一種定量檢測(cè)降鈣素原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種定量檢測(cè)降鈣素原的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 降鈣素原（procalcitonin，PCT)是無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，降鈣素僅在甲 狀腺的C細(xì)胞受到激素性刺激時(shí)才產(chǎn)生，降鈣素原可由很多器官的不同類型細(xì)胞在受到促 炎癥反應(yīng)刺激特別是受到細(xì)菌引起的刺激后分泌。
[0003] 降鈣素原是一種能特異性區(qū)分細(xì)菌感染和其它原因?qū)е碌难装Y反應(yīng)的重要標(biāo)志 物，當(dāng)嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時(shí)，其在血漿中的水平升 高。臨床資料顯示，PCT濃度>0.Ing/mL時(shí)說明存在臨床相關(guān)的細(xì)菌感染，需要采用抗生素 進(jìn)行治療；當(dāng)PCT濃度>0. 5ng/mL時(shí)，要考慮患者可能有發(fā)展成重癥敗血癥或敗血癥性休克 的危險(xiǎn)。PCT反映了全身炎癥反應(yīng)的活躍程度。影響PCT水平的因素包括被感染器官的大 小和類型、細(xì)菌的種類、炎癥的程度和免疫反應(yīng)的狀況。檢測(cè)病例中PCT濃度的變化，有利 于判斷機(jī)體細(xì)菌感染情況，評(píng)判機(jī)體健康狀況，對(duì)臨床和基礎(chǔ)性研宄都有重要意義。
[0004] 自上世紀(jì)80年代以后，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)隨著單克隆抗體、人工合成多肽、基因工 程表達(dá)抗原及各種標(biāo)記技術(shù)的成熟而迅速發(fā)展，免疫比濁法、速率散射比濁法（INA)、膠乳 增強(qiáng)透射比濁法（ITA)與化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)逐漸取代傳統(tǒng)的免疫沉淀、免疫凝集物，使檢 測(cè)更為快捷，近些年快速檢測(cè)（P0CT)的應(yīng)用使免疫學(xué)操作更為簡(jiǎn)單、方便。
[0005] 目前，多種免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于PCT檢測(cè)，既可以定性，亦可以定量。常用方 法有放射免疫分析法（RIA)、酶標(biāo)免疫分析法（ELISA)、膠體金法、定量化學(xué)發(fā)光免疫分析 (CLIA)，但以上方法在應(yīng)用過程中均存在缺陷。放射免疫（RIA)、酶標(biāo)免疫（ELISA)靈敏度 較高，但操作復(fù)雜、產(chǎn)品有效期短；膠體金操作簡(jiǎn)單快捷，但不能定量檢測(cè)；定量化學(xué)發(fā)光 免疫檢測(cè)需要較長(zhǎng)時(shí)間且檢測(cè)成本高。因此還需要研發(fā)一種新的檢測(cè)降鈣素原的方法，以 便于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中的降鈣素原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種定量檢測(cè)降鈣素原的方法，其穩(wěn)定性、線性、準(zhǔn)確 性均有顯著提高。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 將待檢測(cè)樣品與熒光標(biāo)記的抗降鈣素原第一抗體混合，得到含降鈣素原抗原抗體 復(fù)合體的反應(yīng)液；將該反應(yīng)液在反應(yīng)介質(zhì)中分別與抗降鈣素原第二抗體、降鈣素原抗原反 應(yīng)，分別檢測(cè)熒光信號(hào)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)得熒光信號(hào)值獲得待檢測(cè)樣品中降鈣素原的含 量。
[0009] 作為優(yōu)選，所述熒光標(biāo)記所用的熒光素為AlexaFluor系列熒光素。
[0010] 作為優(yōu)選，所述反應(yīng)介質(zhì)為試紙條。
[0011] 更優(yōu)選地，所述抗降鈣素原第二抗體、降鈣素原抗原固定在同一反應(yīng)介質(zhì)的不同 位置。
