本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種分析氟甲基酮及其有關(guān)物質(zhì)的液相色譜法，適合分析氟甲基酮及其有關(guān)物質(zhì)的流動(dòng)相，以及分析氟甲基酮及其有關(guān)物質(zhì)的套裝。
背景技術(shù)：
：氟甲基酮(z-vad-fmk)，cas號(hào)：187389-52-2，化學(xué)名稱：n-[芐氧羰基]-l-纈氨?；?n-[(1s)-3-氟-1-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2-氧代丙基]-l-丙氨酰胺，分子式：c22h30fn3o7，分子量，467.5，為白色粉未。結(jié)構(gòu)式為：z-vad-fmk是一種半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制劑，能夠抑制caspase家族蛋白酶活性和阻斷凋亡發(fā)生，可能具有預(yù)防老年性耳聾、保護(hù)人體器官和癌癥治療等作用。目前，已有很多文獻(xiàn)報(bào)告了z-vad-fmk的藥效試驗(yàn)和作用機(jī)制，例如在以下文獻(xiàn)中的報(bào)告：李勝利、王玉虎、張敏燕等，小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡方式及z-vad-fmk對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用，聽力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2015年第23卷第1期：50-56；朱寶昌、盛小輝、劉群、李紅衛(wèi)，廣譜caspase抑制劑對(duì)大鼠燙傷后腎臟的保護(hù)作用，中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014年l1月第16卷第11期：17-20；李紅衛(wèi)、劉群、朱寶昌、盛小輝，z-vad-fmk對(duì)燙傷大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響，山東醫(yī)藥，2014年第54卷第46期：14-16；夏璐、鮑英、袁耀宗、張學(xué)軍，全反式維甲酸和caspase抑制劑z-vad-fmk對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用，胰腺醫(yī)學(xué)，2003年12月第3卷第4期：198-202；等等。但是，沒有文獻(xiàn)公開檢測(cè)z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的方法，因此難以在藥物研究和使用中提供可控的質(zhì)量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明首先提供一種分析氟甲基酮(z-vad-fmk)及其有關(guān)物質(zhì)的液相色譜法，其中使用的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠(ostade-cylsilane，ods或c18)；使用的流動(dòng)相由以下流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成：流動(dòng)相a：100～300mm的銨鹽和80～250mm的鈉鹽或鉀鹽的水溶液，ph為2.5～3.5，流動(dòng)相b：體積比乙腈:水＝0.5～1.5:1，ph為2.5～3.5；流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為：45～15:55～85。本發(fā)明還提供一種用于液相色譜法分析氟甲基酮及其有關(guān)物質(zhì)的流動(dòng)相，所述流動(dòng)相由以下流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成：流動(dòng)相a：100～300mm的銨鹽和80～250mm的鈉鹽或鉀鹽的水溶液，ph為2.5～3.5，流動(dòng)相b：體積比乙腈:水＝0.5～1.5:1，ph為2.5～3.5；流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為：45～15:55～85。本發(fā)明還提供一種用于分析氟甲基酮及其有關(guān)物質(zhì)的液相色譜法套裝，包括：固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠；由以下流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成的流動(dòng)相：流動(dòng)相a：100～300mm的銨鹽和80～250mm的鈉鹽或鉀鹽的水溶液，ph為2.5～3.5，流動(dòng)相b：體積比乙腈:水＝0.5～1.5:1，ph為2.5～3.5；流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為：45～15:55～85。本方法的重點(diǎn)在于流動(dòng)相a中兩種鹽的濃度和比例，以及調(diào)節(jié)的ph值范圍。將該流動(dòng)相用于液相色譜法，更具體地用于高效液相色譜法，可對(duì)z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分離及含量分析，為z-vad-fmk作為藥物研究和使用提供質(zhì)量可控性，并且操作簡(jiǎn)單環(huán)保。附圖說明圖1為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中的靈敏度溶液的測(cè)試圖譜(圖中橫坐標(biāo)為分鐘，最小分度為0.5；縱坐標(biāo)為au，最小分度為0.002)；圖2為線性實(shí)驗(yàn)中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為實(shí)施例1樣品溶液的測(cè)試圖譜(圖中橫坐標(biāo)為分鐘，最小分度為0.5；縱坐標(biāo)為au，最小分度為0.002)；圖4為實(shí)施例2樣品溶液的測(cè)試圖譜(圖中橫坐標(biāo)為分鐘，最小分度為0.2；縱坐標(biāo)為au，最小分度為0.005)；圖5為實(shí)施例3樣品溶液的測(cè)試圖譜(圖中橫坐標(biāo)為分鐘，最小分度為0.1；縱坐標(biāo)為au，最小分度為0.002)。