一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種黃病毒科瘟病毒屬的動(dòng)物病毒鑒別檢測(cè)器具，特別是涉及一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙，由支撐板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，檢測(cè)膜上含有豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)T1“│”，牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2“│”和質(zhì)控線(xiàn)C“│”印跡。鑒別檢測(cè)時(shí)，在檢測(cè)膜顯現(xiàn)三條紅色條帶“│││”為豬瘟病毒感染或免疫并混合牛病毒性腹瀉病毒感染，在豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顯現(xiàn)兩條紅色條帶“│ │”為豬瘟病毒感染或免疫，在牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顯現(xiàn)兩條紅色條帶“││”為牛病毒性腹瀉病毒感染，只顯現(xiàn)一條紅色條帶“│”為豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒陰性。本鑒別檢測(cè)試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)，敏感性高，反應(yīng)譜廣，且操作簡(jiǎn)便、快速，可廣泛用于豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測(cè)，易于在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種黃病毒科瘟病毒屬的動(dòng)物病毒鑒別檢測(cè)器具，特別是涉及一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙。

【背景技術(shù)】
[0002]豬痕病毒(ClasscalSwine Fever Virus, CSFV)和牛病毒性腹?寫(xiě)病毒(BovineViral Diarrhea Virus, BVDV)同屬于黃病毒科(Flaviridae)痕病毒屬的成員，它們所引起的傳染病給養(yǎng)豬、養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]豬痕((Classical swine fever, CSF))是由豬痕病毒引起的一種以高熱、出血和高死亡率為特征的高度接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入OIE疫病名錄，為須申報(bào)的動(dòng)物傳染病，我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。豬瘟只感染豬和野豬，豬瘟病毒可以在其它動(dòng)物體內(nèi)增值，但不引起發(fā)病。CSFV基因組為線(xiàn)狀單股正鏈RNA，長(zhǎng)約1.23X 104nt，含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架(0RF)，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Ems、El和E2)以及8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)。CSFV 只有一個(gè)血清型，可分為 3 個(gè)基因群和10個(gè)基因亞群，雖然不同毒株間存在顯著的抗原差異，但目前還沒(méi)有找出毒力強(qiáng)弱的抗原標(biāo)志。豬痕兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized vaccine, HCLV)是我國(guó)上世紀(jì)五十年代研制的世界公認(rèn)的優(yōu)良疫苗，安全性好、免疫原性好、遺傳性狀穩(wěn)定，可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，能對(duì)不同基因亞群產(chǎn)生免疫保護(hù)，預(yù)防和控制了 CSF的大規(guī)模流行，至今地位和價(jià)值無(wú)可動(dòng)搖。但是，近年來(lái)CSF的流行和發(fā)病特點(diǎn)又發(fā)生了新變化，多表現(xiàn)為非典型、慢性和隱性感染，出現(xiàn)了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”，仍是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。引起非典型豬瘟主要原因，是豬群免疫活疫苗后，豬群個(gè)體間抗體水平參差不齊，豬群中有的豬瘟抗體水平遠(yuǎn)高于發(fā)病保護(hù)臨界點(diǎn)，有的僅稍高于或低于發(fā)病保護(hù)臨界點(diǎn)，使豬瘟野毒株與只有部分免疫力豬體組織互相作用，達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡作用，兩者相互作用在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，對(duì)豬瘟免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)性損害，造成非典型豬瘟。因此，加強(qiáng)免疫監(jiān)測(cè)手段，并在免疫監(jiān)測(cè)下進(jìn)行有效的疫苗接種是防制豬瘟的重要措施。
[0004]牛病毒性腹瀉病毒主要引起牛的病毒性腹瀉，表現(xiàn)為腹瀉、急慢性黏膜病、免疫耐受和持續(xù)性感染、免疫抑制、繁殖障礙、血小板減少和出血癥等，它不僅感染牛，而且能夠感染豬、綿羊、山羊、鹿、駱駝及其他野生動(dòng)物。本病呈世界性分布，嚴(yán)重危害牛、羊、豬、鹿等養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。BVDV基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約1.23~1.25X 104nt，包括5’非翻譯區(qū)(untranslatedreg1n, 5’UTR)—個(gè)大開(kāi)放閱讀框，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E?s、El和E2)以及8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npr。、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B),以及一個(gè)3，非翻譯區(qū)(3’UTR)。根據(jù)5’UTR序列的差異，BVDV可分為BVDV-1型和BVDV-2型，BVDV-1型和BVDV-2型引起的臨床癥狀和發(fā)病特點(diǎn)有明顯不同。BVDV-1型普遍用于疫苗生產(chǎn)、診斷和研究，包括許多經(jīng)典株和常見(jiàn)的疫苗株，所引起的癥狀常常為一過(guò)性發(fā)熱、下痢和急慢性粘膜?。欢鳥(niǎo)VDV-2型大多是弱毒或無(wú)毒，是產(chǎn)生持續(xù)性感染的重要原因。目前國(guó)外主要采取疫苗接種和淘汰持續(xù)感染牛為主的綜合防治措施。我國(guó)由于試制的疫苗效果不理想，且對(duì)該病的重視程度不夠等多方面的因素，尚無(wú)有效的BVDV疫苗使用，使得該病在我國(guó)呈逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)。
