MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置及制備方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測設(shè)備領(lǐng)域，特別涉及一種MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置及其制備方法。利用膠體金免疫層析技術(shù)以及雙抗體夾心法原理定量檢測臨床標本(全血/血清/血漿)中人髓過氧化物酶(MPO)、心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)和心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的檢測裝置及其制備方法，可實現(xiàn)心肌標志物的靈敏、特異、快速檢測。

背景技術(shù)：
急性心肌梗塞(AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。隨著生活水平的提高，其發(fā)病率成逐年上升的趨勢，現(xiàn)已對人類健康和生存造成了重大的威脅，是世界上各國面臨的社會問題。因而，對于因劇烈胸痛就醫(yī)的患者，能夠早期診斷急性心梗，盡早血運重建，搶救缺血心肌，減少急癥病死率，改善患者預后方面有重大的臨床意義。近年來診斷時間與治療效果關(guān)系的報道提示，早期搶救缺血心肌可以減低病死率、縮減梗死面積與改善左室收縮功能。同時發(fā)現(xiàn)降低存活率的關(guān)鍵因素之一是延誤搶救治療時間。自急性冠狀動脈閉塞到心肌發(fā)生透壁性壞死的時間約為6小時，這個時間窗內(nèi)若能夠采用適當方法將急性梗塞冠狀動脈進行血運重建，瀕臨壞死心肌就能夠得到挽救。相關(guān)資料提示，急性心梗發(fā)生后1小時內(nèi)得到有效治療，死亡率在1％以內(nèi)，急性心梗發(fā)生后6小時內(nèi)未得到有效治療，死亡率上升至10-12％，可見6小時是及時診斷與治療重要的時間窗，因此如何縮短急性心梗診斷的檢測時間是醫(yī)學研究的重要課題。冠心病診斷檢查技術(shù)發(fā)展迅速，除了ECG、血清生化指標、心肌損傷標志物之外，另有心臟彩超、心血管造影、核磁共振成像、計算機斷層掃描等等。但是此類檢查手段價格高昂，不適用于動態(tài)連續(xù)監(jiān)測。上述各類檢查手段中，ECG、心肌損傷標志物檢測依然是臨床價格最低廉、使用最廣泛的方法，可是結(jié)果早期診斷急性心梗的特異性僅為90％左右，敏感性僅為45％左右，并且相當部分急性心梗的老年患者的ECG結(jié)果不會見到特異性ST-T改變。近年來的臨床研究資料提示心肌脂肪酸結(jié)合蛋白、髓過氧化酶等標志物變化與急性冠脈綜合征患者的診斷和預后相關(guān)。它們是新一代早期預警心臟生物標示物。髓過氧化物酶(MPO)是冠狀動脈粥樣硬化病灶不穩(wěn)定和中性白細胞應(yīng)激的標志物，也是早期預警信號。MPO是一種過氧化物酶，炎癥時激活的嗜中性粒細胞發(fā)生脫顆粒并釋放髓過氧化物酶，它能導致冠狀動脈粥樣硬化病灶不穩(wěn)定甚至是破裂，使血管內(nèi)皮下膠原組織暴露，隨之發(fā)生血小板粘附聚集和血栓形成，造成冠狀動脈阻塞，發(fā)生急性冠狀動脈綜合癥，甚至是嚴重的心肌不可逆缺血損傷。大量臨床研究資料表明，急性冠狀動脈綜合癥的病人血清中髓過氧化物酶水平顯著地升高，是預測冠心病患者發(fā)生不良心血管事件的一個新的預測因子。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白是一類存在于心肌細胞胞漿內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)，正常人血漿中含量很低，心肌細胞損傷后，此類結(jié)合蛋白將會迅速釋放入血，它的血漿濃度會在急性心梗發(fā)生后1-3小時內(nèi)迅速上升，發(fā)生約8小時后達到峰值，12-24小時逐步降至正常水平，幾乎不受其他組織的干擾；心肌肌鈣蛋白(cTn)是組成橫紋肌絲的結(jié)構(gòu)蛋白，具有調(diào)節(jié)肌細胞收縮功能，其由三種不同基因的亞基：心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和肌鈣蛋白C(TnC)組成，在控制心肌收縮中起重要作用。健康者血清cTnT水平較低，在心肌細胞受損后3～4h釋放入血，血清cTnT濃度升高10～50倍，甚至上百倍，并持續(xù)2周，所以它的有效診斷窗口寬至3小時-14天，是高靈敏度、高特異度的心肌損傷監(jiān)測指標。目前檢測MPO、H-FABP3、cTnT的方法主要有酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、免疫比濁法、金標免疫法等。金標免疫法需要標本量少，簡便快速，適合于急性心肌梗死的快速檢測，不受時間、地點的限制。MPO可以預警1-2月內(nèi)心肌梗塞發(fā)生風險，但其他炎癥也可導致MPO指標的升高。H-FABP僅能表示發(fā)生心肌梗塞后1-3小時的情況，不能在心肌梗塞發(fā)生前預警。縱觀已有產(chǎn)品和文獻報道，它們均是針對單一指標進行控制，只能檢測或預警心肌梗塞的某個階段，而不能全面地、特異性地預警心肌梗塞的發(fā)生、發(fā)展全程。