技術(shù)領(lǐng)域：
：：本發(fā)明涉及一種中藥材的檢測方法，特別涉及一種遠(yuǎn)志uplc測定方法
背景技術(shù)：
：：:遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物遠(yuǎn)志polygala.tenuifoliawilld.或卵葉遠(yuǎn)志polygala.sibirical.的干燥根，其味苦、辛、溫，歸心、腎、脾經(jīng)，具有安神益智、祛痰、消腫之功效，用于心腎不交引起的失眠多夢、健忘驚悸、神志恍惚等。市售遠(yuǎn)志藥材品質(zhì)參差不齊，polygalaxanthoneⅲ、3,6'-disinapoylsucrose含量總體偏低，藥材質(zhì)量難以控制。近年來，針對遠(yuǎn)志質(zhì)量評價等方面的研究也多為個別成分為指標(biāo)的含量測定分析。姜勇等開展了遠(yuǎn)志指紋圖譜研究，但所建立的hplc指紋圖譜檢測時間為80min，耗時長，損耗試劑多，不利于高通量分析，同時存在共有峰數(shù)目較少、缺乏共有峰定性等問題。綜上所述，建立一種全面、快速的遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量評價方法很有必要。本發(fā)明選取了有神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁等活性報道的6種成分(sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneⅲ、3,6'-disinapoylsucrose)進(jìn)行同時測定。同時，由于遠(yuǎn)志藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，僅以幾種成分來控制藥材質(zhì)量較為片面，遠(yuǎn)志藥材中其他成分同樣有可能對藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響。因此本發(fā)明采用指紋圖譜進(jìn)一步對遠(yuǎn)志質(zhì)量進(jìn)行表征和研究，并采用uplc-q-tof質(zhì)譜儀指認(rèn)共有峰。本發(fā)明利用“指紋圖譜+多成分定量”方法，對多個主產(chǎn)地的遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行了較全面的快速質(zhì)量分析，為臨床合理使用提供更多科學(xué)依據(jù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明建立了一種遠(yuǎn)志藥材超高效液相色譜(uplc)多成分含量測定及指紋圖譜建立方法。本發(fā)明提供一種遠(yuǎn)志藥材有效成分的含量檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：步驟1、對照品溶液制備：取西伯利亞遠(yuǎn)志糖a5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6、西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮b、球腺糖a、遠(yuǎn)志口山酮ⅲ、3,6'-二芥子?；崽牵状级ㄈ葜瞥苫旌蠈φ掌啡芤?；步驟2、供試品溶液制備：取遠(yuǎn)志藥材含水低級醇提取后，濾過，得到供試品溶液；步驟3、將對照品溶液和供試品溶液分別注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計算供試品中的有效成分含量。其中，步驟1所述混合對照品溶液，其中各組分的含量分別為：每1ml含西伯利亞遠(yuǎn)志糖a535-40ug、西伯利亞遠(yuǎn)志糖a642-52ug、西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮b20-26ug、球腺糖a25-31ug、遠(yuǎn)志口山酮ⅲ24-30ug、3,6'-二芥子?；崽?34-286ug的混合對照品溶液，優(yōu)選的，西伯利亞遠(yuǎn)志糖a5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6、西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮b、球腺糖a、遠(yuǎn)志口山酮ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖的含量分別為39.8mg/l、47.7mg/l、23.9mg/l、28.2mg/l、27.4mg/l、263mg/l的混合對照品溶液。其中，步驟2所述含水低級醇為甲醇或乙醇的水溶液。所述的提取方法包括回流法或超聲波提取法。