[0005]CSFV和BVDV在核苷酸序列上約66%具有同源性，氨基酸約85%同源性，二者在病毒粒子結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)和抗原特性方面均很接近，在免疫學(xué)上存在廣泛的交叉性。Fernelius等(1973)首次從自然感染發(fā)病的豬體內(nèi)分離到BVDV，從而在病原學(xué)上證明BVDV可以自然感染豬。近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明我國(guó)豬群中BVDV感染已經(jīng)比較嚴(yán)重，送檢的樣品中部分批次樣品陽(yáng)性率高達(dá)80.72%。造成這種情況的原因是由于豬通過(guò)與BVDV牛群的直接接觸或通過(guò)污染BVDV的豬瘟疫苗而感染了 BVDV，感染BVDV后產(chǎn)生類(lèi)似慢性豬瘟的臨床癥狀和病理變化，并可產(chǎn)生豬瘟病毒的交叉中和抗體，單憑臨床癥狀病理變化及常規(guī)的血清學(xué)方法是難以鑒別的，給豬病的診斷和防治帶來(lái)新的難題。
[0006]針對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)畜群中豬瘟及牛病毒性腹瀉流行狀況，迫切需要建立快速、簡(jiǎn)單、特異的病原檢測(cè)及抗體水平檢測(cè)方法。目前用于CSF、BVDV抗原檢測(cè)的方法很多，主要為病毒分離、中和試驗(yàn)和免疫組化試驗(yàn)等，這些方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，均不便于大批量樣品檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸試驗(yàn)(ELISA)、RT-PCR方法雖然敏感、準(zhǔn)確、快速，但對(duì)儀器設(shè)備及操作人員技術(shù)要求高，不適于基層實(shí)驗(yàn)室操作。免疫層析試紙是在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型體外檢測(cè)技術(shù)，是理想的即時(shí)檢測(cè)(point-of-care test, P0CT)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù),其具有更加靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，尤其是可實(shí)現(xiàn)“傻瓜式”操作，即不需要任何附加儀器設(shè)備即可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，并在1-5分鐘內(nèi)判定結(jié)果，廣泛應(yīng)用于各種分析物的定性和半定量快速檢測(cè)，包括抗原、半抗原、抗體和核酸，已成為當(dāng)今最快速敏感的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一。河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從1995年開(kāi)始系統(tǒng)開(kāi)展免疫試紙快速檢測(cè)技術(shù)研究，率先在國(guó)際上研制成功動(dòng)物疫病病原和抗體檢測(cè)膠體試紙產(chǎn)品一雞傳染性法氏囊病快速診斷試紙和豬旋毛蟲(chóng)抗體檢測(cè)紙，建立了動(dòng)物疫病快速檢測(cè)試紙研發(fā)技術(shù)平臺(tái)，截至目前已成功開(kāi)發(fā)出動(dòng)物疫病抗原、抗體以及藥物殘留檢測(cè)等系列快速檢測(cè)試紙產(chǎn)品，大大推動(dòng)了該技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。本發(fā)明針對(duì)豬瘟病毒和牛流行性腹瀉病毒鑒別診斷的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，篩選鑒定可區(qū)分CSFV和BVDV的高親和力配對(duì)單克隆抗體，建立基于免疫層析試紙的蛋白芯片技術(shù)平臺(tái)，研制豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙，建立適用于養(yǎng)殖基層和臨床檢測(cè)的快捷、簡(jiǎn)便的豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒聯(lián)檢技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)畜群疫病感染的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為我國(guó)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒防控與凈化提供技術(shù)支撐，對(duì)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒疫情監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是:研制適用于豬群或牛群中豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病感染的鑒別診斷檢測(cè)試紙，本試紙?zhí)禺?、敏感、快捷、?jiǎn)便，易在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙，由支撐板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，金標(biāo)墊為吸附膠體金標(biāo)記的同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體玻璃纖維，檢測(cè)膜為豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl、牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2和質(zhì)控線(xiàn)C的硝酸纖維素膜，由樣品端至手柄端的排列為豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl/牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2/質(zhì)控線(xiàn)C I I I ”，豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl為特異識(shí)別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb2印跡“ I ”，牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2為特異識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb3印跡“ I ”，質(zhì)控線(xiàn)C為抗小鼠IgG抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA印跡“ I ”。