本發(fā)明涉及一種納米熒光探針，具體是一種利用bodipy染料小分子自組裝的納米粒子對鋅離子進(jìn)行檢測的方法。

背景技術(shù)：

鋅是人體含量最豐富的微量元素之一，大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合，作為輔因子或者結(jié)構(gòu)單元，在細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)、信號傳輸、基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。人體嚴(yán)重的鋅缺乏很少見，但少量或者中等程度的鋅缺乏在世界范圍內(nèi)普遍存在。流行病學(xué)研究表明，鋅缺乏與特異性皮膚紊亂、乳腺癌和卵巢癌、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，實(shí)現(xiàn)對人體中鋅離子的高靈敏檢測，具有重要意義。

傳統(tǒng)的鋅離子檢測方法有原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、離子色譜法等，這些方法雖早已成熟并準(zhǔn)確可靠，但實(shí)際應(yīng)用中存在著儀器昂貴、操作復(fù)雜、維護(hù)困難、不方便攜帶等缺點(diǎn)，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用以及實(shí)時原位檢測的需要。熒光檢測法因?yàn)椴僮骱唵?、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)而成為研究的熱點(diǎn)，并且被廣泛應(yīng)用。

大量有機(jī)小分子熒光探針已被報導(dǎo)用于鋅離子的檢測，他們大都是通過改變熒光團(tuán)或者鋅離子識別單元而被巧妙地設(shè)計而成，主要根據(jù)光致電子轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、共振能量轉(zhuǎn)移等機(jī)理進(jìn)行鋅離子的識別。但是，這些探針普遍存在合成步驟繁瑣，機(jī)理復(fù)雜等問題。與反復(fù)利用這些成熟的機(jī)理來設(shè)計新的探針相比，對新的識別機(jī)理的探索和研究相對少很多，也顯得非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鋅離子的檢測方法，另一個目的是提供一種鋅離子的定量檢測方法，本發(fā)明還提供了一種人類頭發(fā)樣品中鋅離子的定量檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

bodipy染料小分子在水溶液介質(zhì)中發(fā)生聚集，自組裝為納米粒子而導(dǎo)致熒光淬滅，通過加入鋅離子，熒光恢復(fù)，在一定時間內(nèi)混合后得到的產(chǎn)物在600nm波長處的熒光強(qiáng)度變化與加入的鋅離子濃度成正比關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)鋅離子的定量測定。

所述bodipy染料小分子，其結(jié)構(gòu)式為：

所述方法具體包括以下步驟：

步驟1.制備自組裝納米粒子：bodipy染料小分子溶于有機(jī)溶劑中得到染料溶液a，bodipy染料小分子在有機(jī)溶劑中的物質(zhì)的量濃度為0.01-1mm，往濃度為1-50mm、ph＝7.4的hepes緩沖溶液中注入染料溶液a，hepes緩沖溶液與染料溶液a中的有機(jī)溶劑的體積比為9∶1-99∶1，優(yōu)選體積比范圍為25∶2-50∶1，充分混勻得到溶液b，備用；

步驟2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取不少于5個不同濃度的已知鋅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，與步驟1中制備的溶液b混合，使得混合后的溶液c中鋅離子濃度為0.1-300μm，室溫下孵育0.5-50分鐘后，用熒光分光光度計進(jìn)行發(fā)射光譜掃描并記錄熒光強(qiáng)度，以590-620nm任意一處波長的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，鋅離子濃度為橫坐標(biāo)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

步驟3.得到鋅離子線性方程：鋅離子濃度范圍在0-10μm時，600nm波長處的線性方程為i＝153.11c+288.06，所述i表示600nm處的熒光強(qiáng)度，c表示鋅離子濃度。