具體實(shí)施方式本發(fā)明分析z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的液相色譜法，其中使用的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠；使用的流動(dòng)相由以下流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成：流動(dòng)相a：100～300mm(優(yōu)選200mm)的銨鹽和80～250mm(優(yōu)選150mm)的鈉鹽或鉀鹽的水溶液，ph為2.5～3.5，流動(dòng)相b：體積比乙腈:水＝0.5～1.5:1，ph為2.5～3.5；流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為：45～15:55～85。所述分析包括定性或定量分析，或涉及z-vad-fmk與其相關(guān)物質(zhì)分離的分析。在具體的實(shí)施方案中，流動(dòng)相a中所述銨鹽、鈉鹽、鉀鹽可為有機(jī)酸或無機(jī)酸的鹽，所述有機(jī)酸優(yōu)選醋酸，所述無機(jī)酸優(yōu)選磷酸、硫酸、高氯酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述銨鹽選自硫酸銨、磷酸銨和醋酸銨中的一種或多種，且更優(yōu)選硫酸銨和/或醋酸銨；所述鈉鹽或鉀鹽選自高氯酸鈉、磷酸鈉、醋酸鈉、高氯酸鉀、磷酸鉀和醋酸鉀中的一種或多種，且更優(yōu)選高氯酸鈉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相b中，體積比乙腈:水＝1:1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相a的ph為3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相b的ph為3。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用無機(jī)酸調(diào)節(jié)所述流動(dòng)相的ph，并更優(yōu)選用磷酸調(diào)節(jié)。液相色譜法是用液體作流動(dòng)相的色譜法。本發(fā)明的測(cè)試體系適應(yīng)于柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法等液相色譜法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述液相色譜法為柱色譜法；進(jìn)一步，所述柱色譜法優(yōu)選高效液相色譜法(hplc)或液質(zhì)聯(lián)用(hplc-ms)。液質(zhì)聯(lián)用(hplc-ms)又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，是以液相色譜作為分離系統(tǒng)、質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)的一種分析方法。本發(fā)明通過測(cè)試體系特別地選擇和組合，提供了一種有效的分離和分析z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的方法。所述高效液相色譜法在具體的實(shí)施方案中，采用十八烷基硅膠鍵合色譜柱，并使用上述任意技術(shù)方案及其任意組合定義的液相色譜法中的流動(dòng)相。所述色譜柱可市售獲得。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法所述的流動(dòng)相a和流動(dòng)相b在體積比45～15:55～85內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法采用waterssunfirec18色譜柱(3.5μm4.6*150mm)或其他等效柱作為分析色譜柱。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法采用的柱溫為30～40℃，優(yōu)選35℃。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法采用的流速為0.6～1.0ml/min，優(yōu)選0.8ml/min。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm～220nm，優(yōu)選210nm。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法按如下梯度進(jìn)行洗脫：在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述高效液相色譜法中氟甲基酮的供試品溶液的濃度為0.10mg/ml～0.40mg/ml。本發(fā)明特別的優(yōu)點(diǎn)在于，通過建立、優(yōu)化的高效液相色譜法，為測(cè)定z-vad-fmk的含量和有關(guān)物質(zhì)，提供了一種穩(wěn)定性好、重復(fù)性好的測(cè)定方法，為z-vad-fmk的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)，便于該新藥質(zhì)控，從而使z-vad-fmk的藥理藥效等試驗(yàn)的可信度更高，使z-vad-fmk走向可靠的臨床應(yīng)用。