降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，包括底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素和吸水墊；所述試紙條由樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素、吸水墊依次搭接粘貼在底板上構(gòu)成。所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊含有鏈霉親和素標(biāo)記熒光蛋白和生物素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體；所述硝酸纖維膜上有檢測線和質(zhì)控線，檢測線被降鈣素原單克隆抗體，其與上述生物素標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體具有不同的識別表位。本實(shí)用新型與目前常見的檢測PCT的方法相比(如：化學(xué)發(fā)光法/免疫增強(qiáng)比濁法/膠體金法)，不僅大大縮短了檢測時間，同時還提高了檢測靈敏度。
【專利說明】降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條。

【背景技術(shù)】
[0002]降鈣素原(procalcitonin，PCT)是降鈣素的前肽，是由116氨基酸組成、分子量為13KD、無激素活性的糖蛋白。PCT由神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(包括甲狀腺、肺和胰腺組織細(xì)胞)表達(dá)，經(jīng)酶切分解為降鈣素(CT)、羧基端肽和氨基端肽。
[0003]PCT在人體內(nèi)半衰期為20?24h，穩(wěn)定性好，在正常人血清中水平極低。但在全身性細(xì)菌感染或霉菌、寄生蟲感染者血清中含量迅速升高，特別是膿毒性休克時PCT時濃度成倍升高，感染后兩個小時即可檢測到，且持續(xù)時間長，其在血清中的水平與感染性疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，經(jīng)有效抗生素治療后，PCT水平可迅速下降；而病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病、外傷(多創(chuàng)傷或手術(shù)創(chuàng)傷)、慢性炎癥以及局部感染者，PCT水平維持在正常范圍內(nèi)或者有輕度升高。因此，PCT是細(xì)菌感染所致重癥全身性炎癥反應(yīng)的良好指標(biāo)，在全身性細(xì)菌感染和膿毒癥輔助鑒別診斷、預(yù)后判斷、療效觀察、等方面有很高的臨床價值；利用它能有效地評估感染和炎癥的嚴(yán)重程度及進(jìn)展情況，還能監(jiān)測藥物療效，指導(dǎo)外科圍手術(shù)期的處理以及抗生素正確應(yīng)用。
[0004]目前檢測PCT的常用方法有:
[0005]酶聯(lián)免疫法:此法采用雙抗體夾心法，用人工合成的PCT單克隆抗體檢測。方法特異性較高，無交叉反應(yīng)，但檢測過程繁瑣，耗時較長(一小時至數(shù)小時)，且不能靈活進(jìn)行單個及零散樣本檢測。
[0006]金標(biāo)法:此法用一個結(jié)合有膠體金的抗PCT的單克隆小鼠抗體和抗PCT的多克隆綿羊抗體進(jìn)行檢測。此法不依賴儀器，操作方便快速，但檢測靈敏度較差。
[0007]免疫熒光法:是一種定量的免疫學(xué)檢測方法，采用兩個抗原特異性抗體與PCT兩個不同抗原結(jié)合微點(diǎn)結(jié)合，一種抗體經(jīng)熒光標(biāo)記固定在管壁上，兩種抗體分別與血漿或血清中的PCT分子結(jié)合，熒光信號強(qiáng)度與PCT的濃度成正比。其檢測特性性和靈敏度較高，需結(jié)合一起進(jìn)行檢測，但檢測時間較長，成本較高，1-2小時內(nèi)完成。
[0008]化學(xué)發(fā)光免疫法:此法是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的方法。其既具有免疫反應(yīng)的特異性，更兼有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性，但是檢測周期很長，需要30分鐘至數(shù)小時，不利于快速提交檢測報告，特別是對于急診病人的抗生素使用判斷上有很大的局限性,且成本較高。
[0009]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system, BAS),是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應(yīng)用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，成為研究免疫反應(yīng)的有力工具。由于BAS檢測系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速，又無放射物質(zhì)污染，不需復(fù)雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應(yīng)用的可能性。
[0010]生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個生物素，因幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制降鈣素原檢測試快速診斷試劑尚無報道。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0011]本實(shí)用新型的目的，在于提供一種降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條。使用本實(shí)用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0012]本實(shí)用新型解決其技術(shù)問題的解決方案是:降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的PCT單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別PCT另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0013]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0014]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0015]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0016]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗為長方形孔。
[0017]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白等中的一種。
[0018]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0019]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0020]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0021]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本實(shí)用新型將熒光蛋白作為標(biāo)記物，此標(biāo)記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0023](2)本實(shí)用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0024](3)利用本實(shí)用新型進(jìn)行降鈣素原的檢測時間不大于10分鐘，檢測線性范圍為0.10ng/ml?100.0Ong/ml,極大地提高了檢測效率。
[0025](4)本實(shí)用新型可通過熒光免疫分析儀對結(jié)果進(jìn)行判讀，可實(shí)現(xiàn)自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0026](5)本使用新型卡殼設(shè)有樣品進(jìn)入的加樣孔和供觀測結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠。
[0027](6)本實(shí)用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0028](7)本實(shí)用新型檢測成本較低。
[0029](8)本實(shí)用新型可批量生產(chǎn)，適用于臨床快速診斷和現(xiàn)場快速診斷；易于保存，有利于基層單位推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]為了更清楚地說明本實(shí)用新型實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單說明。顯然，所描述的附圖只是本實(shí)用新型的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他設(shè)計方案和附圖。
