本發(fā)明屬于電化學生物傳感器研究領(lǐng)域，涉及一種納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法。

背景技術(shù)：

一方面癌胚抗原是一種廣譜性的腫瘤標記物，在多種腫瘤的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預后估計中有著重要的作用；另一方面，實際樣本中的癌胚抗原含量往往很低，需要研究和設(shè)計高靈敏度和高選擇性的檢測方法來實現(xiàn)癌胚抗原的檢測。為了提高癌胚抗原的檢測靈敏度和選擇性，各種癌胚抗原檢測方法也應(yīng)運而生，在各種檢測方法中實現(xiàn)癌胚抗原的特異性識別和信號放大成為研究的重點。

在蛋白質(zhì)的檢測中，最常用的識別分子是抗體。但是抗體的制備過程復雜、制備費用高，而且抗體分子要在一定的條件下才能保持活性，影響著檢測方法的靈敏度和適用范圍。為了解決這一難題，最近幾十年出現(xiàn)了一種新的識別分子——核酸適體。核酸適體是一種能夠特異性識別靶分子的寡聚核苷酸片段，對可結(jié)合的靶分子有嚴格的識別能力和高度的親和性，并且其制備過程簡單、制備費用較低、存儲和使用條件沒有抗體嚴格。核酸適體自被發(fā)現(xiàn)以來得到大家廣泛研究和應(yīng)用。

在信號放大過程中常用的有核酸擴增技術(shù)，納米材料和酶等。目前常用的核酸擴增技術(shù)有聚合酶鏈式反應(yīng)和一些等溫核酸擴增技術(shù)如滾環(huán)復制擴增等。聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)需要嚴格控制溫度的變化，因而需要比價復雜的反應(yīng)儀器，成本較高；而滾環(huán)復制擴增過程也需要加入反應(yīng)模版，從而增加了反應(yīng)體系的復雜程度，增加了成本。為了解決這些問題，一種新的核酸擴增技術(shù)表面誘導末端延伸技術(shù)應(yīng)運而生，這種在末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶催化的無需模版的在核酸3’末端延伸核酸長鏈的核酸放大技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。納米材料因為其特有的尺寸性質(zhì)，在信號放大策略中得到發(fā)揮著不可替代的作用。而金納米粒子有高的表面體積比、制備工藝較成熟、穩(wěn)定性好、生物相容性好，易于功能化(特別是可以通過金-硫鍵將核酸修飾在金納米粒子表面)等優(yōu)點。酶催化作用能夠在引入一個酶分子的情況下催化多個底物的反應(yīng)而使信號得到放大，也在信號放大策略中扮演著不可忽視的角色。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了高靈敏和高選擇性地檢測痕量的癌胚抗原，提供一種納米探針誘導酶聚合放大的電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種納米探針誘導酶聚合放大的電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，包括如下步驟：

步驟一、納米探針的制備：在金納米粒子溶液中緩慢加入5’末端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針溶液，反應(yīng)后陳化，然后離心、洗滌、離心、重懸；

步驟二、電化學傳感器的制備：(a)金電極的清洗：以NaBH₄溶液浸泡后打磨，然后超聲清洗；(b)自清潔表面的制備：室溫下在金電極表面自組裝3’末端標記巰基的癌胚抗原核酸適體捕獲探針溶液，然后用OEG室溫下浸泡封閉，得到自清潔表面；(c)納米探針的修飾：在自清潔表面滴加癌胚抗原溶液反應(yīng)不少于1小時，滴加納米探針溶液反應(yīng)不少于1小時；(d)末端延伸：在末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，在步驟(c)修飾到金電極表面的5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的3’端延伸生物素標記的核酸長鏈，加入親和素標記的辣根過氧化物酶反應(yīng)不少于15min，通過生物素-親和素相互作用，在電極表面修飾辣根過氧化物酶，制得電化學傳感器；

步驟三、電化學信號檢測：將制備完成的電化學傳感器放在三電極體系中以循環(huán)伏安法和時間電流曲線法進行檢測，得到電化學信號。

步驟一中，采用的重懸溶劑為含有1wt％吐溫的PBS溶液，其中金納米粒子的粒徑為30nm，其溶液濃度為1nmol/L；5’末端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的溶液濃度為0.5-15μmol/L。