鑒于上述液相色譜法中所述流動(dòng)相在分離和分析z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的實(shí)用價(jià)值，本發(fā)明還提供一種用于液相色譜法分析氟甲基酮(z-vad-fmk)及其有關(guān)物質(zhì)的流動(dòng)相，所述流動(dòng)相由以下流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成：流動(dòng)相a：100～300mm的銨鹽和80～250mm的鈉鹽或鉀鹽的水溶液，ph為2.5～3.5，流動(dòng)相b：體積比乙腈:水＝0.5～1.5:1，ph為2.5～3.5；流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為：45～15:55～85。本發(fā)明還提供一種用于分析氟甲基酮及其有關(guān)物質(zhì)的液相色譜法套裝，包括：固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠；由以下流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成的流動(dòng)相：流動(dòng)相a：100～300mm的銨鹽和80～250mm的鈉鹽或鉀鹽的水溶液，ph為2.5～3.5，流動(dòng)相b：體積比乙腈:水＝0.5～1.5:1，ph為2.5～3.5；流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為：45～15:55～85。所述套裝包括裝置、試劑和/或它們的組合，具體例如類似于試劑盒的形式。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述固定相優(yōu)選為層狀設(shè)置(例如薄層色譜)或柱狀設(shè)置(例如柱色譜)。上述實(shí)施方案任意組合形成的新的實(shí)施方案也包括在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。為進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)效果，以下通過方法驗(yàn)證和實(shí)施例進(jìn)行說明，但以下內(nèi)容并不用于限制本發(fā)明。其中，未詳細(xì)說明的操作步驟、條件、儀器及試劑，按照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行。本發(fā)明提供的高效液相色譜法根據(jù)中國(guó)藥典2015年版完成了方法學(xué)驗(yàn)證，包括系統(tǒng)適性試驗(yàn)、專屬性(降解試驗(yàn))、重復(fù)性試驗(yàn)、線性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)(準(zhǔn)確度試驗(yàn))、精密度以及耐用性等試驗(yàn)。以下列舉如下進(jìn)行的試驗(yàn)：樣品來源：z-vad-fmk：來自深圳翰宇藥業(yè)；z-vad-fmk對(duì)照品：來自深圳翰宇藥業(yè)。通用測(cè)試條件：選用waterssunfirec18色譜柱(3.5μm4.6*150mm)作為分析色譜柱，以200mm硫酸銨和150mm高氯酸鈉的水溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值至3.0)為流動(dòng)相a，以乙腈：水＝1:1(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.0)為流動(dòng)相b；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速0.8ml/min；柱溫為35℃。按下表梯度進(jìn)行洗脫：時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相a(％)流動(dòng)相b(％)04555303070451585501585514555604555步驟：取20μl待測(cè)液進(jìn)液相色譜分析，以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算含量；以自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量。試驗(yàn)1：系統(tǒng)適用性試驗(yàn)配制以下溶液進(jìn)行測(cè)試：1)靈敏度溶液：取對(duì)照品溶液適量，加稀釋液(乙腈-水＝1:1，以下 同)稀釋制成每毫升含z-vad-fmk0.1μg的溶液。2)對(duì)照品溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品約25mg精密稱定，置100ml容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。3)供試品溶液：取供試品約25mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。4)對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液1ml置100ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得。結(jié)果如下：系統(tǒng)適用性溶液測(cè)定結(jié)果：靈敏度溶液：主峰信噪比為3.2，見圖1。對(duì)照品溶液：5針對(duì)照品溶液主峰面積rsd值小于0.5％(符合《中國(guó)藥典》2015年版要求)。信噪比計(jì)算公式為s/n＝2h/hn其中，h＝與組分對(duì)應(yīng)的峰高h(yuǎn)n＝在等于半高處峰寬的五倍因此：z-vad-fmk最低檢測(cè)限為：0.1μg/ml。試驗(yàn)2：專屬性試驗(yàn)配制以下溶液進(jìn)行測(cè)試：1)酸降解溶液：精密稱定z-vad-fmk20mg，加入適量1mol/l的鹽酸溶解樣品，于室溫放置適當(dāng)時(shí)間使z-vad-fmk降解5％～20％，然后加入等量的1mol/l氫氧化鈉溶液中和，再加稀釋液稀釋并定容至100ml的容量瓶中。2)酸降解空白溶液：不加樣品，其他操作同酸降解溶液。3)堿降解溶液：精密稱定z-vad-fmk20mg，加入適量0.1mol/l的氫氧化鈉溶液溶解樣品，于室溫放置適當(dāng)時(shí)間使得z-vad-fmk降解5％～20％，然后加入等量的0.1mol/l鹽酸溶液中和，再加稀釋液稀釋并定容至100ml的容量瓶中。