本發(fā)明涉及一種檢測舒洛地特原料的方法，尤其涉及一種使用肝素酶聯(lián)合降解后做sax-hplc法分析降解產(chǎn)物由此確認舒洛地特化學組成的方法。
背景技術：
舒洛地特sulodexide，商品名為偉素vesselduef，化學名稱為葡糖醛酸基葡糖胺聚糖硫酸鹽。由意大利alfawassermann公司原創(chuàng)生產(chǎn)，1974年在意大利首先上市，2003年進入中國市場。國內(nèi)至今仍只有原研一家有銷售。適應癥為有血栓形成危險的血管疾病，是一種可口服吸收的抗凝血藥。近年曾顯示其對糖尿病腎病的治療有效果。
舒洛地特由豬腸粘膜提取，是高度純化的糖胺聚糖，由重復的二糖結構單元組成帶有負電荷的長鏈大分子,二糖單元包含兩個改構糖,即n-乙酰半乳糖胺或n-乙酰葡糖胺及糖醛酸,如葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。瓊脂凝膠電泳法測得含有80%的快速移動肝素(fastmovingheparin,fmh)(基于電泳遷移率)即低分子肝素(lowmolecularweightheparin,lmwh)和20%的硫酸皮膚素(dermatansulfate,ds)及少量慢速移動肝素(slowmovingheparin,smh)(不得大于2%)。其中的lmwh部分與未分級肝素一樣含有二糖聚合結構,但硫酸化程度較低,多糖鏈的長度較短。未降解ds是由許多不同二糖組成的多糖,平均相對分子質(zhì)量25000da。
舒洛地特中的快移動肝素是一些特定的肝素成分，其雙糖組成與一般的肝素相比有所不同，測定雙糖組成和含量，可判斷制備品是否是舒洛地特。
本專利提供一種hplc法測定酶解產(chǎn)物由此判斷舒洛地特是否質(zhì)量合格的方法，可用于舒洛地特的中控檢測或成品檢測，簡單快速地判斷供試品舒洛地特是否合格，由此決定是否進行后續(xù)加工。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一種通過hplc法檢測完全酶解的舒洛地特api和注射劑的二糖單元指紋圖譜，并由此判斷產(chǎn)品是否合格的方法。所述方法包括下述步驟：
a、舒洛地特的完全酶解：向濃度為10-200mg/ml的舒洛地特溶液中，加入酶ⅰ∶酶ⅱ∶酶ⅲ＝1∶1∶1的混合酶溶液，室溫下酶解48小時；
b、hplc法分析：取降解產(chǎn)物做sax-hplc分析；
c、二糖單元種類和含量的計算：根據(jù)雙糖的洗脫時間，確定舒洛地特中肝素二糖單元的種類和含量，計算8個雙糖各自所占百分含量；
d、質(zhì)量是否合格的判斷：計算其中8個雙糖各自所占百分含量，觀察其含量是否符合正常范圍，并由此判斷試品舒洛地特質(zhì)量是否合格。
其中，步驟a中所述對應于1mg降解底物的混合酶溶液用量為酶ⅰ∶酶ⅱ∶酶ⅲ＝33miu∶33miu∶33miu。酶ⅰ，酶ⅱ，酶ⅲ分別代表肝素酶ⅰ、肝素酶ⅱ、肝素酶ⅲ，為現(xiàn)有技術產(chǎn)品，可以從市場上購買得到。
步驟a中所述的酶解，是將舒洛地特溶液，緩沖液b，肝素酶ⅰ溶液、肝素酶ⅱ溶液、肝素酶ⅲ溶液混合，放置48小時進行酶解。
步驟b中所述的hplc法，其色譜條件如下：
waters2695型hplc；色譜柱：watersspherisorbs5-sax，4.6mm×250mm×5μm預柱：watersspherisorbsax，4.6mm×10mm×5μm，室溫；流動相為洗提液a和洗提液b梯度洗脫；流速1.10ml/min；進樣量25μl；采集時間64min。
步驟d中所述8種雙糖為：ⅳ-s、ⅱ-a、ⅲ-a、ⅱ-s、ⅲ-s、ⅰ-a、ⅰ-s、ⅳ-a。
以上8種糖均為已知技術，其結構可以從手冊上查到。
步驟d中所述8種雙糖符合標準的含量范圍分別是ⅳ-a(19.66±4.16)、ⅳ-s(11.92±2.26)、ⅱ-a(7.64±0.78)、ⅲ-a(1.81±0.36)、ⅱ-s(9.99±0.55)、ⅲ-s(9.31±0.50)、ⅰ-a(1.07±0.20)、ⅰ-s(39.56±5.96)。以上標準的含量范圍來源于表3。