優(yōu)選步驟2供試品溶液配制方法如下：取遠(yuǎn)志藥材用30-100％低級醇超聲提取10-60分鐘或回流提取2-3次每次1-1.5小時。其中的含水低級醇選自30％-100％甲醇或30％-100％乙醇溶液，優(yōu)選30％-100％甲醇，最佳70％甲醇溶液超聲提取30分鐘。。步驟3中所述的超高效液相色譜條件：uplc色譜儀c18色譜柱、流動相酸水-乙腈溶液梯度洗脫、流速0.3-0.4ml/min、檢測波長300-330nm、柱溫25-35℃。所述的梯度洗脫條件為0～1min，10％乙腈；1～2.5min，10％～14％乙腈；2.5～4min，14％～16％乙腈；4～9min，16％～25％乙腈；9～12min，25％乙腈；12～14min，25％～27％乙腈；14～16min，27％～30％乙腈；16～18min，30％～39.8％乙腈；18～21min，39.8％～40％乙腈；21～23min，40％～60％乙腈；23～24min，60％～100％乙腈；24～26min，100％～10％乙腈。經(jīng)過測定，所述遠(yuǎn)志藥材中，西伯利亞遠(yuǎn)志糖a5含量0.4-1.7mg/g、西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6含量0.4-1.6mg/g、西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮b含量0.5-1.5mg/g、球腺糖a含量0.2-0.8mg/g、遠(yuǎn)志口山酮ⅲ含量0.3-1.0mg/g、3,6'-二芥子?；崽呛?.9-6.9mg/g。其中，步驟3、優(yōu)選uplcc18色譜柱為t3鍵合色譜柱，流速0.4ml/min、檢測波長320nm、柱溫30℃。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種遠(yuǎn)志藥材超高效液相指紋圖譜建立方法，其特征在于，所述方法，步驟如下：步驟1、供試品溶液制備：取多批次遠(yuǎn)志藥材含水低級醇提取后，濾過，得到供試品溶液；步驟2、將供試品溶液注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，對所有色譜圖相似度評價得到含有37個共有峰的遠(yuǎn)志藥材的參照指紋圖譜步驟3、采用質(zhì)譜分析法；并對37個共有峰進(jìn)行歸屬，鑒定出37個共有峰中的33個峰；其中，超高效液相色譜的色譜條件如下：uplc色譜儀c18色譜柱、流動相酸水-乙腈溶液梯度洗脫、流速0.3-0.4ml/min、檢測波長300-330nm、柱溫25-35℃。所述的梯度洗脫條件為0～1min，10％乙腈；1～2.5min，10％～14％乙腈；2.5～4min，14％～16％乙腈；4～9min，16％～25％乙腈；9～12min，25％乙腈；12～14min，25％～27％乙腈；14～16min，27％～30％乙腈；16～18min，30％～39.8％乙腈；18～21min，39.8％～40％乙腈；21～23min，40％～60％乙腈；23～24min，60％～100％乙腈；24～26min，100％～10％乙腈。其中，所述的對共有峰進(jìn)行歸屬，采用質(zhì)譜分析法，其中質(zhì)譜條件如下：采用電噴霧離子源esi，負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍100-2000da；毛細(xì)管電壓為2.5-3kv；錐孔電壓為10-50v；離子源溫度為80-120℃；霧化溫度為200-300℃；載氣流速為400-1000l/h，碰撞能量(ce)40-100v,優(yōu)選60-80v。優(yōu)選采用電噴霧離子源(esi)，負(fù)離子mse模式，霧化氣體為高純度氮氣(n2)，碰撞氣體為高純度氬氣(ar)。質(zhì)量掃描范圍100～2000da；毛細(xì)管電壓為3kv；錐孔電壓為40v；離子源溫度為120℃；霧化溫度為300℃；載氣流速為800l/h，碰撞能量(ce)60～80v；采用亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精確質(zhì)量校正([m-h]-＝554.2615)。其中，所述共有峰37個、相對保留時間及相對峰面積表1表137個共有峰的相對保留時間和相對峰面積其中，已經(jīng)確認(rèn)歸屬的共有峰33個，化學(xué)結(jié)構(gòu)式、相對保留時間及相對峰面積結(jié)果見表2。表2基于uplc-q-tof-mse的遠(yuǎn)志指紋圖譜共有峰的歸屬其中，步驟1供試品溶液配制方法中所述含水低級醇為甲醇或乙醇的水溶液。所述的提取方法包括回流法或超聲波提取法。優(yōu)選取遠(yuǎn)志藥材用30-100％低級醇超聲提取10-60分鐘或回流提取2-3次每次1-1.5小時。