4)堿降解空白溶液：不加樣品，其他操作同堿降解溶液。5)氧化降解溶液：精密稱定z-vad-fmk20mg，加入適量3％的雙氧水液溶解樣品，于室溫放置適當(dāng)時(shí)間使得z-vad-fmk降解5％～20％，再加稀釋液稀釋并定容至100ml的容量瓶中。6)氧化降解空白溶液：不加樣品，其他操作同氧化降解溶液。7)光降解溶液：精密稱定z-vad-fmk20mg置于光照強(qiáng)度為4500±500lux/h、溫度為10℃的環(huán)境中，放置10天后，用稀釋液溶解并定容至100ml容量瓶中。8)高溫降解溶液：精密稱定z-vad-fmk20mg置于60℃恒溫箱中，放置10天后，用水溶解并定容至100ml容量瓶中。9)高濕降解溶液：精密稱定z-vad-fmk20mg置于高濕(濕度92.5％，室溫)環(huán)境中，放置10天后，用稀釋液溶解并定容至100ml容量瓶中。10)光降解空白溶液、高溫降解空白溶液：不加樣品，其他操作分別同光降解溶液、高溫降解溶液。取以上溶液測(cè)定，主峰純度因子均大于990，因此可認(rèn)為本檢測(cè)方法測(cè)定z-vad-fmk不受工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)干擾。且主峰與相鄰雜質(zhì)之間的分離度達(dá)到2.0，達(dá)到充分分離的要求。試驗(yàn)3：重復(fù)性試驗(yàn)取試驗(yàn)1中供試品溶液6份和對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液6份，進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，結(jié)果見下表：no.最大單雜含量(％)總雜含量(％)測(cè)得雜質(zhì)個(gè)數(shù)(個(gè))10.140.47420.150.49430.140.44440.140.46450.150.47460.130.454平均0.140.46--rsd3.8％3.8％--測(cè)得本品最大單雜的含量為0.15％，最大總雜含量為0.49％，測(cè)得的雜質(zhì)個(gè)數(shù)為4個(gè)，rsd均為3.8％。試驗(yàn)4：z-vad-fmk含量測(cè)定線性試驗(yàn)配制以下溶液進(jìn)行測(cè)試：1)60％線性溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品15mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。2)80％線性溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品20mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。3)100％線性溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。4)120％線性溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品30mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。5)140％線性溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品35mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。取60％、80％、100％、120％和140％線性溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果見下表：溶液濃度(mg/ml)平均面積60％線性溶液0.1535266280％線性溶液0.20468436100％線性溶液0.25587857120％線性溶液0.30705236140％線性溶液0.35820604以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)：y＝2e+06x+617，r2＝1得z-vad-fmk線性方程為y＝2345368x+617(其中y為峰面積，x為z-vad-fmk濃度)，r2＝0.999985。試驗(yàn)5：z-vad-fmk含量測(cè)定回收率試驗(yàn)配制以下溶液進(jìn)行測(cè)試：1)80％準(zhǔn)確度溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品20mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制3份。2)100％準(zhǔn)確度溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制3份。3)120％準(zhǔn)確度溶液：取z-vad-fmk對(duì)照品30mg，置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制3份。將以上各準(zhǔn)確度溶液進(jìn)樣分析，以z-vad-fmk對(duì)照品溶液，作為對(duì)照進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。z-vad-fmk三個(gè)濃度水平的平均回收率分別為95.45％、96.25％和 97.22％，9個(gè)樣品z-vad-fmk回收率rsd為2.87％。試驗(yàn)6：z-vad-fmk含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取z-vad-fmk25.33mg、25.14mg、25.89mg、24.95mg、25.22mg、25.64mg，精密稱定，分別置100ml量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取供試品溶液進(jìn)行分析，按試驗(yàn)4中繪得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算六份z-vad-fmk的含量。