互作用，以原兒茶酸吸收峰為參照，各個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積在一定范圍內(nèi)是相對穩(wěn)定，并且會(huì)在藥味組成發(fā)生變化(比如使用偽劣藥材或者投料量不足)時(shí)產(chǎn)生差異。據(jù)此，可以很好地鑒別真?zhèn)?，控制質(zhì)量，減少了人為處理產(chǎn)品使檢測結(jié)果為假陽性的可能性。另外，本發(fā)明所述方法建立的所述中藥組合物制劑(優(yōu)選為壯腰健腎丸)的指紋圖譜，特征峰多，峰形好，易于鑒別，相似性高(與對照圖譜的相似度均大于0.9)，準(zhǔn)確可靠。3.穩(wěn)定性：本發(fā)明所述方法對供試品溶液的制備、色譜條件、測定過程、數(shù)據(jù)采集、處理、分析等都做了詳細(xì)限定，從而保證不同操作者、不同實(shí)驗(yàn)室重復(fù)做出的指紋圖譜都在允許的誤差范圍內(nèi)，體現(xiàn)了所述方法的通用性、實(shí)用性和重現(xiàn)性。特別的，以本發(fā)明所述方法建立的所述壯腰健腎丸的指紋圖譜中，10批樣品的所有共有峰相對保留時(shí)間的rsd＜0.2％。本發(fā)明提供的方法建立的壯腰健腎丸的指紋圖譜，能有效地表征本發(fā)明所述中藥組合物制劑，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量，更好地保障患者用藥安全和治療效果。附圖說明以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：圖1為實(shí)施例1中考察提取溶劑試驗(yàn)的色譜圖，其中s1是甲醇為提取溶劑的色譜圖，s2是75％甲醇為提取溶劑的色譜圖，s3是50％甲醇為提取 溶劑的色譜圖，s4是95％乙醇為提取溶劑的色譜圖，s5是50％乙醇為提取溶劑的色譜圖。圖2為實(shí)施例2中考察流動(dòng)相試驗(yàn)的色譜圖，其中，s1是乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜圖，s2是乙腈-甲醇-水為流動(dòng)相的色譜圖，s3是乙腈-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜圖，s4是甲醇-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜圖。圖3為實(shí)施例5中生成的對照指紋圖譜，圖中的標(biāo)號1-43為共有色譜峰的標(biāo)號。圖4為實(shí)施例5中10批樣品匹配后的色譜圖，其中s1-s10為樣品的編號。圖5為實(shí)施例5中對照品溶液的hplc色譜圖。圖中的標(biāo)號為與對照指紋圖譜色譜峰相對應(yīng)峰的標(biāo)號。具體實(shí)施方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。其中：1.儀器agilent1200型高效液相色譜儀；色譜柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色譜柱(250×4.6mm,5μm)；sb-5200dtd超聲波處理器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；sartorious電子分析天平。2.試劑乙腈、甲醇(色譜級，merck公司)；磷酸(色譜級，科密歐)；乙醇、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；水(millipore超純水)。3.樣品、對照藥材與標(biāo)準(zhǔn)品3.1樣品壯腰健腎丸(水蜜丸)，批號c08047(s1)，fk3291(s2)，ek3341(s3)，c08182(s4)，em3381(s5)，ej3001(s6)，c08183(s7)，fu4901(s8)， d05125(s9)，em3581(s10)；均由廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司提供；制備工藝為：1)按照如下處方準(zhǔn)備各味藥材：狗脊1876g，黑老虎1125g，千斤拔450g，蒸桑寄生563g，蒸女貞子94g，雞血藤1125g，金櫻子600g，牛大力750g，鹽水制菟絲子94g；2)狗脊876g和黑老虎的木部、以及全部的雞血藤、金櫻子、千斤拔和牛大力加水煎煮二次，第一次4小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠膏；剩余的狗脊1000g、黑老虎的皮部和全部的蒸桑寄生、蒸女貞子和鹽水制菟絲子共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混勻，干燥，粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻；每100g粉末用煉蜜50～60g與適量的水泛丸，以藥用活性炭包衣，干燥，拋光，制成濃縮水蜜丸。3.2對照品原兒茶酸、原兒茶醛對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號分別為：110809-200503,110810-200205，特女貞苷對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，批號為：111926-201102；日本南五味子素甲、(2′s)-南五味子木質(zhì)素均為自制(純度＞95％，經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園結(jié)構(gòu)鑒定)。實(shí)施例1供試品溶液制備方法的建立1.1提取溶劑的選擇：取批號c08047的壯腰健腎丸樣品5g，研細(xì)，精密稱定，置于50ml具塞錐形瓶中，分別精密加入25ml甲醇、75％甲醇(體積百分濃度)、50％甲醇(體積百分濃度)、95％乙醇(體積百分濃度)、50％乙醇(體積百分濃度)，超聲45min后，放冷至室溫，稱定重量，分別用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。