其中的含水低級醇選自30％-100％甲醇或30％-100％乙醇溶液，優(yōu)選30％-100％甲醇，最佳70％甲醇溶液超聲提取30分鐘。其中，步驟2所述的uplcc18色譜柱為t3鍵合色譜柱，流速0.4ml/min、檢測波長320nm、柱溫30℃。試驗例試驗例一、指紋圖譜的建立1儀器與試藥1.1儀器超高效液相色譜系統(tǒng)(waters公司acquityuplc，包括真空脫氣機、二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、tuv檢測器)，acquityuplc-synaptg2ms色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(waters公司)，電子天平(xs205，瑞士mettlertoledo公司)，高速冷凍離心機(st16r，美國thermo公司)，milli-q超純水系統(tǒng)(美國millipore公司)，超聲波清洗器(kq-500dv，昆山市超聲儀器有限公司)。1.2藥品與試劑sibiricosea5(批號:ap0590，純度98％)、sibiricosea6(批號：ap148s，純度98％)、sibiricaxanthoneb(批號ap046s，純度98％)、glomeratosea(批號20150701，純度98％)均購自天津一方科技有限公司，polygalaxanthoneⅲ(批號111850-201203，純度95.7％)、3,6'-disinapoylsucrose(批號111848-201303，純度96.0％)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(色譜純，德國merck公司)，甲酸(色譜純，上海潤捷公司)，超純水(milli-q制備)。2溶液制備2.1對照品溶液制備分別取西伯利亞遠(yuǎn)志糖a5sibiricosea5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6sibiricosea6、西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮bsibiricaxanthoneb、球腺糖aglomeratosea、遠(yuǎn)志口山酮ⅲpolygalaxanthoneⅲ、3,6'-二芥子?；崽?,6'-disinapoylsucrose對照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為每1ml含39.8mg/l、47.7mg/l、23.9mg/l、28.2mg/l、27.4mg/l、263mg/l的混合對照品貯備液，存貯于4℃冰箱中備用。2.2供試品溶液制備樣品干燥后粉碎，精密稱定粉末(過三號篩)0.5g，置于25ml容量瓶中，加入30％-100％甲醇或30％-100％乙醇溶液20ml，超聲提取30min(功率500w，頻率40khz)，放至室溫，補足溶液稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管，4900r/min下高速離心10min，吸取上清液，0.22um微孔濾膜濾過即得。3色譜條件及質(zhì)譜條件3.1色譜條件uplcc18色譜柱(優(yōu)選watersacquityuplct3，2.1mm×100mm，1.8μm色譜柱)。流動相0.1％甲酸水溶液(a)-乙腈(b)：梯度洗脫條件為0～1min，10％b；1～2.5min，10％～14％b；2.5～4min，14％～16％b；4～9min，16％～25％b；9～12min，25％b；12～14min，25％～27％b；14～16min，27％～30％b；16～18min，30％～39.8％b；18～21min，39.8％～40％b；21～23min，40％～60％b；23～24min，60％～100％b；24～26min，100％～10％b。流速0.4ml/min；檢測波長320nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量1μl。6種成分的理論塔板數(shù)均不低于6000，此色譜條件檢測時間短，信息量豐富，亦用于指紋圖譜的分析，對照品及樣品圖譜見圖1。3.2質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(esi)，負(fù)離子mse模式，霧化氣體為高純度氮氣(n2)，碰撞氣體為高純度氬氣(ar)。質(zhì)量掃描范圍100～2000da；毛細(xì)管電壓為3kv；錐孔電壓為40v；離子源溫度為120℃；霧化溫度為300℃；載氣流速為800l/h，碰撞能量(ce)60～80v；采用亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精確質(zhì)量校正([m-h]-＝554.2615)。