結(jié)果顯示，六份dz-vad-fmk的含量分別為：99.52％、99.45％、99.47％、99.38％、99.61％、99.49％，平均含量為99.49％。經(jīng)過上述驗(yàn)證，說明本發(fā)明提供的分析方法對(duì)于z-vad-fmk的含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定實(shí)用可靠、穩(wěn)定性較好。實(shí)施例1：選用waterssunfirec18色譜柱(3.5μm4.6*150mm)作為分析色譜柱，以100mm硫酸銨和250mm高氯酸鈉的水溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值至3.5)為流動(dòng)相a，以乙腈：水＝1:1(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.5)為流動(dòng)相b；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速0.8ml/min；柱溫為35℃。按下表梯度進(jìn)行洗脫：時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相a(％)流動(dòng)相b(％)04555303070451585501585514555604555步驟：精密量取z-vad-fmk樣品適量，稀釋液(乙腈-水＝1:1)定量稀釋制成每毫升含z-vad-fmk樣品0.25mg的溶液，取20μl待測(cè)液進(jìn)液相色譜分析，以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算含量；以自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量。樣品溶液測(cè)定的圖譜如圖3所示，其中主峰z-vad-fmk的保留時(shí)間為30.66分鐘，含量為98.32％；從圖譜由左至右，主要的雜質(zhì)峰分別的保留時(shí)間為29.27分鐘、29.75分鐘、32.09分鐘、33.32分鐘， 含量分別為0.45％、0.47％、0.37％、0.40％?？梢?，本方法對(duì)z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的分離良好，并可獲得有效的定量結(jié)果。實(shí)施例2：選用waterssunfirec18色譜柱(3.5μm4.6*150mm)作為分析色譜柱，以270mm硫酸銨和80mm高氯酸鈉的水溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值至3.0)為流動(dòng)相a，以乙腈：水＝1:1(磷酸調(diào)節(jié)ph值為3.0)為流動(dòng)相b；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速0.8ml/min；柱溫為35℃。按下表梯度進(jìn)行洗脫：時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相a(％)流動(dòng)相b(％)04555303070451585501585514555604555步驟：精密量取z-vad-fmk樣品適量，稀釋液(乙腈-水＝1:1)定量稀釋制成每毫升含z-vad-fmk樣品0.25mg的溶液，取20μl待測(cè)液進(jìn)液相色譜分析，以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算含量；以自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量。樣品溶液測(cè)定的圖譜如圖4所示，其中主峰z-vad-fmk的保留時(shí)間為31.88分鐘，含量為98.20％；從圖譜由左至右，主要的雜質(zhì)峰分別的保留時(shí)間為30.83分鐘、31.24分鐘、32.66分鐘、33.77分鐘，含量分別為0.44％、0.47％、0.46％、0.43％?？梢?，本方法對(duì)z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的分離良好，并可獲得有效的定量結(jié)果。實(shí)施例3：選用waterssunfirec18色譜柱(3.5μm4.6*150mm)作為分析色譜柱，以250mm磷酸銨和100mm醋酸鈉的水溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值至3.0)為流動(dòng)相a，以乙腈：水＝1:1(磷酸調(diào)節(jié)ph值為2.5)為流動(dòng)相b；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速0.8ml/min；柱溫為35℃。按下表梯度進(jìn)行洗脫：步驟：精密量取z-vad-fmk樣品適量，稀釋液(乙腈-水＝1:1)定量稀釋制成每毫升含z-vad-fmk樣品0.25mg的溶液，取20μl待測(cè)液進(jìn)液相色譜分析，以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算含量；以自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量。樣品溶液測(cè)定的圖譜如圖5所示，其中主峰z-vad-fmk的保留時(shí)間為27.96分鐘，含量為98.32％；從圖譜由左至右，主要的雜質(zhì)峰分別的保留時(shí)間為26.94分鐘、27.36分鐘、28.56分鐘、29.92分鐘，含量分別為0.39％、0.42％、0.43％、0.44％?？梢?，本方法對(duì)z-vad-fmk及其有關(guān)物質(zhì)的分離良好，并可獲得有效的定量結(jié)果。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍的情況下，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的修改或者等同替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)12