在下述色譜條件下，分別測定不同提取溶劑制備得到的供試品溶液，記錄0～150min的色譜圖：色譜柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色譜柱(250×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈(a)-甲醇(b)-0.1％磷酸水(c)，梯度洗脫條件見表1；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：230nm；進(jìn)樣量：10μl。表1梯度洗脫程序結(jié)果見圖1。圖譜顯示用甲醇提取時(shí)，峰的數(shù)目最多，且基線平穩(wěn)。說明甲醇為提取溶劑，樣品中成分提取較完全，故選擇甲醇為提取溶劑。1.2提取方法的比較取批號c08047的樣品約5g。研細(xì)，精密稱定，以25ml甲醇為提取溶劑，分別采取超聲30min、45min、1h、回流1h及冷浸過夜五種提取方法制備供試品。依照“1.1提取溶劑的選擇”項(xiàng)下所述的色譜條件測定，記錄0～150min的色譜圖。結(jié)果表明，五種提取方法中，以超聲45min、1h以及回流1h得到的圖譜峰數(shù)量為多，且三者無明顯差別(色譜圖略)，故選擇最簡單易行的超聲45min為提取方法。通過本實(shí)施例優(yōu)選出了供試品溶液的制備方法，具體操作為：取所述中藥組合物制劑5g，研細(xì)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，超聲45min，放冷至室溫，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。實(shí)施例2色譜條件的建立2.1流動(dòng)相的確定按照實(shí)施例1優(yōu)選出的供試品溶液的制備方法，取批號c08047的樣品約5g制備供試品溶液。柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl，流速：1ml/min，檢測波長230nm，分別以甲醇(a+b)-0.1％磷酸水溶液(c)、乙腈(a+b)-0.1％磷酸水溶液(c)，乙腈(a)-甲醇(b)-水(c)及乙腈(a)-甲醇(b)-0.1％磷酸水溶液(c)為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序見表1。洗脫時(shí)長150min，記錄色譜圖。色譜圖見圖2。結(jié)果顯示：乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相，基線相對平穩(wěn)且分離效果最好。因此選擇乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相，按照表1所示的 程序進(jìn)行洗脫。2.2色譜柱的考察研究發(fā)現(xiàn)，即使是同種規(guī)格的c18色譜柱，同一化合物在不同商家的產(chǎn)品中的出峰時(shí)間及峰形是有差異的。經(jīng)過對比phenomenexluna色譜柱，agilenteclipsexdbc18色譜柱，watersatlantis色譜柱，結(jié)果表明，phenomenexluna色譜柱的分離效果最好。(色譜圖略)2.3檢測波長的考察按照實(shí)施例1優(yōu)選出的供試品溶液的制備方法，取批號c08047的樣品約5g制備供試品溶液。采用phenomenexluna5uc18(2)100a色譜柱(250×4.6mm,5μm)，乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見表1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl，流速：1ml/min。采用dad檢測器進(jìn)行全波長掃描。經(jīng)波長掃描可以發(fā)現(xiàn)：230n下色譜圖峰的數(shù)目最多，峰形較好且基線相對較平穩(wěn)。故選擇230nm為檢測波長。實(shí)施例3壯腰健腎丸的成分檢測1.色譜柱：phenomenexluna5uc18(2)100a色譜柱(250×4.6mm,5μm)；2.流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1％磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見表1；3.流速：1.0ml/分鐘；4.檢測波長：230nm；5.柱溫：30℃；6.供試品溶液的制備：按照實(shí)施例1優(yōu)選出的方法制備；7.對照品溶液的制備：分別精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛、特女貞苷、日本南五味子素甲和(2′s)-南五味子木質(zhì)素對照品，加甲醇制成濃度為原兒茶酸120μg/ml、原兒茶醛130μg/ml、特女貞苷140μg/ml、日本南五味子素甲40μg/ml和(2′s)-南五味子木質(zhì)素30μg/ml的混合對照品溶液，即得；8.測定法：分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，記錄150min的色譜圖；9.共有峰的標(biāo)定：根據(jù)對照品色譜圖對供試品色譜的相應(yīng)吸收峰進(jìn)行歸屬，確定以原兒茶酸吸收峰為參照峰，標(biāo)定各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。實(shí)施例4方法學(xué)驗(yàn)證4.1儀器精密度取壯腰健腎丸(批號c08047)，按照實(shí)施例3的方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定并記錄0～150min的色譜圖。圖譜中，以原兒茶酸(6號峰)為參考峰，分別對各共有峰保留時(shí)間和相對峰面積的變化情況進(jìn)行考察。結(jié)果顯示在測定時(shí)間內(nèi)，共有43個(gè)吸收峰。