4指紋圖譜采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004a版”軟件對遠(yuǎn)志藥材uplc指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰37個，由于3,6'-disinapoylsucrose在各批次遠(yuǎn)志中均有出現(xiàn)，分離度良好且峰面積較大，故選擇3,6'-disinapoylsucrose(10號峰)作為參照峰，以該參照峰計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，進(jìn)行指紋圖譜方法學(xué)考察。各圖譜生成的參照圖譜，其共有峰相對保留時間和相對峰面積見表3。表337個共有峰的相對保留時間和相對峰面積本發(fā)明依據(jù)對照品、文獻(xiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和色譜保留行為，對37個共有峰進(jìn)行了鑒定歸屬，共鑒定出有33共有峰的化學(xué)式。其中1、2、4、5、6、10、15、32號峰采用對照品對照確定為sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneⅲ、3,6'-disinapoylsucrose、tenuifolisidec、onjisaponinb。歸屬的33個共有峰包括18個糖酯類成分，12個皂苷類成分，以及3個雙苯吡酮類成分，結(jié)果見表4。表4基于uplc-q-tof-mse的遠(yuǎn)志指紋圖譜共有峰的歸屬本發(fā)明的檢測方法和指紋圖譜的建立方法是經(jīng)過篩選得到的，篩選過程如下：試驗例二條件摸索5.1樣品提取條件的考察5.1.1提取方式考察考察加熱回流、超聲提取兩種提取方式對遠(yuǎn)志藥材提取效果的影響。精密稱取遠(yuǎn)志藥材500mg，分別用50ml的70％甲醇-水(v/v)作為提取溶劑超聲30min，加熱回流90min，采用同樣的預(yù)實驗色譜條件進(jìn)樣(色譜圖見圖2)。結(jié)果表明，超聲提取和加熱回流提取效果相差不大，由于超聲提取操作簡便，因此選擇超聲提取作為提取方式。5.1.2提取溶劑及比例、時間考察考察甲醇和水作為提取溶劑的提取效果，精密稱取遠(yuǎn)志藥材500mg，分別用50ml的甲醇、水作為提取溶劑。結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑時色譜峰峰形好且峰數(shù)多，因此選擇甲醇作為提取溶劑?？疾焯崛∪軇┑谋壤安煌瑫r間的提取效果，精密稱取遠(yuǎn)志藥材500mg，分別用50ml的30％甲醇-水(v/v)、50％甲醇-水(v/v)、70％甲醇-水(v/v)和100％甲醇-水(v/v)作為提取溶劑，分別在超聲提取10min，30min和60min(標(biāo)號順序見表1)。采用同樣的預(yù)實驗色譜條件進(jìn)樣(色譜圖見圖3)。結(jié)果表明，70％甲醇-水作為提取溶劑提取的峰形及各峰分離度較好。超聲時間提高對峰高和峰形沒有明顯的影響，考慮提取效率和色譜峰高度，選擇30min作為藥材提取時間。表5不同提取溶劑比例及不同時間實驗設(shè)計順序表5.2色譜方法的選擇5.2.1檢測波長的選擇考察檢測波長對遠(yuǎn)志藥材分離效果的影響。用pda檢測器對樣品進(jìn)行200-400nm全波長掃描，比較各波長下色譜圖(圖4)：在320nm處，遠(yuǎn)志藥材中糖脂類、皂苷類、雙苯吡酮類成分均有較好的響應(yīng)，色譜峰個數(shù)較多，分離度好，因此選定320nm為測定波長。5.2.2色譜柱的選擇考察不同uplcc18色譜柱對遠(yuǎn)志藥材分離效果的影響。取遠(yuǎn)志藥材制備供試品溶液，使用acquityuplchsst3柱(2.1×100mm，1.7μm，美國waters公司)，acquityuplchssc18柱(2.1×100mm，1.7μm，美國waters公司)，acquityuplcbehc18柱(2.1×100mm，1.7μm，美國waters公司)(色譜圖見圖5)。結(jié)果表明，hsst3柱分離出的色譜峰數(shù)目多且對遠(yuǎn)志皂苷類成分分離效果明顯優(yōu)于其他色譜柱。5.2.3流動相梯度洗脫條件的選擇篩選uplc梯度洗脫條件對遠(yuǎn)志藥材含量測定以及指紋圖譜分離效果的影響。用乙腈-水溶液不同比例，不同洗脫程序進(jìn)行篩選，不同方案如下，代表色譜圖見圖6。方案1：方案2：方案3：方案4：方案5：方案6：方案7：方案8：方案9：經(jīng)過多次調(diào)整，從峰分離度，色譜圖分布均勻性等綜合考量，方案9明顯優(yōu)于其他方案。5.2.4流動相條件的優(yōu)化考察流動相條件對遠(yuǎn)志藥材分離效果的影響。