亟待改進。膠體金免疫層析技術(shù)(goldimmunochromatographyassay，GICA)是一種將膠體金標記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合的以微孔濾膜為載體的固相膜免疫分析技術(shù)。膠體金免疫層析技術(shù)是一種常用的免疫層析檢測方法，由于其操作簡單、省時、制造成本較低、結(jié)果易判讀等特點，非常適合于現(xiàn)場檢測，廣泛用于生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。由于膠體金免疫層析技術(shù)是一步完成檢測，因此檢測過程的干擾因素較多，其靈敏度低是限制膠體金免疫層析應(yīng)用范圍的主要因素，傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)的檢測限高于ELISA等方法。在膠體金免疫層析檢測中，蛋白質(zhì)固著于硝酸纖維素膜(NC膜)作為待測樣本的捕獲試劑。由于檢測結(jié)果完全取決于捕獲試劑在膜上達到良好的吸附效果，因此蛋白質(zhì)在膜上均一、良好的吸附對膠體金檢測結(jié)果非常重要。如果NC膜上結(jié)合的蛋白量不足或者蛋白結(jié)合力不夠強，就會出現(xiàn)相當多的問題，在檢測結(jié)果的檢測線上非常明顯。如果膜上結(jié)合的蛋白量太低，那么在結(jié)果中檢測線顯色較弱而且檢測靈敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前發(fā)生擴散，從而導致檢測線較寬、顯色較弱而不是鮮艷而清晰，使檢測結(jié)果難以解釋。在極端條件下，如果蛋白與NC膜的物理吸附作用太弱，流過的蛋白檢測物和表面活性劑溶液可能將固著的蛋白從NC膜上洗掉，從而顯示較寬或者根本不清晰的檢測線，難以解釋檢測結(jié)果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置及制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的NC膜吸附蛋白量不足、結(jié)合力不強的問題。cTnT的有效診斷窗口寬至3小時-14天，因此發(fā)明檢測裝置對心肌梗塞預警及早期診斷具有重要價值。本發(fā)明制備的髓過氧化物酶(MPO)、心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)和心肌肌鈣蛋白T(cTnT)三合一聯(lián)合檢測裝置，可實現(xiàn)心肌標記物的靈敏、特異、快速檢測，提高了對急性心肌跟隨患者進行心梗風險的合理綜合判定，能夠快速、準確進行心肌梗塞早期預警及病情風險判斷。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置，樣品墊1、免疫膠體金玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3、吸收墊4分別粘貼在塑料板5上，所述硝酸纖維素膜3的兩端分別與吸收墊4、免疫膠體金玻璃纖維膜2搭接，所述免疫膠體金玻璃纖維膜2的另一端與樣品墊1搭接；所述硝酸纖維素膜3上設(shè)置第一檢測線T1、第二檢測線T2、第三檢測線T3和質(zhì)控線C，所述的第一檢測線T1上固相有高特異性MPO抗體，所述的第二檢測線T2上固相有高特異性H-FABP抗體，所述的第三檢測線T3上固相有高特異性cTnT抗體，所述的質(zhì)控線C上噴點羊抗鼠IgG多克隆抗體。本發(fā)明提供一種MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置的制備方法，包括如下步驟：(a)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；(b)采用步驟(a)中制得的膠體金標記MPO、H-FABP和cTnT抗體，獲得免疫膠體金；(c)采用噴金緩沖液稀釋步驟(b)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂于玻璃纖維墊，制得免疫膠體金玻璃纖維膜；(d)將硝酸纖維素膜用多聚賴氨酸處理液預處理后，噴點與二氧化硅納米顆粒結(jié)合的MPO、H-FABP和cTnT抗體作為檢測線，噴點羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，制得免疫硝酸纖維素膜；(e)將預處理的樣品墊、步驟(c)制備的免疫膠體金玻璃纖維膜、步驟(d)制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條，最后將檢測試劑條裝入塑料外殼。本發(fā)明步驟(a)所述的采用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金顆粒粒徑為20～60nm。本發(fā)明步驟(c)所述的噴金緩沖液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA組成，pH值8.5，其中Tris-Hcl濃度為0.02mol/L，蔗糖濃度為5～20％，海藻糖濃度為1～5％，牛血清白蛋白BSA濃度為0.5～1％。