步驟二(b)中，3’端巰基標記癌胚抗原捕獲探針的濃度為0.5-5μmol/L，自組裝時間不小于4小時；HS-(CH₂)₁₁-EG2-OH(OEG)濃度為0.5-2.5mmol/L，浸泡時間不小于4小時。

步驟二(d)中，末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的濃度為1U，生物素標記的核苷酸為生物素標記的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，濃度為5.7μmol/L，延伸時間不小于1小時。

步驟三中，電化學檢測體系為三電極體系，工作電極為金電極，參比電極為Ag/AgCl 電極，對電極為鉑絲電極，其中，電解液為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)，循環(huán)伏安法掃描高電位為0.7V，低電位為0V，掃描速度為0.1V/s；時間電流曲線法的掃描電位為0.1V，掃描時間為100s。

步驟一和二中，所述核酸適體序列如下：所述的5’末端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針序列為：5’-SH-TTT TTT TTT TCC CAT AGG GAA GTG GGG GA-3’；所述的3’末端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針序列為：5’-TTA ACT TAT TCG ACC ATA TTT TTT TTT T-SH-3’。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點：

1、檢測靈敏度高：本發(fā)明對癌胚抗原的檢測下限低于10fg/ml，在現(xiàn)有的癌胚抗原檢測傳感器中處于較高的靈敏度水平。

2、檢測的范圍寬：本發(fā)明對DNA的檢測范圍寬度大于8個數(shù)量級，在現(xiàn)有的癌胚抗原傳感器中處于較寬的檢測寬度。

3、檢測體系簡單：本發(fā)明使用的檢測方法為簡單的電化學檢測，對樣本的顏色沒有要求，靈敏度高，并且易于簡單化和微型化。

4、實際應(yīng)用性強：本發(fā)明的癌胚抗原傳感器在模擬的血清樣本中仍然具有較高的檢測信號，說明本傳感器在實際樣本中的應(yīng)用性強，有很高的臨床診斷方面應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明納米探針誘導的酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原方法的過程示意圖。

圖2是本發(fā)明實施例1的納米探針吸光度曲線，其中，A中a為未修飾5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的吸光度曲線，b為修飾5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的吸光度曲線；B中，c為納米金加了氯化鈉后的吸光度曲線，d為納米探針加氯化鈉的吸光度曲線。

圖3是本發(fā)明實施例2-4中的條件優(yōu)化結(jié)果圖，其中A為實施例2，B為實施例3，C為實施例4。

圖4是本發(fā)明實施例5中的對不同濃度癌胚抗原的檢測電流圖。

圖5是本發(fā)明實施例6中的相同濃度下前列腺特異性抗原、小牛血清白蛋白和癌胚抗原的檢測電流對比圖。

圖6是本發(fā)明實施例7中在緩沖溶液和血清中相同濃度癌胚抗原檢測電流對比圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，其目的是為了更好理解本發(fā)明的內(nèi)容，但所舉的實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍：

如附圖1中所示的步驟，搭建納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器體系，并進行電化學檢測。

(1)電化學傳感器檢測癌胚抗原體系的建立

a、金電極清洗：1)NaBH₄溶液浸泡(往NaBH₄固體中先加入一定體積的無水乙醇，再加入等體積的雙蒸水，混勻后將電極浸泡在其中，浸泡15分鐘，用雙蒸水沖洗掉NaBH₄溶液)2)打磨(在磨布上倒上一定量的Al₂O₃粉末，然后加上少量水，將電極垂直在磨布上打磨3分鐘，用超純水沖洗干凈)3)超聲清洗(先用乙醇超聲清洗4-5分鐘，再用雙蒸水超聲清洗4-5分鐘，用雙蒸水沖洗)4)電化學掃描(以0.5mol/L的H₂SO₄為電解液，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，對金工作電極進行電化學掃描。先進行慢掃，然后加2V電壓電解5秒，再加-0.35V電壓電解10秒，而后快速掃描2次，清洗電極并且換H₂SO₄后慢掃1次，觀察掃描的循環(huán)伏安圖，若最后一次慢掃得到的兩條曲線完全重合，并且氧化峰有四個，還原電流是最低電流的40倍，則判斷電極清洗干凈)清洗干凈的電極用N₂吹干，沒有洗干凈的電極則需要重復清洗步驟。