表3為八批意大利alfawassermann公司舒洛地特注射液酶解產(chǎn)物肝素雙糖種類含量統(tǒng)計分析表。
附圖說明
圖1為三批合格舒洛地特產(chǎn)品酶解產(chǎn)物的sax-hplc圖譜。
具體實施方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實施例1：
a、舒洛地特的完全酶解步驟中溶液的配制：
緩沖液a的配制：稱取68mg的磷酸二氫鉀，用約30ml的超純水溶解后，用1mol/l的氫氧化鈉溶液中和至ph為7，加入10mg的牛白蛋白，移到50ml容量瓶中，用超純水定容，搖勻。
緩沖液b的配制：移取0.58ml的冰醋酸于燒杯中，加入約80ml的超純水，加入32mg的醋酸鈣，并使之溶解。用1mol/l的氫氧化鈉溶液中和至ph為7，加入10mg的牛白蛋白。移到100ml容量瓶中，用超純水定容，搖勻。得到100mm的醋酸鈉溶液。
肝素酶溶液的配制：根據(jù)肝素酶ⅰ、肝素酶ⅱ、肝素酶ⅲ的裝量，用緩沖液a將肝素酶稀釋到0.4iu/ml。保存在≤-20℃的冰箱中。
肝素雙糖標準溶液的配制：用超純水將每個肝素雙糖的凍干粉稀釋到約0.25mg/ml的濃度。將雙糖標準溶液各取20μl于200μl的內(nèi)插管中，混勻。此內(nèi)插管保存在≤-20℃的冰箱中。
舒洛地特鈉樣品溶液的配制：精密稱取20mg的舒洛地特樣品于潔凈試管中，加入1.0ml的超純水溶解，混勻。
8.5％的磷酸溶液的配制：移取8.5ml的磷酸，加入91.5ml的水，混勻，即得。
洗提液a的配制：稱取780mg的磷酸二氫鈉溶于約1800ml的注射用水中，用8.5％的磷酸調(diào)節(jié)ph到3.0，加水至2000ml。用0.22μm的濾膜過濾，即得2.5mmph為3.0的磷酸二氫鈉溶液。
洗提液b的配制：稱取140.7g的一水合高氯酸鈉溶于約800ml的注射用水中，加入390mg的磷酸二氫鈉，用8.5％的磷酸調(diào)節(jié)ph到3.0，加水至1000ml。用0.22μm的濾膜過濾，即得1.0mol/lph為3.0的高氯酸鈉溶液。
b、舒洛地特的完全酶解
于離心管中依次加入20μl的舒洛地特鈉樣品溶液，70μl的緩沖液b和33.3μl肝素酶ⅰ溶液、33.3μl肝素酶ⅱ溶液、33.3μl肝素酶ⅲ溶液，并攪拌徹底。室溫酶解48小時。酶解后移取62μl的酶解液于內(nèi)插管中，
c、取降解產(chǎn)物做sax-hplc分析；采用以下色譜條件：
waters2695型hplc；色譜柱：watersspherisorbs5-sax，4.6mm×250mm×5μm；預柱：watersspherisorbsax，4.6mm×10mm×5μm；室溫；流動相為洗提液a和洗提液b進行梯度洗脫，流速1.1ml/min，進樣量25μl，采集時間64min。洗脫梯度表見表1。
表1：sax-hplc洗脫梯度表
系統(tǒng)平衡好后，先分析標準雙糖溶液，判斷各雙糖峰之間的分離度是否≥1.5。若分離度≥1.5，才可進樣分析。進樣順序為：標準雙糖溶液、樣品的酶解液。圖1為三批合格舒洛地特產(chǎn)品酶解產(chǎn)物的sax-hplc圖譜，按照上述方法三批次完全重合。
數(shù)據(jù)處理：雙糖的洗脫順序如表2。
表2：8種肝素雙糖的洗脫順序和保留時間表
含量計算：雙糖組分的摩爾百分含量＝峰面積/∑面積
d、計算得到的8個雙糖各自所占百分含量，觀察其含量是否符合標準范圍，并由此判斷試品舒洛地特質(zhì)量是否合格。標準范圍的確定，由八批市售品樣品按本專利方法分析雙糖百分含量而得到。
表3為酶解后多批次舒洛地特的肝素雙糖百分含量分析表。其中11775、12415、12497、12885、13478、13766、13495、13982均為意大利alfawassermann公司生產(chǎn)的舒洛地特注射液的產(chǎn)品批號。
表3：八批舒洛地特酶解后肝素雙糖的百分含量分析表