本發(fā)明步驟(d)所述的將硝酸纖維素膜用多聚賴氨酸處理液預處理是：用多聚賴氨酸處理液浸泡硝酸纖維素膜1h，并慢速振蕩搖晃，取出后用蒸餾水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。本發(fā)明步驟(d)所述的二氧化硅納米顆粒分別結(jié)合MPO、H-FABP和cTnT抗體是：以二氧化硅作為載體，分別取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗體溶液，與乙醇和去離子水攪拌混勻，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，攪拌1小時后，補加剩余正硅酸已酯，持續(xù)攪拌，整個反應(yīng)避光進行，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，無水乙醇、去離子水各洗2遍。本發(fā)明步驟(e)所述的預處理的樣品墊采用的樣品墊處理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性劑聚氧乙烯月桂醚組成，其中Tris-HCL液濃度為0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA濃度為0.5～1％，酪蛋白濃度為0.1～0.2％、表面活性劑聚氧乙烯月桂醚濃度為0.5～1％。本發(fā)明步驟(d)所述的多聚賴氨酸處理液由多聚賴氨酸(SIGMA,150KD～300KD)稀釋到濃度為0.5％組成，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。本發(fā)明步驟(d)所述的多聚賴氨酸處理液由多聚賴氨酸(SIGMA,150KD～300KD)與甲醇混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。本發(fā)明步驟(d)所述的多聚賴氨酸處理液由多聚賴氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、甲醇、PEG20000混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，PEG20000濃度為0.1％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。本發(fā)明步驟(d)所述的二氧化硅納米顆粒制備方法：將2.48mL體積分數(shù)25的氨水和43.2mL無水乙醇混合于錐形瓶中，在35℃左右和超聲條件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超聲5分鐘，即可制得粒徑120nm均一的粒子，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，倒掉上清液，再加水超聲分散，反復多次洗滌至近中性，最后用水定容至體積與剛制備好時的體積相同，存放待用。多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)的結(jié)構(gòu)中含有多個氨基可供偶聯(lián),活化過程簡單，方便NC膜表面固定蛋白。多聚賴氨酸帶有大量的正電荷，可以顯著增加NC膜上活性位點的正電荷數(shù)量，而抗體在常規(guī)包被條件下是帶負電荷的，這樣單位面積的NC膜上可以結(jié)合更多數(shù)量的抗體，這可以顯著增加抗體的包被效率。常規(guī)條件下，單位面積的NC膜上結(jié)合抗體的數(shù)量是有限的，采用多聚賴氨酸處理之后，可以讓單位面積的NC膜上結(jié)合抗體數(shù)量增加，進而可以實現(xiàn)更高的檢測靈敏度。研究發(fā)現(xiàn)甲醇具有良好的重潤濕性，可以保證在預處理NC膜的時候不產(chǎn)生氣泡以免氣泡的存在導致NC膜處理局部不充分，同時也能夠活化NC膜，讓NC膜帶正電荷，這個與聚賴氨酸相似，兩者協(xié)同作用，效果更好。PEG20000可與NC膜的位點發(fā)生吸附作用，在蛋白包被后，可以吸收蛋白的結(jié)合水，導致蛋白更加疏水，這樣蛋白與NC膜的結(jié)合更加牢固，通過疏水作用明顯提高蛋白的包被效率。綜上，多聚賴氨酸、甲醇和PEG20000組合配方，可以從電荷作用和疏水作用兩方面來提高NC膜蛋白的包被效率。在改善NC膜對蛋白吸附基礎(chǔ)上，探討蛋白對NC膜吸附效果也是提高膠體金靈敏度的另一途徑。二氧化硅納米顆粒具有較好的穩(wěn)定性、易于制備、生物相容性較好及較低的免疫原性等優(yōu)勢，在生物醫(yī)學領(lǐng)域研究較為廣泛。但在膠體金免疫層析技術(shù)中尚未有報道應(yīng)用。本研究探討了二氧化硅納米顆粒對NC膜包被抗體的影響，先將劃膜用的抗體先與二氧化硅納米顆粒結(jié)合，封閉，離心純化，去掉未結(jié)合的抗體，然后復溶到一定比例，然后劃膜，這樣一個二氧化硅粒子可以結(jié)合多個抗體，從而增加了包被抗體效率，靈敏度也會大大提高。又由于二氧化硅納米顆粒是無色透明的，所以不會影響顯色，只是借助其更大的表面積增加抗體的包被效率，提高膠體金實驗的靈敏度。為了提高膠體金免疫層析技術(shù)的靈敏度，我們通過對硝酸纖維素膜用多聚賴氨酸處理液進行了預處理，將包被NC的抗體與二氧化硅納米顆粒結(jié)合，達到了提高試紙靈敏度的目的。