[0031]圖1是本實(shí)用新型實(shí)施例一的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖2是本實(shí)用新型實(shí)施例二的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033]圖3是本實(shí)用新型實(shí)施例三的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034]圖4是本實(shí)用新型實(shí)施例四的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0035]以下將結(jié)合實(shí)施例和附圖對本實(shí)用新型的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行清楚、完整地描述，以充分地理解本實(shí)用新型的目的、特征和效果。顯然，所描述的實(shí)施例只是本實(shí)用新型的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，基于本實(shí)用新型的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的其他實(shí)施例，均屬于本實(shí)用新型保護(hù)的范圍。另外，文中所提到的所有聯(lián)接/連接關(guān)系，并非單指構(gòu)件直接相接，而是指可根據(jù)具體實(shí)施情況，通過添加或減少聯(lián)接輔件，來組成更優(yōu)的聯(lián)接結(jié)構(gòu)。
[0036]參照圖1，降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其包括底板5，所述底板5上依次設(shè)有樣品墊1、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4，所述吸水墊4和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2分別交疊壓在硝酸纖維素膜3的兩端后在硝酸纖維素膜3的表面形成檢測區(qū)，熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2為玻璃纖維膜，所述樣品墊I交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上固定有生物素標(biāo)記的PCT單克隆抗體(濃度0.3?1.5mg/mL)和鏈霉親和素標(biāo)記(或親和素)的熒光蛋白(使用激發(fā)光波長530nm，發(fā)射光波長570nm，濃度0.1?1.0mg/mL);所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜3上固定有識別PCT另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測線T (濃度0.5?3mg/mL)和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線C(濃度0.2?2.0mg/mL),質(zhì)控線C用于檢測試紙條的有效性。
[0037]將生物素標(biāo)記的PCT單克隆抗體和鏈霉親和素(或親和素)標(biāo)記的熒光蛋白固定在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上，將有識別PCT另外一個表位的單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體固定于硝酸纖維素膜上分別作為檢測線T和質(zhì)控線C。當(dāng)待測樣品加到樣品墊I上后，通過層析作用向前移動，樣品中PCT與熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2上結(jié)合熒光標(biāo)記物(熒光蛋白)的PCT抗體(Mab-PCT*Fluoro)反應(yīng)形成復(fù)合物PCT-Mab_PCT*Fluoro，在層析作用下反應(yīng)復(fù)合物繼續(xù)向前移動經(jīng)過硝酸纖維膜3上包被的PCT抗體(檢測線)時，反應(yīng)復(fù)合物被包被的PCT抗體捕獲形成復(fù)合物(Mab-PCT-PCT-Mab-PCT*Fluoro)(檢測線T)，通過熒光免疫分析儀讀取檢測線的反應(yīng)信號，在激發(fā)光源的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射特定波長的熒光信號，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號，通過信號轉(zhuǎn)化及設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線自動轉(zhuǎn)化為定量數(shù)值，計算出樣本中PCT的濃度，得到降鈣素原檢測結(jié)果。
[0038]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，參照圖3，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊20和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊21，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊20的一端墊在樣品墊I的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊21交疊壓在硝酸纖維素膜3的一端。熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2的分層設(shè)置，便于將熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2安裝在樣品墊I和硝酸纖維素膜3之間。
[0039]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，參照圖3所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊20中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條22，所述樣品墊I的下端面設(shè)有能容納定位條22的定位槽。通過定位條22便于熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2和樣品墊I之間的安裝固定。
[0040]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，參照圖2和圖4，還包括卡殼，所述底板5、樣品墊1、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4均置于卡殼6內(nèi)，所述卡殼6殼面上對應(yīng)于硝酸纖維膜3的位置設(shè)有觀察窗8，卡殼6殼面上對應(yīng)于樣品墊I的位置設(shè)有加樣孔7。
[0041]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗8為長方形孔。
[0042]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白等中的一種。
[0043]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊I為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。樣品墊由玻璃纖維構(gòu)成，經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理，干燥后使用。所述樣品墊I的裁剪寬度為0.3?0.5cm
[0044]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板5為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0045]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼6包括塑料上殼60和塑料下殼61,所述塑料上殼61扣合塑料下殼61上后形成卡殼6。
[0046]以上是對本實(shí)用新型的較佳實(shí)施方式進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本實(shí)用新型精神的前提下還可作出種種的等同變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的PCT單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別PCT另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述觀察窗為長方形孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白等中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降鈣素原免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于:所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
【文檔編號】G01N33/542GK204188616SQ201420645295
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】王小明, 夏坤, 佟順剛 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司