由于遠(yuǎn)志藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，要在同一色譜條件下達(dá)到良好分離選擇梯度洗脫系統(tǒng)。主要對水相進(jìn)行考察：精密稱取遠(yuǎn)志藥材500mg，使用25ml的70％甲醇-水(v/v)作為提取溶劑超聲提取30min，a相分別使用純水、0.1％甲酸-水(v/v)、0.2％甲酸-水(v/v)，0.1％磷酸-水(v/v)、0.2％磷酸-水(v/v)。(色譜圖見圖7)。結(jié)果表明，a相單純使用二純水時，分離效果不佳，加入不同濃度的甲酸、磷酸分離度有所改善，在0.1％甲酸-水條件下峰形最好，尤其是對遠(yuǎn)志皂苷類成分分離度，以往常用磷酸水作為水相，但因磷酸的不揮發(fā)性，導(dǎo)致磷酸水的方法無法推廣至質(zhì)譜分析，具有使用的局限性，而甲酸水兼具良好的分離效果及液質(zhì)聯(lián)用的適用性；在保證色譜峰分離度及數(shù)目的情況下，0.1％甲酸水較0.2％甲酸水的ph值更有利于液相系統(tǒng)的保持，對色譜柱的維護(hù)、使用壽命的延長更有優(yōu)勢，且節(jié)約試劑。故選用0.1％甲酸-水。5.2.5柱溫的選擇考察色譜柱溫度對遠(yuǎn)志藥材分離效果的影響。在上述優(yōu)化后的色譜系統(tǒng)、梯度下，分別考察了25℃、30℃和35℃三個柱溫對峰形和分離的影響。結(jié)果(圖8)表明，三種溫度下的分離效果差異不大，考慮到溫度控制，選擇30℃作為檢測溫度。5.2.6流速的選擇考察不同流速對遠(yuǎn)志藥材分離效果的影響。在上述優(yōu)化后的色譜系統(tǒng)、梯度下，分別考察了0.3ml/min、0.35ml/min、0.4ml/min三個流速對峰形和分離的影響。結(jié)果(圖9)表明，0.4ml/min流速分離度合適，在高于0.4ml/min流速下，儀器系統(tǒng)壓力高，容易超出uplc警戒壓力，故選擇0.4ml/min為運行速度。試驗例三、6種成分含量測定及方法學(xué)驗證6.1線性關(guān)系考察精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，以甲醇逐級稀釋，稀釋倍數(shù)分別為1、2、4、8、16和32倍，搖勻。分別按3.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量均為1μl，測定峰面積。以峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x(mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制各標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表3，6種化合物在各濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。6.2定量限與檢測限將對照品溶液逐級稀釋后，按3.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，信噪比(s/n)為3時的質(zhì)量濃度(mg/l)為檢測限(lod)，信噪比(s/n)為10時的質(zhì)量濃度(mg/l)為定量限(loq)，結(jié)果見表6。表66種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢測限6.3精密度試驗分別精密吸取混合對照品溶液1μl，在3.1項色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計算化合物sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneⅲ、3,6'-disinapoylsucrose峰面積rsd值，分別為0.3％，0.2％，0.3％，0.3％，0.1％，0.2％，儀器精密度良好。6.4重復(fù)性試驗按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，3.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneⅲ、3,6'-disinapoylsucrose峰面積rsd值，分別為0.9％，2.2％，0.7％，0.9％，1.9％，0.5％，實驗重復(fù)性良好。6.5穩(wěn)定性按2.2項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，按3.1項下色譜條件分別在0，2，4，8，12，18，24h時進(jìn)樣分析，計算6個化合物峰面積的rsd值，分別為1.0％，0.6％，0.7％，0.7％，1.5％，0.6％，樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。