b、自清潔表面制備：1)以5×PBS稀釋3’末端巰基標記的癌胚抗原核酸適體捕獲探針至所需濃度得到組裝液，在清洗干凈并用N₂吹干的電極表面滴加3μL組裝液，使組裝液覆蓋在金電極表面，確保組裝液與金電極表面完全接觸，且液滴中不含有氣泡，在電極上加蓋1.5ml離心管以減少反應(yīng)過程中組裝液的蒸發(fā)且避免雜質(zhì)進入組裝液，在室溫下反應(yīng)4小時以上。2)以無水乙醇稀釋OEG至所需濃度，分裝在2 ml離心管中，100μL/管，將組裝好的電極用PBS溶液沖洗10秒，并用N₂吹干，然后將電極表面浸泡在制備好的封閉液中，確保電極表面與封閉液完全接觸沒有氣泡，用密封膜纏好離心管與電極，減少封閉液的蒸發(fā)，室溫下反應(yīng)4h以上。

c、癌胚抗原免疫結(jié)合：以PBS稀釋癌胚抗原溶液至所需濃度得到雜交液，將OEG處理后的電極用PBS沖洗10秒，且用N₂吹干，然后將稀釋的雜交液滴加3μL在干燥的電極表面，在電極上加蓋1.5ml離心管，在反應(yīng)過程中減少組裝液的蒸發(fā)且避免雜質(zhì)進入組裝液，在室溫下反應(yīng)1小時。

d、信號探針的修飾：將免疫結(jié)合后的電極用PBS溶液沖洗10秒，并且用N₂吹干，吹干后的電極表面滴加3μL納米探針溶液，加蓋1.5ml離心管后，室溫下反應(yīng)1小時。

e、末端延伸：將免疫結(jié)合后的電極用PBS溶液沖洗10秒，并且用N₂吹干，吹干后的電極表面滴加3μL末端延伸液(末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的濃度為1U，底物為濃度5.7μmol/L的生物素標記腺嘌呤脫氧核糖核苷酸)，加蓋1.5ml離心管后，室溫下反應(yīng)1小時。確保延伸液與金電極表面完全接觸。

f、辣根過氧化物酶標記：將延伸后的電極用PBS溶液沖洗，并且用N₂吹干，吹干后的電極表面滴加3μL生物素標記辣根過氧化物酶溶液，加蓋1.5ml離心管后，室溫下反應(yīng)15分鐘。

(2)電化學信號的檢測

將標記好辣根過氧化物酶的電極用PBS溶液沖洗，以市售3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)為電解液，用三電極體系進行檢測，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑電極。循環(huán)伏安圖的高電位為0.7V，低電位為0V，掃描速度為0.1V/s；時間電流曲線的實驗電位為0.1V，試驗時間為100秒。

實施例1：納米探針的制備

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，首先要制備納米探針。納米探針制備步驟如下：將1000mL的金納米粒子溶液離心濃縮至300μL，其終濃度約為1nmol/L；緩慢加入不同體積的濃度為100μmol/L的5’末端巰基標記的癌胚抗原核酸適體信號探針溶液，；以350rpm轉(zhuǎn)速振 蕩反應(yīng)16小時后加入等體積0.02mol/L PBS(PH＝7，0.2mol/L NaCl)，陳化40小時；以10000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，加入0.01mol/L PBS(PH＝7，0.1mol/L NaCl)，10000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，以含1wt％吐溫的PBS(0.01M，0.25M NaCl)溶液重懸，制得納米探針溶液。對制備的納米探針溶液進行紫外檢測，考察其粒徑變化，其結(jié)果如圖2A所示，a為未修飾5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的吸光度曲線，b為修飾5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針后的吸光度曲線，表明在修飾5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針前后金納米粒子的粒徑?jīng)]有發(fā)生很大的變化，也即在修飾過程中很好地控制了團聚現(xiàn)象；對制備的納米探針溶液進行穩(wěn)定性考察，結(jié)果如圖2B所示，在加入0.5mmol/L氯化鈉之后，c為未修飾的金納米粒子溶液由紅色變?yōu)樽仙?50nm處的吸光度增強，d為納米探針溶液保持紅色不變，吸光度曲線沒有變化，說明納米探針溶液在高鹽溶液中有更好的穩(wěn)定性，也說明了納米探針溶液的制備是成功的。