鑒別檢測(cè)時(shí)，豬瘟病毒感染或免疫并混合牛病毒性腹瀉病毒感染時(shí)在檢測(cè)膜顯現(xiàn)豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl，牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2和質(zhì)控線(xiàn)C三條紅色條帶“ I I I ”，豬瘟病毒感染或免疫在檢測(cè)膜顯現(xiàn)豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl和質(zhì)控線(xiàn)C兩條紅色條帶“ I I ”，牛病毒性腹瀉病毒感染在檢測(cè)膜顯現(xiàn)牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2和質(zhì)控線(xiàn)C兩條紅色條帶“ I I ”，無(wú)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒則只顯現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)c 一條紅色條帶“丨”。
[0009]分別以豬瘟病毒石門(mén)系標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株、牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株為免疫抗原，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)鑒定抗豬瘟病毒、抗牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體，利用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)篩選同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體以及能區(qū)分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體。用于膠體金標(biāo)記的識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體mAbl能同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒，豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl的單克隆抗體mAb2能特異性識(shí)別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應(yīng)，用于牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2的單克隆抗體mAb2能特異識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應(yīng)；以IPMA篩選與豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒反應(yīng)譜廣的單克隆抗體，膠體金標(biāo)記單克隆抗體mAbl可識(shí)別豬瘟病毒石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株和多數(shù)豬瘟病毒流行毒株以及牛病毒性腹瀉病毒I型BA株和多數(shù)牛病毒性腹瀉病毒流行毒株。豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl單克隆抗體mAb2可識(shí)別豬瘟病毒石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株及多數(shù)豬瘟病毒流行毒株，牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2單克隆抗體mAb3可識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒I型BA株及多數(shù)牛病毒性腹瀉病毒流行毒株。以小鼠IgG為免疫抗原制備羊抗小鼠IgG多克隆抗體pAbl, PAbI和金黃色葡萄球菌SPA均可用于質(zhì)控線(xiàn)C印跡。
[0010]本發(fā)明有益的積極效果，豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙實(shí)現(xiàn)了豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的同步聯(lián)檢，可有效鑒別臨床上表現(xiàn)為非典型豬瘟或溫和型豬瘟癥狀豬是否由BVDV感染所致，還可檢測(cè)CSFV兔化弱毒(細(xì)胞源)疫苗是否污染BVDV以及牛群中BVDV的感染。本方法操作簡(jiǎn)單，能較好滿(mǎn)足不同層次人員的需要，如疫病監(jiān)測(cè)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個(gè)體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。檢測(cè)試紙條具有下列各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn):
(I)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒聯(lián)檢。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)膜上含有特異識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)，可同步進(jìn)行豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒聯(lián)檢，實(shí)現(xiàn)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測(cè)。
[0011](2)特異性強(qiáng)，敏感性高。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙以同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體及可區(qū)分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的高親和力配對(duì)單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，單克隆抗體的特異性強(qiáng)和敏感性高，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對(duì)標(biāo)記抗體的反應(yīng)性影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，鑒別檢測(cè)試紙具有較高的特異性和敏感性。