6.6加樣回收率試驗取已知含量的樣品6份，每份為0.25g，精密稱定，置于25ml容量瓶中，分別精密加入相當(dāng)于樣品成分含量100％的各對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，3.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算6種成分的加樣回收率。平均回收率分別為97.74％，99.31％，97.20％，99.53％，96.97％，100.57％；rsd分別為1.57％，0.60％，0.88％，0.73％，0.97％，0.19％。7指紋圖譜的方法學(xué)驗證指紋圖譜的方法學(xué)驗證與第6項中相同。結(jié)果顯示，同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，各共有峰相對保留時間rsd<0.1％，相對峰面積rsd<2.2％，精密度良好。重復(fù)性考察各共有峰相對保留時間rsd<0.1％，相對峰面積rsd<3.6％；穩(wěn)定性考察各共有峰相對保留時間rsd<0.3％，相對峰面積rsd<3.8％。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明采用uplc法對遠(yuǎn)志藥材的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，在同一色譜條件下，完成了運用一張uplc色譜圖同時對遠(yuǎn)志藥材6種成分含量進(jìn)行測定和指紋圖譜分析。在26min內(nèi)即可完成分離和測定，極大地縮短了分析時間，對于樣品的高通量分析具有顯著優(yōu)勢。2、現(xiàn)有技術(shù)均采用hplc法對遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行分析，然而hplc的條件并不完全適用于uplc。本發(fā)明在分析條件篩選研究中，對本發(fā)明的提取條件(提取方式、溶劑及比例、時間等)及uplc色譜條件(色譜柱、流動相、梯度洗脫程序等)均進(jìn)行了優(yōu)化，利用質(zhì)譜信息驗證了各峰純度，最終建立的分析方法可見峰數(shù)量明顯增加，改善峰形和拖尾，分離度好，信息豐富且簡單易行。本發(fā)明采用uplc-q-tof-mse對指紋圖譜共有峰進(jìn)行歸屬，通過對正負(fù)離子模式、脫溶劑氣溫度、離子源溫度及毛細(xì)管電壓等質(zhì)譜條件進(jìn)行篩選，確定了準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子峰響應(yīng)值均較高的條件，在該條件下，研究8個標(biāo)準(zhǔn)品及樣品多級質(zhì)譜信息，鑒定了37個共有峰中的33個峰，包括18個糖酯類成分，12個皂苷類成分以及3個雙苯吡酮類成分，表明該分析條件從整體上可以涵蓋遠(yuǎn)志具有活性的三大類成分，具有代表性全面性。遠(yuǎn)志產(chǎn)地較多，但目前市場上流通的遠(yuǎn)志大貨多產(chǎn)于山西陜西一帶，故本發(fā)明收集了產(chǎn)量較高的山西、陜西、河北、內(nèi)蒙等地產(chǎn)遠(yuǎn)志藥材，本發(fā)明所用24批藥材均擴增其psba-trnh序列，鑒定為遠(yuǎn)志polygala.tenuifoliawilld.，樣品種屬來源可靠，保證了本發(fā)明建立的分析模式的準(zhǔn)確性及樣本測定結(jié)果的可靠性。在多樣本量的基礎(chǔ)上，遠(yuǎn)志藥材的6種成分含量通過spss主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量在不同產(chǎn)地的藥材中有差異，其中3,6'-disinapoylsucrose與sibiricosea6較為明顯。24批樣品的uplc指紋圖譜，除7、12、17、20號以外，相似度均在0.9以上，說明從指紋圖譜角度看，不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量有差異也有共性。綜合定量與指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)，利用spss對不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示有差異也有重疊現(xiàn)象，說明產(chǎn)地在遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量方面有影響但可能不是主因素，可能與藥材生長年限，采收季節(jié)等相關(guān)性較大。