實施例2：5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針濃度對電化學信號檢測結(jié)果的影響。

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液為目標物，搭建納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器體系，所有操作步驟如上所述，其中組裝的3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度為3μmol/L，封閉液OEG的濃度為1mmol/L，癌胚抗原的濃度為1μg/mL，納米探針采用實施例1中所述的納米探針制備步驟，其中加入的5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的終濃度為0.6、1.5、3、6和15μmol/L，制備得到一系列的納米探針溶液，分析不同的5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針濃度對檢測電化學信號的影響，其分析結(jié)果如附圖3A所示，5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針濃度低于3μmol/L，隨著濃度的增加信噪比增強，高于3μmol/L，隨著濃度的增加信噪比減弱，因此5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的較優(yōu)濃度為3μmol/L。

實施例3：3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針組裝密度對電化學信號檢測結(jié)果的影響。

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗 原的方法，以癌胚抗原溶液為目標物，所有操作步驟實施例2所述，其中封閉液OEG的濃度為1mmol/L，癌胚抗原的濃度為1μg/mL，納米探針采用實施例1中所述的納米探針制備步驟，其中加入的5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的終濃度為3μmol/L，組裝的3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度為0.5、1、2、3和5μmol/L，分析不同的組裝密度對檢測電化學信號的影響，其分析結(jié)果如附圖3B所示，3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度低于3μmol/L，隨著濃度的增加信噪比增強，高于3μmol/L，隨著濃度的增加信噪比減弱，因此3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針的較優(yōu)濃度為3μmol/L。

實施例4：OEG封閉濃度對電化學檢測結(jié)果的影響。

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液為目標物，所有操作步驟如實施例2所述，其中組裝的3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度為3μmol/L，癌胚抗原的濃度為1μg/mL，納米探針采用實施例1中所述的納米探針制備步驟，其中加入的5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的終濃度為3μmol/L，封閉液OEG的濃度為0.5、1、1.5和2mmol/L，分析不同的封閉濃度對檢測電化學信號的影響，其分析結(jié)果如附圖3C所示，OEG濃度低于1mmol/L，隨著濃度的增加信噪比增強，高于1mmol/L，隨著濃度的增加信噪比減弱，因此OEG的較優(yōu)濃度為1mmol/L。

實施例5：納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法對不同濃度癌胚抗原的檢測特性。

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液為目標物，所有操作步驟如實施例所述，其中組裝的3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度為3μmol/L，封閉液OEG的濃度為1mmol/L癌胚抗原的濃度為100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL，納米探針采用實施例1中所述的納米探針制備步驟，其中加入的5’端巰基標記癌胚抗原核酸適體信號探針的終濃度為3μmol/L，分析不同濃度癌胚抗原的電化學信號響應(yīng)特性，分析結(jié)果如圖4所示，在該檢測范圍內(nèi)，電化學信號隨癌胚抗原濃度的增加而升高，檢測限低于100fg/mL。

實施例6：納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法 對PBS溶液、前列腺特異性抗原、小牛血清白蛋白、癌胚抗原電化學信號對比。

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，所有操作步驟如實施例2所述，其中組裝的3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度為3μmol/L，封閉液OEG的濃度為1mmol/L待測目標的濃度為1μg/mL，其中目標物為PBS溶液、前列腺特異性抗原溶液、小牛血清白蛋白溶液和癌胚抗原溶液，分析結(jié)果如圖5所示由圖可知，本發(fā)明的電化學傳感器檢測癌胚抗原的方法特異性強。

實施例7：納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法對緩沖液及血清中癌胚抗原的電化學信號對比。

采用本發(fā)明所述的納米探針誘導酶聚合放大電化學核酸適體傳感器檢測癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液為目標物，所有操作步驟如實施例2所述，其中組裝的3’端巰基標記癌胚抗原核酸適體捕獲探針濃度為3μmol/L，封閉液OEG的濃度為1mmol/L待測目標物的濃度為0、10和100pg/mL，其中目標物的緩沖液為PBS溶液和血清，分析結(jié)果如圖6所示，由圖可知，本發(fā)明的電化學傳感器檢測癌胚抗原的方法能有實現(xiàn)血清樣本中的癌胚抗原檢測，顯示了很好的實際運用前景。