[0012](2)操作簡(jiǎn)便快速。使用鑒別檢測(cè)試紙時(shí)無(wú)需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品10秒左右，在2分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0013](3)顯示檢測(cè)結(jié)果形象、直觀(guān)準(zhǔn)確。鑒別檢測(cè)試紙以顯示紅棕色“ I ”、“ I I ”、“I I”和“I I I ”印跡作為檢測(cè)的陰性、豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒以及豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性標(biāo)記，即在檢測(cè)膜上顯示一條棕紅色條帶“ I ”為豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒陰性，表示被檢測(cè)樣品為無(wú)豬瘟病毒感染或免疫及牛病毒性腹瀉病毒感染；兩條棕紅色條帶“ I I ”為豬瘟病毒陽(yáng)性，表示被檢樣品為豬瘟病毒感染或免疫，無(wú)牛病毒性腹瀉病毒感染；兩條棕紅色條帶“ I I ”為牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性，表示被檢樣品為牛病毒性腹瀉病毒感染，無(wú)豬瘟病毒感染或免疫；三條棕紅色條帶“ I I I ”為豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性，表示被檢樣品為豬瘟病毒感染或免疫混合牛病毒性腹瀉病毒感染，結(jié)果判定形象、直觀(guān)、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性誤判。
[0014](4)成本低，投資少。使用鑒別檢測(cè)試紙，不需另配儀器設(shè)備及其它試劑，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)一步到位，成本低廉，投資少，見(jiàn)效快。
[0015]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016]圖1是豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖2是豬瘟病和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖中，1.支撐板，2.樣品墊，3.金標(biāo)墊，4.檢測(cè)膜，5.吸水墊，6.豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl印跡，7.牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2印跡，8.質(zhì)控線(xiàn)C印跡，9-1.樣品端保護(hù)膜，9-2.手柄端保護(hù)膜，10.標(biāo)記線(xiàn)。
[0019]【具體實(shí)施方式】豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙可廣泛應(yīng)用于豬群中豬瘟病毒感染或免疫和牛病毒性腹瀉病毒感染的鑒別檢測(cè)、豬瘟疫苗是否污染牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測(cè)以及牛群中牛病毒性腹瀉病毒感染的檢測(cè)。制備豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙，首先需制備豬瘟病毒及牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原，進(jìn)而制備抗豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體、篩選同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體以及能區(qū)分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體。同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體mAbl用于制備膠體金標(biāo)記物，識(shí)別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb2用于印制豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)印跡“ I ”，識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb3用于印制牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)印跡“ I ”，其次需制備羊抗小鼠IgG抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA，用于印制質(zhì)控線(xiàn)印跡“I”。
[0020](I)豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原的制備。
[0021](1.1)豬瘟病毒免疫抗原的制備
以豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株石門(mén)株接種豬腎細(xì)胞(PK-15)，48-60小時(shí)收取病毒培養(yǎng)液，4°C 3000 r/min低速離心30 min去除雜質(zhì),利用50 kDa超濾膜對(duì)病毒培養(yǎng)液進(jìn)行超濾濃縮，以Sepherose 4 Fast Flow瓊脂糖凝膠柱對(duì)豬瘟病毒進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析純化，測(cè)定豬瘟病毒的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID5tl)達(dá)10_7以上，熒光定量PCR測(cè)定純化病毒拷貝數(shù)達(dá)1ltl以上。
[0022](1.2)牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原的制備
以牛病毒性腹瀉病毒I型BA株接種牛腎細(xì)胞(MDBK)，48?96小時(shí)收取病毒培養(yǎng)液，4°C 3000 r/min低速離心30 min去除雜質(zhì),利用50 kDa超濾膜對(duì)病毒培養(yǎng)液進(jìn)行超濾濃縮，以Sepherose 4 Fast Flow瓊脂糖凝膠柱對(duì)豬痕病毒進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析純化,測(cè)定牛病毒性腹瀉病毒的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID5tl)達(dá)10_8以上，熒光定量PCR測(cè)定純化病毒拷貝數(shù)達(dá)101°以上。