[0012] 本發(fā)明提供的定量檢測(cè)降鈣素原方法是一項(xiàng)基于免疫熒光法的定量檢測(cè)技術(shù)，結(jié) 合了雙抗體夾心法與競(jìng)爭(zhēng)法，將待測(cè)樣本與含熒光標(biāo)記的抗降鈣素原第一抗體的緩沖液在 試劑瓶中進(jìn)行混合得反應(yīng)液，混合液中的熒光標(biāo)記PCT抗體和樣本的PCT抗原結(jié)合形成抗 原抗體復(fù)合物；取反應(yīng)液在反應(yīng)介質(zhì)中與抗降鈣素原第二抗體反應(yīng)，捕獲待測(cè)樣品中含有 的降鈣素原與熒光標(biāo)記的抗降鈣素原抗體復(fù)合物，檢測(cè)、收集第一熒光信號(hào)；取所得反應(yīng)液 在反應(yīng)介質(zhì)中與降鈣素原抗原反應(yīng)，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)液中的熒光標(biāo)記的抗降鈣素原抗體，檢 測(cè)，收集第二熒光信號(hào)；根據(jù)第一熒光信號(hào)、第二熒光信號(hào)及標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算獲得待檢測(cè)樣 品中降鈣素原的含量。
[0013] 優(yōu)選的方案是所述反應(yīng)介質(zhì)為試紙條，所述抗降鈣素原第二抗體、降鈣 素原抗原固定在反應(yīng)介質(zhì)的不同位置，利用免疫層析法進(jìn)行檢測(cè)。免疫層析法 (immunochromatography)其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該 干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品后，由于毛細(xì)作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，用免疫膠體金或免疫 熒光標(biāo)記從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫檢測(cè)。
[0014] 試紙條上固定了抗降鈣素原第二抗體的位置為檢測(cè)線，當(dāng)混合樣本滴到試紙條并 通過毛細(xì)作用擴(kuò)散到硝酸纖維素膜的檢測(cè)線上，熒光標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物被檢測(cè)線上的 PCT第二抗體所捕獲。待測(cè)樣本中的PCT抗原越多，檢測(cè)線上的復(fù)合物積聚得越多，熒光抗 體的信號(hào)越強(qiáng)。
[0015] 試紙條上固定了抗降鈣素原的位置為質(zhì)控線，當(dāng)混合樣本滴到試紙條并通過毛細(xì) 作用擴(kuò)散到硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上，熒光標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物被質(zhì)控線上的PCT抗原 所捕獲。血液樣本中的PCT抗原越多，質(zhì)控線上的復(fù)合物積聚得越少，熒光抗體的信號(hào)越 弱。
[0016] 用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)試紙條，儀器分別各自收集檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光信號(hào) 累加值，用各自的累加值計(jì)算出相應(yīng)的比值。把已知濃度和相對(duì)應(yīng)的比值帶入計(jì)算公式得 出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度值。
[0017] 本發(fā)明提供的定量檢測(cè)降鈣素原的方法運(yùn)用了雙抗夾心法與競(jìng)爭(zhēng)法相結(jié)合的技 術(shù)。具體地，在試紙條定量檢測(cè)降鈣素原的過程中，檢測(cè)線利用雙抗夾心法，質(zhì)控線利用競(jìng) 爭(zhēng)法。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)成功將兩種技術(shù)融合到了一起，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證 明該方法用于定量檢測(cè)待測(cè)樣品中降鈣素原含量特異性好、線性范圍好、準(zhǔn)確度高。
[0018] -般情況下，雙抗夾心法用于大分子的檢測(cè)；競(jìng)爭(zhēng)法用于小分子的檢測(cè)，小分子屬 于半抗原，沒有兩個(gè)或兩個(gè)以上位點(diǎn)結(jié)合抗體，故用競(jìng)爭(zhēng)法。降鈣素原是大分子物質(zhì)，現(xiàn)有 的檢測(cè)方法中多只采用夾心法原理進(jìn)行檢測(cè)，但在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)夾心法的線性相關(guān) 性不理想，影響了其準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性，有效期也相對(duì)較短。目前，還沒有關(guān)于利用兩種不同的 檢測(cè)原理用于檢測(cè)降鈣素原的相關(guān)報(bào)道，這與降鈣素原分子量大、容易引起非特異性結(jié)合 有關(guān)。