本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明的檢測裝置結(jié)構(gòu)新穎，將MPO、H-FABP和cTnT抗體包被于硝酸纖維膜膜上，特異性強，既能同時檢測標本中MPO、H-FABP和cTnT，又沒有增加生產(chǎn)操作的復雜度。2、免疫膠體金制備步驟中，通過配合合適的噴金緩沖液和樣品墊處理液，可保證免疫膠體金釋放完全的基礎(chǔ)上，有效的提高了反應(yīng)的靈敏度，同樣的閾值下，還可降低免疫膠體金的用量，節(jié)約成本。3、本發(fā)明對硝酸纖維素膜進行預處理，對包被硝酸纖維素膜的抗體進行了修飾，提高了檢測試紙靈敏度、特異性。4、本發(fā)明的檢測裝置不需要任何特殊儀器設(shè)備，檢測成本低。5、本發(fā)明的檢測裝置操作簡便，不需要專業(yè)人員操作。實用性強。附圖說明圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施方式參見圖1所示，本發(fā)明的MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置，樣品墊1、免疫膠體金玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3、吸收墊4分別粘貼在塑料板5，所述硝酸纖維素膜3的兩端分別與吸收墊4、免疫膠體金玻璃纖維膜2搭接，所述免疫膠體金玻璃纖維膜2的另一端與樣品墊1搭接；所述硝酸纖維素膜3上設(shè)置第一檢測線T1、第二檢測線T2、第三檢測線T3和質(zhì)控線C；所述的第一檢測線T1上固相有高特異性MPO抗體，所述的第二檢測線T2上固相有高特異性H-FABP抗體，所述的第三檢測線T3上固相有高特異性cTnT抗體，所述的質(zhì)控線C上噴點羊抗鼠IgG多克隆抗體。本發(fā)明MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測裝置的制備方法，包括下列步驟：(a)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；(b)采用步驟(a)中制得的膠體金標記MPO、H-FABP和cTnT抗體，獲得免疫膠體金；(c)采用噴金緩沖液稀釋步驟(b)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂于玻璃纖維墊，制得免疫膠體金玻璃纖維膜；(d)將硝酸纖維素膜用多聚賴氨酸處理液預處理后，噴點與二氧化硅納米顆粒結(jié)合的MPO、H-FABP和cTnT抗體作為檢測線，噴點羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，制得免疫硝酸纖維素膜；(e)將預處理的樣品墊、步驟(c)制備的免疫膠體金玻璃纖維膜、步驟(d)制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條，最后將檢測試劑條裝入塑料外殼。步驟(a)所述的采用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金顆粒粒徑為20～60nm。步驟(a)所述的噴金緩沖液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA組成，pH值8.5，其中Tris-Hcl濃度為0.02mol/L，蔗糖濃度為5～20％，海藻糖濃度為1～5％，牛血清白蛋白BSA濃度為0.5～1％。步驟(d)所述的將硝酸纖維素膜用多聚賴氨酸處理液預處理是：用多聚賴氨酸處理液浸泡硝酸纖維素膜1h，并慢速振蕩搖晃，取出后用蒸餾水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。步驟(d)所述的二氧化硅納米顆粒分別結(jié)合MPO、H-FABP和cTnT抗體是：以二氧化硅作為載體，分別取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗體溶液，與乙醇和去離子水攪拌混勻，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，攪拌1小時后，補加剩余正硅酸已酯，持續(xù)攪拌，整個反應(yīng)避光進行，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，無水乙醇、去離子水各洗2遍。步驟(e)所述的預處理的樣品墊采用的樣品墊處理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性劑聚氧乙烯月桂醚組成，其中Tris-HCL液濃度為0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA濃度為0.5～1％，酪蛋白濃度為0.1～0.2％、表面活性劑聚氧乙烯月桂醚濃度為0.5～1％。步驟(d)所述的多聚賴氨酸處理液由多聚賴氨酸稀釋到濃度為0.5％組成，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，多聚賴氨酸，SIGMA,150KD～300KD，備用。步驟(d)所述的多聚賴氨酸處理液由多聚賴氨酸與甲醇混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，多聚賴氨酸，SIGMA,150KD～300KD，備用。