各共有峰保留時(shí)間rsd均小于0.14％，相對峰面積rsd小于4.19％，表明實(shí)驗(yàn)儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。其中相對峰面積考察結(jié)果見表2。表2精密度相對峰面積考察結(jié)果4.2方法重現(xiàn)性取壯腰健腎丸(批號c08047)，按照實(shí)施例3所述方法平行制備6份供試品溶液，按照實(shí)施例3的方法測定。以原兒茶酸吸收峰為參照峰，考察其他各共有色譜峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，計(jì)算rsd值。43個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間rsd均低于0.16％，相對峰面積rsd均小于5.02％，表明方法重現(xiàn)性良好。其中相對峰面積的結(jié)果見表3。表3重復(fù)性考察結(jié)果(相對峰面積)4.3穩(wěn)定性考察取壯腰健腎丸(批號c08047)，按照實(shí)施例3的方法制備供試品溶液，分別在0h、3h、6h、9h、12h、24h，按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行測定。記錄0～150min的色譜圖，以原兒茶酸為參照，考察其他各共有色譜峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積，計(jì)算rsd。結(jié)果表明，24h內(nèi)測定，43個(gè)峰的相對保留時(shí)間rsd均低于0.24％，相 對峰面積rsd均小于4.5％。相對峰面積考察數(shù)據(jù)見表4。說明在測定時(shí)間內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定。表4穩(wěn)定性考察結(jié)果(相對峰面積)通過本實(shí)施例的試驗(yàn)表明，本發(fā)明建立的測定方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。實(shí)施例5壯腰健腎丸指紋圖譜的建立5.1壯腰健腎丸指紋圖譜的建立參照實(shí)施例3的方法，檢測并記錄了10批壯腰健腎丸(s1-s10)0～150min的色譜圖。以s1(批號：c08047)樣品圖譜為參照圖譜，采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2004a版)軟件對上述10批壯腰健腎丸hplc指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，生成了10批樣品的共有模式，見圖3，為對照指紋圖譜。經(jīng)匹配后的圖譜見圖4。10批樣品hplc指紋圖譜43個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間rsd均低于0.19％。相對峰面積考察數(shù)據(jù)見表5。表510批壯腰健腎丸相對峰面積5.2相似度評價(jià)將所述10批次樣品的色譜圖與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表6。表610批次樣品與其對照指紋圖譜間的相似度值s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10對照s110.8650.960.9980.9180.9460.9950.9690.9110.9560.978s20.86510.930.8570.9060.9620.8530.9120.9110.8640.937s30.960.9310.9510.9560.9850.9480.9360.9520.9770.989s40.9980.8570.95110.9110.9380.9970.9720.9060.9460.974s50.9180.9060.9560.91110.9680.9130.90.9970.9190.969s60.9460.9620.9850.9380.96810.9360.9440.9670.9460.99s70.9950.8530.9480.9970.9130.93610.9690.9080.9450.972s80.9690.9120.9360.9720.90.9440.96910.8980.8970.967s90.9110.9110.9520.9060.9970.9670.9080.89810.9140.967s100.9560.8640.9770.9460.9190.9460.9450.8970.91410.963對照0.9780.9370.9890.9740.9690.990.9720.9670.9670.9631表6數(shù)據(jù)顯示，所述10批次樣品與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，未發(fā)現(xiàn)離群樣本，表明10個(gè)批次樣品的質(zhì)量穩(wěn)定性良好，符合國家食品藥品監(jiān)督管理局對中藥指紋圖譜相似度的要求。5.3hplc指紋圖譜峰歸屬按照實(shí)施例3所述的方法制備對照品溶液并進(jìn)行測定，記錄0～150min的hplc色譜圖，見圖5。根據(jù)對照品hplc色譜圖保留時(shí)間對壯腰健腎丸指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行歸屬，其中6號為原兒茶酸色譜峰，9號為原兒茶醛色譜峰，15號為特女貞苷色譜峰，26號為日本南五味子素甲色譜峰，36號為(2′s)-南五味子木質(zhì)素色譜峰。通過以上研究，本發(fā)明建立了壯腰健腎丸的高效液相指紋圖譜。通過對多批次樣品的測定證明該方法重現(xiàn)性、專屬性等良好，色譜體現(xiàn)了原兒茶酸、原兒茶醛、特女貞苷、日本南五味子素、(2′s)-南五味子木質(zhì)素為指標(biāo)的主要特征，可以提供比常規(guī)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更深層次的質(zhì)量評價(jià)依據(jù)。以上對本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。當(dāng)前第1頁12