[0019] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中，熒光標(biāo)記的抗降鈣素原抗 體所用的熒光素為AlexaFluor系列熒光素。
[0020] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，熒光標(biāo)記的抗降鈣素原抗體所用的熒光素為 AlexaFluor?647〇
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑中，抗降鈣素原抗體、降鈣素原抗原固定在同一反應(yīng)介 質(zhì)中的兩個(gè)不同位置。更為優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑中，所述反應(yīng)介質(zhì)具體為試紙條，試 紙條中固定有抗降鈣素原抗體、降鈣素原抗原，且抗降鈣素原抗體、降鈣素原抗原分別固定 在兩個(gè)不同的位置，分別為檢測(cè)線、質(zhì)控線。
[0022] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的試劑盒包含PCT反應(yīng)板，含有固化 了抗降鈣素原抗體的檢測(cè)線和固化了降鈣素原抗原的質(zhì)控線。
[0023] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括PCT檢測(cè)緩沖液、 PCT反應(yīng)板、取樣器和ID芯片；PCT檢測(cè)緩沖液被分裝在試劑管中；PCT反應(yīng)板有獨(dú)立包裝， 內(nèi)有干燥劑；PCT檢測(cè)緩沖液與PCT反應(yīng)板各自組裝成盒，分開運(yùn)輸。
[0024] 本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)降鈣素原的方法，本發(fā)明提供的方法包括：取待檢測(cè) 樣品，與熒光標(biāo)記的抗降鈣素原抗體混合，得反應(yīng)液；取反應(yīng)液與抗降鈣素原第二抗體反 應(yīng)，捕獲待測(cè)樣品中含有的降鈣素原與熒光標(biāo)記的抗降鈣素原抗體復(fù)合物，檢測(cè)、收集第一 熒光信號(hào)；取所得反應(yīng)液與降鈣素原抗原反應(yīng)，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)液中的熒光標(biāo)記的抗降鈣素 原抗體，檢測(cè)，收集第二熒光信號(hào)；根據(jù)第一熒光信號(hào)、第二熒光信號(hào)，計(jì)算獲得待檢測(cè)樣品 中降鈣素原的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提供的定量檢測(cè)降鈣素原的試劑盒穩(wěn)定性高、線 性好、準(zhǔn)確性高，使用方便。
[0025] 本發(fā)明降鈣素原（PCT)定量測(cè)定試劑盒（熒光免疫層析法）由PCT檢測(cè)緩沖液、 PCT反應(yīng)板、取樣器、ID芯片等組分構(gòu)成。其制備工藝概括如下：
[0026] (l)PCT檢測(cè)緩沖液：檢測(cè)緩沖液中含有5% -25%熒光標(biāo)記的抗人PCT單克隆抗 體，含有5% -15%穩(wěn)定劑為BSA溶液，防腐劑為0. 1% -0. 3%疊氮鈉溶液。
[0027] (2)PCT反應(yīng)板：反應(yīng)板含有固化了抗人PCT單克隆抗體的檢測(cè)線和固化了抗人 PCT抗原的質(zhì)控線。
[0028] 從原理上得出，本發(fā)明所述方法融合了夾心法與競(jìng)爭(zhēng)法兩種方法，更能有效的防 止漏檢現(xiàn)象的發(fā)生；兩種方法的融合加之有效的算法使有效期時(shí)間更長(zhǎng)；兩種方法的融 合，線性關(guān)系R2值更好。本發(fā)明克服了競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用于大分子的技術(shù)難點(diǎn)，其穩(wěn)定性、線性、 準(zhǔn)確性都有顯著提高，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1示實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，直線1的PCT反應(yīng)板包括，檢測(cè)線為抗人PCT單 克隆抗體，質(zhì)控線為