步驟(d)所述的多聚賴氨酸處理液由多聚賴氨酸、甲醇、PEG20000混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，PEG20000濃度為0.1％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，多聚賴氨酸，SIGMA,150KD～300KD，備用。步驟(d)所述的二氧化硅納米顆粒制備方法：將2.48mL氨水(體積分數(shù)25)和43.2mL無水乙醇混合于錐形瓶中，在35℃左右和超聲條件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超聲5分鐘，即可制得粒徑120nm均一的粒子，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，倒掉上清液，再加水超聲分散，反復多次洗滌至近中性，最后用水定容至體積與剛制備好時的體積相同，存放待用。實施例1：(a)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金在加熱的100ml純化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸騰后，迅速加入檸檬酸三鈉，氯化金：檸檬酸三鈉1：0.5，繼續(xù)煮沸，觀察溶液顏色由黃色變黑再變紫，最后變成穩(wěn)定的酒紅色后，計時繼續(xù)加熱10分鐘即可，膠體金顆粒為20nm；(b)免疫膠體金制備1)分別取100毫升20nm膠體金溶液，加入pH調(diào)節(jié)劑140μl，混勻；靜置5min；2)在20nm膠體金溶液中，按照每毫升膠體金溶液14μg的比例分別加入MPO、H-FABP和cTnT抗體，共1.4mg，混勻；靜置5min；3)分別按照0.4％的比例加入膠體金穩(wěn)定劑0.4毫升，混勻，靜置5分鐘；4)10000、12000、14000rpm離心10min，分別收集沉淀，合并三次收集的沉淀；(c)、采用優(yōu)化的噴金緩沖液稀釋免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂于玻璃纖維墊，制得免疫膠體玻璃纖維膜；所述的噴金緩沖液包括：濃度為20mMTris-HCL液、蔗糖濃度為5％、海藻糖濃度為1％、BSA濃度為1％，pH為8.5；(d)、固相硝酸纖維素膜1)多聚賴氨酸處理液預處理硝酸纖維素膜配制多聚賴氨酸處理液：多聚賴氨酸(SIGMA,150KD)、濃度為0.5％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用；多聚賴氨酸處理液預處理硝酸纖維素膜：將硝酸纖維素膜放入多聚賴氨酸處理液中浸泡1h，并慢速振蕩搖晃，取出后用蒸餾水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；2)二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體二氧化硅納米顆粒制備：將2.48mL體積分數(shù)25的氨水和43.2mL無水乙醇混合于錐形瓶中，在35℃左右和超聲條件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超聲5分鐘，即可制得粒徑120nm均一的粒子，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，倒掉上清液，再加水超聲分散.反復多次洗滌至近中性，最后用水定容至體積與剛制備好時的體積相同，存放待用；二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體：以二氧化硅作為載體，分別取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗體溶液，與乙醇和去離子水攪拌混勻，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，攪拌1小時后，補加剩余正硅酸已酯，持續(xù)攪拌，整個反應(yīng)避光進行，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，無水乙醇、去離子水各洗2遍；3)硝酸纖維素膜檢測線與質(zhì)控線抗體的包被當噴膜量為1.4μl/cm，將二氧化硅納米顆粒-MPO抗體、二氧化硅納米顆粒-H-FABP和二氧化硅納米顆粒-cTnT稀釋至1.5mg/ml，質(zhì)控線羊抗鼠IgG抗體稀釋至1mg/ml，分別包被硝酸纖維素膜的檢測線與質(zhì)控線，室溫干燥過夜，儲存?zhèn)溆茫?)、樣品墊預處理將玻璃纖維用樣品墊處理液浸泡10min，其種樣品墊處理液包括：Tris-HCL液濃度為0.1M、牛血清白蛋白BSA濃度為0.5％、酪蛋白濃度為0.1％、表面活性劑濃度為0.5％，37℃烘干備用，經(jīng)處理后樣品墊可提高反應(yīng)靈敏度；e、組裝將預處理的樣品墊、免疫膠體金玻璃纖維膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條，最后將檢測試劑條裝入塑料外殼。f、定量檢測：通過膠體金檢測儀檢測，本聯(lián)合檢測裝置檢測人MPO最低檢測濃度為5ng/ml、H-FABP最低檢測濃度為5ng/ml、cTnT最低檢測濃度為0.1ng/ml。