在本發(fā)明建立的分析條件下，可以對遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量的影響因素進(jìn)行進(jìn)一步探討。uplc“指紋圖譜+多成分定量”評價方法綜合多方面信息，系統(tǒng)探討遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量的差異，可在一定程度上表征藥材在化學(xué)成分方面的差別，綜合二者信息，可為遠(yuǎn)志的產(chǎn)地選擇、質(zhì)量快速評價及臨床應(yīng)用提供參考。在此基礎(chǔ)上，如果將藥效、毒性與物質(zhì)基礎(chǔ)等結(jié)合起來，深入開展譜效學(xué)研究，則更有利于闡明中藥作用機制，完善遠(yuǎn)志質(zhì)量評價體系，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。附圖說明圖1遠(yuǎn)志的uplc色譜圖a.對照品色譜圖；b.樣品色譜圖；其中，1.取西伯利亞遠(yuǎn)志糖a5(sibiricosea5)；2.西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6(sibiricosea6)；3.西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮b(sibiricaxanthoneb)；4.球腺糖a(glomeratosea)；5.遠(yuǎn)志口山酮ⅲ(polygalaxanthoneⅲ)；3,6'-二芥子?；崽?6.3,6'-disinapoylsucrose)圖2加熱回流(下圖)、超聲提取(上圖)對遠(yuǎn)志藥材提取效果的影響圖3不同提取溶劑比例及不同時間的色譜圖(從下到上依次為1-12號實驗)圖4糖脂類、皂苷類、雙苯吡酮類成分紫外吸收圖譜圖5hsst3、hssc18、behc18柱的遠(yuǎn)志藥材色譜圖(從下到上依次為t3/hss/beh)圖6不同流動相梯度洗脫條件色譜圖(從下到上依次為1-9號方案)圖7不同水相條件的色譜圖(從下到上依次為純水、0.1％甲酸-水、0.2％甲酸-水，0.1％磷酸-水、0.2％磷酸-水)圖8不同柱溫下的色譜圖(從下到上依次為25℃、30℃和35℃)圖9不同流速下的色譜圖(從上到下依次為0.3ml/min、0.35ml/min和0.4ml/min)圖1024批遠(yuǎn)志的uplc指紋圖譜圖11遠(yuǎn)志的對照指紋圖譜具體實施方式:實施例1儀器與試藥1.1儀器超高效液相色譜系統(tǒng)(waters公司acquityuplc，包括真空脫氣機、二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、tuv檢測器)，acquityuplc-synaptg2ms色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(waters公司)，電子天平(xs205，瑞士mettlertoledo公司)，高速冷凍離心機(st16r，美國thermo公司)，milli-q超純水系統(tǒng)(美國millipore公司)，超聲波清洗器(kq-500dv，昆山市超聲儀器有限公司)。1.2藥品與試劑sibiricosea5(批號:ap0590，純度98％)、sibiricosea6(批號：ap148s，純度98％)、sibiricaxanthoneb(批號ap046s，純度98％)、glomeratosea(批號20150701，純度98％)均購自天津一方科技有限公司，polygalaxanthoneⅲ(批號111850-201203，純度95.7％)、3,6'-disinapoylsucrose(批號111848-201303，純度96.0％)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(色譜純，德國merck公司)，甲酸(色譜純，上海潤捷公司)，超純水(milli-q制備)。1.3藥材樣本采集24批遠(yuǎn)志藥材分別來自各主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)高建平教授鑒定為遠(yuǎn)志polygalatenuifoliawilld的根，且均通過dna條形碼技術(shù)(基于psba-trnh序列)驗證。藥材來源見表4。表524批遠(yuǎn)志藥材樣品來源table1thesourcesof24batchesofpolygalaeradix2溶液制備2.1對照品溶液制備分別取sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneⅲ、3,6'-disinapoylsucrose對照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為39.8mg/l、47.7mg/l、23.9mg/l、28.2mg/l、27.4mg/l、263mg/l的混合對照品貯備液，存貯于4℃冰箱中備用。