步驟4.利用該方法對人類頭發(fā)樣品中鋅離子的檢測：對人類頭發(fā)樣品進(jìn)行清洗、烘干處理，取樣品于微波消解罐中，加入消解液，按固定消解過程進(jìn)行消解，消解后得到的液體轉(zhuǎn)移至燒杯中，于電爐上加熱至液體剛好蒸干，往燒杯中加入0.5-5ml去離子水，在超聲清洗器振蕩后，加入1-50ml濃度為1-50mm、ph＝7.4的hepes緩沖溶液，加入pbs粉末振蕩，進(jìn)行離心后取上清液，加入溶于有機(jī)溶劑中濃度為0.01-1mm的bodipy溶液，充分混勻后，室溫下孵育0.5-50min后，用熒光分光光度計進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，得到熒光強(qiáng)度，將熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，代入步驟3所述的鋅離子線性方程式中，得到鋅離子的濃度。

所述有機(jī)溶劑包括乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、甲苯、環(huán)己烷、乙腈、三氯甲烷、四氫呋喃、四氯化碳、乙醚、乙酸乙酯、異丙醇、吡啶、二甲亞砜中的一種或幾種。

所述光譜掃描所采用的激發(fā)光和發(fā)射光狹縫均為5nm，激發(fā)波長為573nm，測定的波長范圍為580-630nm，獲得其熒光光譜。

所述消解液的組成為65％的硝酸和30％的雙氧水體積比范圍為5∶1-10∶1，人類頭發(fā)樣品與消解液的質(zhì)量比范圍為1∶2000-1∶500，hepes緩沖 溶液和有機(jī)溶劑的體積比范圍為9∶1-99∶1，pbs的加入量與待測溶液的質(zhì)量比范圍為1∶1000-1∶40。

所述人類頭發(fā)樣品進(jìn)行清洗、烘干處理步驟為將人類頭發(fā)樣品用洗發(fā)水、丙酮、去離子水洗滌之后，烘至恒重，剪成小于1cm的發(fā)段于干燥器中保存。

所述固定消解過程包括：預(yù)消解8-20h后，將消解罐安裝到微波消解儀上，按照130℃，10-50min；150℃，5-30min；180℃，10-80min的程序進(jìn)行消解。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明方法簡單、選擇性好，適用于復(fù)雜樣品人頭發(fā)中鋅離子的測定，具有良好的應(yīng)用前景。

2.本發(fā)明利用的是染料小分子自組裝的納米粒子實(shí)現(xiàn)對鋅離子的定量測定，屬于“off-on”類型的熒光探針。當(dāng)檢測對象中不存在鋅離子時，染料小分子處于聚集自組裝為納米粒子的狀態(tài)，熒光被淬滅；而當(dāng)檢測對象中有鋅離子存在時，染料小分子聚集的納米粒子與鋅離子作用，使得熒光恢復(fù)，并且熒光強(qiáng)度隨著鋅離子含量的增加而增強(qiáng)，通過比較熒光強(qiáng)度，即可實(shí)現(xiàn)鋅離子的檢測。

附圖說明

圖1為不同濃度的鋅離子加入到自組裝納米粒子溶液之后熒光光譜變化圖。

圖2a為600nm處的熒光強(qiáng)度與不同的鋅離子濃度的關(guān)系示意圖，圖2b為600nm處熒光強(qiáng)度與鋅離子濃度的線性關(guān)系。

圖3為向自組裝納米粒子溶液中加入鋅離子和干擾離子后600nm處熒光強(qiáng)度的變化。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例包括以下步驟：

1.自組裝納米粒子的制備：往0.95ml濃度為5mm、ph＝7.4的hepes緩沖溶液中注入50μl溶于dmf中的濃度為0.1mm的bodipy小分子溶液，充分混勻后得到自組裝的納米粒子，備用。

2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取150μl步驟1中得到的溶液，分別加入1.5μl的不同濃度的鋅離子標(biāo)準(zhǔn)液，使混合溶液中鋅離子的濃度分別為2、5、8、10、20、30、40、50μm，孵育10min后，留作測定用。另取150μl步 驟1中得到的溶液，加入1.5μl去離子水作為空白對照體系溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照溶液置于光程為1cm的熒光比色皿中，進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，獲得熒光光譜，如圖1所示，隨著加入鋅離子濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。