實施例2：(a)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金在加熱的100ml純化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸騰后，迅速加入檸檬酸三鈉，氯化金：檸檬酸三鈉1：1，繼續(xù)煮沸，觀察溶液顏色由黃色變黑再變紫，最后變成穩(wěn)定的酒紅色后，計時繼續(xù)加熱10分鐘即可，膠體金顆粒為40nm；(b)免疫膠體金制備1)分別取100毫升40nm膠體金溶液，加入pH調(diào)節(jié)劑140μl，混勻；靜置5min；2)在20nm膠體金溶液中，按照每毫升膠體金溶液14μg的比例分別加入MPO、H-FABP和cTnT抗體，共1.4mg，混勻；靜置5min；3)分別按照0.4％的比例加入膠體金穩(wěn)定劑0.4毫升，混勻，靜置5分鐘；4)10000、12000、14000rpm離心10min，分別收集沉淀，合并三次收集的沉淀；(c)、采用優(yōu)化的噴金緩沖液稀釋免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂于玻璃纖維墊，制得免疫膠體玻璃纖維膜；所述的噴金緩沖液包括：濃度為20mMTris-HCL液、蔗糖濃度為5％、海藻糖濃度為1％、BSA濃度為1％，pH為8.5；(d)、固相硝酸纖維素膜1)多聚賴氨酸處理液預處理硝酸纖維素膜配制多聚賴氨酸處理液：多聚賴氨酸(SIGMA,200KD)、濃度為0.5％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用；多聚賴氨酸處理液預處理硝酸纖維素膜：將硝酸纖維素膜放入多聚賴氨酸處理液中浸泡1h，并慢速振蕩搖晃，取出后用蒸餾水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；2)二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體二氧化硅納米顆粒制備：將2.48mL體積分數(shù)25的氨水和43.2mL無水乙醇混合于錐形瓶中，在35℃左右和超聲條件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超聲5分鐘，即可制得粒徑120nm均一的粒子，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，倒掉上清液，再加水超聲分散.反復多次洗滌至近中性。最后用水定容至體積與剛制備好時的體積相同，存放待用；二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體：以二氧化硅作為載體，分別取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗體溶液，與乙醇和去離子水攪拌混勻，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，攪拌1小時后，補加剩余正硅酸已酯，持續(xù)攪拌，整個反應(yīng)避光進行，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，無水乙醇、去離子水各洗2遍；3)硝酸纖維素膜檢測線與質(zhì)控線抗體的包被當噴膜量為1.4μl/cm，將二氧化硅納米顆粒-MPO抗體、二氧化硅納米顆粒-H-FABP和二氧化硅納米顆粒-cTnT稀釋至1.5mg/ml，質(zhì)控線羊抗鼠IgG抗體稀釋至1mg/ml，分別包被硝酸纖維素膜的檢測線與質(zhì)控線，室溫干燥過夜，儲存?zhèn)溆茫?)、樣品墊預處理將玻璃纖維用樣品墊處理液浸泡10min，其種樣品墊處理液包括：Tris-HCL液濃度為0.1M、牛血清白蛋白BSA濃度為0.5％、酪蛋白濃度為0.1％、表面活性劑濃度為0.5％，37℃烘干備用，經(jīng)處理后樣品墊可提高反應(yīng)靈敏度；e、組裝將預處理的樣品墊、免疫膠體金玻璃纖維膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條，最后將檢測試劑條裝入塑料外殼。f、定量檢測：通過膠體金檢測儀檢測，本聯(lián)合檢測裝置檢測人MPO最低檢測濃度為5.5ng/ml、H-FABP最低檢測濃度為5.5ng/ml、cTnT最低檢測濃度為0.15ng/ml。實施例3：(a)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金在加熱的100ml純化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸騰后，迅速加入檸檬酸三鈉，氯化金：檸檬酸三鈉1：0.5，繼續(xù)煮沸，觀察溶液顏色由黃色變黑再變紫，最后變成穩(wěn)定的酒紅色后，計時繼續(xù)加熱10分鐘即可，膠體金顆粒為20nm；(b)免疫膠體金制備1)分別取100毫升20nm膠體金溶液，加入pH調(diào)節(jié)劑140μl，混勻；靜置5min；2)在20nm膠體金溶液中，按照每毫升膠體金溶液14μg的比例分別加入MPO、H-FABP和cTnT抗體，共1.4mg，混勻；靜置5min；3)分別按照0.4％的比例加入膠體金穩(wěn)定劑0.4毫升，混勻，靜置5分鐘；4)10000、12000、14000rpm離心10min，分別收集沉淀，合并三次收集的沉淀；(c)、采用優(yōu)化的噴金緩沖液稀釋免