2.2供試品溶液制備樣品干燥后粉碎，精密稱定粉末(過三號篩)0.5g，置于25ml容量瓶中，加入70％甲醇溶液20ml，超聲處理30min(功率500w，頻率40khz)，放至室溫，70％甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管，4900r/min下高速離心10min，吸取上清液，0.22um微孔濾膜濾過即得。3色譜條件watersacquityuplct3(2.1mm×100mm，1.8μm)色譜柱。流動相0.1％甲酸水溶液(a)-乙腈(b)：梯度洗脫條件為0～1min，10％b；1～2.5min，10％～14％b；2.5～4min，14％～16％b；4～9min，16％～25％b；9～12min，25％b；12～14min，25％～27％b；14～16min，27％～30％b；16～18min，30％～39.8％b；18～21min，39.8％～40％b；21～23min，40％～60％b；23～24min，60％～100％b；24～26min，100％～10％b。流速0.4ml/min；檢測波長320nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量1μl。6種成分的理論塔板數(shù)均不低于6000。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(esi)，負(fù)離子mse模式，霧化氣體為高純度氮氣(n2)，碰撞氣體為高純度氬氣(ar)。質(zhì)量掃描范圍100～2000da；毛細(xì)管電壓為3kv；錐孔電壓為40v；離子源溫度為120℃；霧化溫度為300℃；載氣流速為800l/h，碰撞能量(ce)60～80v；采用亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精確質(zhì)量校正([m-h]-＝554.2615)。424批遠(yuǎn)志樣品的6種成分含量計算24批遠(yuǎn)志樣品的6種成分含量，并計算每批樣品總和，結(jié)果見表7。表724批遠(yuǎn)志中6種成分含量(n＝2,mg/g)及指紋圖譜相似度結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的遠(yuǎn)志樣品中6個成分均有不同程度的差異，其中3,6'-disinapoylsucrose與sibiricosea6的差異較明顯。5相似度計算及對照指紋圖譜的生成24批遠(yuǎn)志樣品的色譜圖見圖10，生成對照指紋圖譜見圖11。各產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜比對，24批樣品相似度在0.756～0.997之間，結(jié)果見表5。結(jié)論：采用uplc，以乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脫，流速0.4ml/min，檢測波長320nm，測定24批藥材中6種成分(西伯利亞遠(yuǎn)志糖a5sibiricosea5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6sibiricosea6、西伯利亞遠(yuǎn)志口山酮bsibiricaxanthoneb、球腺糖aglomeratosea、遠(yuǎn)志口山酮ⅲpolygalaxanthoneⅲ、3,6'-二芥子?；崽?,6'-disinapoylsucrose)的含量，并建立遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜，采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(uplc-q-tof-mse)指認(rèn)共有峰。結(jié)果不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材中，3,6'-二芥子酰基蔗糖3,6'-disinapoylsucrose與西伯利亞遠(yuǎn)志糖a6sibiricosea6含量差異較大；建立的藥材uplc指紋圖譜共標(biāo)定37個共有峰，指認(rèn)出其中33個峰，24批樣品相似度在0.756～0.997之間。成分含量及相似度綜合分析結(jié)果表明，不同地區(qū)遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量存在一定差異。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12