如圖2所示，取其中600nm處的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，溶液中鋅離子濃度作為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于對未知濃度鋅離子溶液的分析，其中，鋅離子濃度在0-10μm范圍內(nèi)時，熒光強(qiáng)度與鋅離子濃度呈線性關(guān)系，線性關(guān)系方程式為i＝153.11c+288.06，所述i表示600nm處的熒光強(qiáng)度，c表示鋅離子濃度，檢測限為61.3nm。當(dāng)鋅離子濃度大于10μm，600nm處熒光強(qiáng)度與鋅離子濃度不再具有線性關(guān)系。

3.選擇性試驗(yàn)：取150μl步驟1中得到的溶液，分別加入1.5μlzn²⁺和干擾離子ca²⁺，mg²⁺，na⁺，k⁺，fe³⁺，cu²⁺，mn²⁺，pb²⁺，al³⁺的標(biāo)準(zhǔn)液，使溶液中離子的濃度均為10μm，孵育10min后，進(jìn)行發(fā)射光譜掃描。計算600nm處各離子存在時熒光強(qiáng)度與空白溶液熒光強(qiáng)度的差值，如圖3所示。只有當(dāng)鋅離子存在時，納米粒子的熒光才會明顯增強(qiáng)，同時，銅離子存在時，熒光信號會減弱，表明此檢測體系對鋅離子具有很好的選擇性。

4.濃度測定：取142.5μl溶于hepes緩沖溶液(5mm、ph＝7.4)中的濃度為5μm的鋅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入7.5μl溶于dmf中的濃度為0.1mm的bodipy小分子溶液，充分混勻后，至于室溫下10min后，用熒光分光光度計進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，得到熒光強(qiáng)度，將600nm處的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到鋅離子的濃度為5.2μm，與實(shí)際濃度非常接近。

步驟2，3，4中發(fā)射光譜具體的掃描條件為：激發(fā)光狹縫5cm，發(fā)射光狹縫：5cm，激發(fā)光波長573nm，掃描波長范圍：580-630nm。

實(shí)施例2：

1.人頭發(fā)樣品中鋅離子的測定：收集人頭發(fā)樣品，用洗發(fā)水清洗一遍之后，用去離子水洗滌10次，然后浸入在丙酮溶液中2小時，再用去離子水洗滌10次，于烘箱下80℃烘至恒重，用不銹鋼剪刀剪成小于1cm的發(fā)段，放置干燥器中保存。稱取9.84g發(fā)段至微波消解罐中，加入8ml65％的硝酸以及1ml30％的雙氧水，室溫下放置10h，將消解罐安裝到微波消解儀上，按程序“130℃，10min；150℃，5min；180℃，40min”在480w的功率下進(jìn)行消解，消解后得到的液體轉(zhuǎn)移至50ml的燒杯中，于電爐上加熱至液體剛好蒸干，往燒杯中加入1ml去離子水，在超聲清洗器中振蕩2min，加入9ml濃度為5mm、ph＝7.4的hepes緩沖溶液，取1.8ml溶液至2ml的塑料離心管中，加入10mgpbs粉末振蕩2min后，于 4,000g，20℃下離心5min，取142.5μl上清液，加入7.5μl溶于dmf中的濃度為0.1mm的bodipy小分子溶液，充分混勻后，至于室溫下10min后，用熒光分光光度計進(jìn)行光譜掃描，得到熒光強(qiáng)度，將600nm處的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，i＝153.11c+288.06中，所述i表示600nm處的熒光強(qiáng)度，c表示鋅離子濃度，得到鋅離子的濃度為3.64μm。發(fā)射光譜具體的掃描條件為：激發(fā)光狹縫5cm，發(fā)射光狹縫：5cm，激發(fā)光波長573nm，掃描波長范圍：580-630nm。

2.準(zhǔn)確性驗(yàn)證：本實(shí)驗(yàn)測定了5份人頭發(fā)樣品，均進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)回收率在83.8％-112.6％之間。并且，用該方法檢測出的鋅離子濃度與電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測出的濃度一致，說明該方法準(zhǔn)確可靠。