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂于玻璃纖維墊，制得免疫膠體玻璃纖維膜；所述的噴金緩沖液包括：濃度為20mMTris-HCL液、蔗糖濃度為5％、海藻糖濃度為1％、BSA濃度為1％，pH為8.5；(d)、固相硝酸纖維素膜1)多聚賴氨酸處理液預處理硝酸纖維素膜配制多聚賴氨酸處理液：多聚賴氨酸(SIGMA,150KD)、濃度為0.5％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用；多聚賴氨酸處理液預處理硝酸纖維素膜：將硝酸纖維素膜放入多聚賴氨酸處理液中浸泡1h，并慢速振蕩搖晃，取出后用蒸餾水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；2)二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體二氧化硅納米顆粒制備：將2.48mL體積分數(shù)25的氨水和43.2mL無水乙醇混合于錐形瓶中，在35℃左右和超聲條件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超聲5分鐘，即可制得粒徑120nm均一的粒子，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，倒掉上清液，再加水超聲分散.反復多次洗滌至近中性，最后用水定容至體積與剛制備好時的體積相同，存放待用；二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體：以二氧化硅作為載體，分別取1mLMPO、H-FABP和cTnT抗體溶液，與乙醇和去離子水攪拌混勻，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，攪拌1小時后，補加剩余正硅酸已酯，持續(xù)攪拌，整個反應(yīng)避光進行，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，無水乙醇、去離子水各洗2遍；3)硝酸纖維素膜檢測線與質(zhì)控線抗體的包被當噴膜量為1.4μl/cm，將二氧化硅納米顆粒-MPO抗體、二氧化硅納米顆粒-H-FABP和二氧化硅納米顆粒-cTnT稀釋至1.5mg/ml，質(zhì)控線羊抗鼠IgG抗體稀釋至1mg/ml，分別包被硝酸纖維素膜的檢測線與質(zhì)控線，室溫干燥過夜，儲存?zhèn)溆茫?)、樣品墊預處理將玻璃纖維用樣品墊處理液浸泡10min，其種樣品墊處理液包括：Tris-HCL液濃度為0.1M、牛血清白蛋白BSA濃度為0.5％、酪蛋白濃度為0.1％、表面活性劑濃度為0.5％，37℃烘干備用，經(jīng)處理后樣品墊可提高反應(yīng)靈敏度；e、組裝將預處理的樣品墊、免疫膠體金玻璃纖維膜、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條，最后將檢測試劑條裝入塑料外殼；f、定量檢測：通過膠體金檢測儀檢測，本聯(lián)合檢測裝置檢測人MPO最低檢測濃度為6ng/ml、H-FABP最低檢測濃度為6ng/ml、cTnT最低檢測濃度為0.2ng/ml。實施例4：配制多聚賴氨酸處理液：由多聚賴氨酸(SIGMA,150KD)與甲醇混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。其余同實施例2。實施例5：配制多聚賴氨酸處理液：由多聚賴氨酸(SIGMA,200KD)與甲醇混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。其余同實施例2。實施例6：配制多聚賴氨酸處理液：由多聚賴氨酸(SIGMA,300KD)與甲醇混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。其余同實施例2。實施例7：配制多聚賴氨酸處理液：由多聚賴氨酸(SIGMA,150KD)、甲醇、PEG20000混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，PEG20000濃度為0.1％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用；其余同實施例2。實施例8：配制多聚賴氨酸處理液：由多聚賴氨酸(SIGMA,200KD)、甲醇、PEG20000混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，PEG20000濃度為0.1％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用；其余同實施例2。實施例9：配制多聚賴氨酸處理液：由多聚賴氨酸(SIGMA,300KD)、甲醇、PEG20000混合組成，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，PEG20000濃度為0.1％，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用；其余同實施例2。下邊通過實驗來進一步說明本發(fā)明的效果。實驗例1：1、多聚賴氨酸處理液對硝酸纖維素膜蛋白吸附能力的比較1.1材料與方法1.1材料：硝酸纖維素膜，孔徑4.5um，購自美國通用電氣公司，多聚賴氨酸(SIGMA,150KD)購自Sigma公司1.2硝酸纖維素膜處理方法1.2.1配制多聚賴氨酸處理液配制三種多聚賴氨酸處理液：多聚賴氨酸組，多聚賴氨酸濃度為0.5％組成；多聚賴氨酸處理液甲醇組，多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％；多聚賴氨酸、甲醇和PEG20000組，，其中多聚賴氨酸濃度為0.5％組成，甲醇濃度為10％，PEG20000濃度為0.1％，三組處理液均經(jīng)0.22μm濾膜過濾，備用。1.2.2硝酸纖維素膜處理方法將硝酸纖維素膜放入多聚賴氨酸處理液中浸泡1h，并慢速振蕩搖晃，取出后用蒸餾水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。1.3實驗方法分別將未處理和已處理過的硝酸纖維素膜按照上述實施例工藝流程制備MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測試紙，測試流程參照試紙說明書，比較硝酸纖維素膜未處理和處理后吸附力和穩(wěn)定性指標差異。1.4結(jié)果1.4.1蛋白吸附力比較取3組處理組和未處理組試紙，分別加入待檢樣品，通過觀察顯色情況判斷處理后膜對蛋白吸附能力，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，處理后的硝酸纖維素膜在溶液浸潤性方面要明顯優(yōu)于未處理膜，處理后膜陽性條帶顏色略深，尤其在濃度較低時，提高了反應(yīng)的靈敏度，表明蛋白吸附能力明顯增強，提高了反應(yīng)靈敏度。多聚賴氨酸、甲醇和PEG20000處理組吸附效果明顯優(yōu)于多聚賴氨酸組和多聚賴氨酸甲醇組。表1硝酸纖維素膜吸附能力比較1.4.2硝酸纖維素膜穩(wěn)定性比較取3組處理組和未處理組試紙，通過37℃加速實驗觀察顯色情況來判斷處理后硝酸纖維素膜上吸附蛋白的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。表2結(jié)果與表1結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，處理后硝酸纖維素膜顏色變化與10天前基本一致，穩(wěn)定性好。表2硝酸纖維素膜加速穩(wěn)定性比較(37℃放置10天)實驗例2：2、二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體2.1材料與方法2.1.1材料：硝酸纖維素膜，孔徑4.5um，購自美國通用電氣公司，正硅酸乙酯購自汕頭隴西化工廠2.1.2二氧化硅納米顆粒制備將2.48mL氨水(體積分數(shù)25)和43.2mL無水乙醇混合于錐形瓶中，在35℃左右和超聲條件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超聲5分鐘，即可制得粒徑均一的粒子(120nm)。分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，倒掉上清液，再加水超聲分散.反復多次洗滌至近中性。最后用水定容至體積與剛制備好時的體積相同，存放待用。2.1.3二氧化硅納米顆粒修飾MPO、H-FABP和cTnT抗體以二氧化硅作為載體，取1mLMPO、cTnI和NT-proBNP抗體溶液，與乙醇和去離子水攪拌混勻，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，攪拌1小時后，補加剩余正硅酸已酯，持續(xù)攪拌，整個反應(yīng)避光進行，分別以12000rpm，8500rpm和7000rpm離心10分鐘收集，無水乙醇、去離子水各洗2遍。2.3實驗方法分別將二氧化硅納米顆粒修飾的MPO、H-FABP和cTnT抗體與未修飾的MPO、H-FABP和cTnT體按照上述實施例工藝流程制備MPO、H-FABP和cTnT聯(lián)合檢測試紙，測試流程參照試紙說明書，比較二氧化硅納米顆粒處理和未處理對蛋白吸附力和穩(wěn)定性指標差異。2.4結(jié)果2.4.1蛋白吸附力比較取二氧化硅納米顆粒處理組和未處理組試紙，分別加入待檢樣品，通過觀察顯色情況判斷處理后膜對蛋白吸附能力，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，二氧化硅納米顆粒修飾組膜陽性條帶顏色略深，尤其在濃度較低時，提高了反應(yīng)的靈敏度，表明蛋白吸附能力明顯增強，提高了反應(yīng)靈敏度。表3二氧化硅納米顆粒修飾對蛋白吸附能力比較2.4.2穩(wěn)定性比較取二氧化硅納米顆粒處理組和未處理組試紙，通過37℃加速實驗觀察顯色情況來判斷二氧化硅修飾后硝酸纖維素膜上吸附蛋白的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。表4結(jié)果與表3結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，處理后硝酸纖維素膜顏色變化與10天前基本一致，穩(wěn)定性好。表4加速穩(wěn)定性比較(37℃放置10天)以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡對本發(fā)明所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。