[0023](2)抗豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體的制備。
[0024](2.1)雜交瘤細(xì)胞株的建立
分別將豬瘟病毒及牛病毒性腹瀉病毒免疫抗原與弗氏免疫佐劑等量混合，充分乳化，以50mg-100mg/只分別免疫BALB/c系小鼠3次，每次間隔15-30天；第3次加強(qiáng)免疫后3-4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75%酒精浸泡5-10min，無(wú)菌取其脾細(xì)胞；剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1000 r/min離心10 min，收集脾細(xì)胞；將I X 18的脾細(xì)胞與2-5 X 10 7的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，1000 r/min離心10 min，棄上清，在37°C的水浴中將0.7_1 ml的40%-50% PEG 4000 (pH8.5-9.0)緩緩加入細(xì)胞，溫育I min后，緩慢加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15 ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5-10 min, 1000 r/min離心10 min，棄上清，將細(xì)胞重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔培養(yǎng)板(100 ml-200 ml/孔)，置37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7-10天后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。分別以豬瘟病毒石門(mén)系標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株感染PK-15細(xì)胞、牛病毒性腹瀉病毒I型BA株感染MDBK細(xì)胞，經(jīng)甲醇固定后，5%脫脂奶37°C封閉I h ;加待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清50mL/孔，設(shè)HAT培養(yǎng)基和小鼠免疫血清為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；加I: 500辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(50 mL/孔)，37°C作用30 min ;每步反應(yīng)后均用含0.05% Tween-20的PBS充分洗滌；以底物AEC室溫顯色10-20 min，用水沖洗中止顯色后，在顯微鏡下觀(guān)察顯色結(jié)果。選取強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的克隆孔進(jìn)行連續(xù)3次有限稀釋克隆化，擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存細(xì)胞，建立抗豬瘟病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株6株、抗牛病毒性腹瀉單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8株。
[0025](2.2)單克隆抗體的制備:以體內(nèi)誘生腹水制備單抗。取經(jīng)降殖烷或液體石蠟致敏的經(jīng)產(chǎn)Balb/c小鼠，腹腔注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞17個(gè)/只，7 d?10 d后抽取腹水，離心后取上清，分裝，凍存。
[0026](2.3)單克隆抗體的鑒定 (2.3.1)單克隆抗體的抗體效價(jià)
以免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水的單抗效價(jià)，單抗上清和腹水的IPMA效價(jià)分別在1:16和1:1600以上。
[0027](2.3.2)單克隆抗體的特異性
用CSFV石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株感染豬腎細(xì)胞(PK-15)，用牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株感染牛腎細(xì)胞(MDBK)，以免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定單抗與CSFV、BVDV流行毒株的反應(yīng)性，篩選獲得同時(shí)識(shí)別CSFV石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株、牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株的單克隆抗體2株，而特異性識(shí)別CSFV石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株但不與牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體2株，特異性識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株但不與CSFV石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體3株。以免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定上述7株單克隆抗體與CSFV、BVDV標(biāo)準(zhǔn)株和流行毒株的反應(yīng)譜，證明用于膠體金標(biāo)記的單克隆抗體可識(shí)別豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒標(biāo)準(zhǔn)株及豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒流行毒株，用于豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl可檢測(cè)CSFV石門(mén)系強(qiáng)毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株以及多數(shù)流行毒株，用于牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2可檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株及多數(shù)牛病毒性腹瀉病毒流行毒株，均具有較廣的CSFV或BVDV反應(yīng)譜。
(2.4)單克隆抗體的純化:以辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化單抗IgG。取I mL小鼠腹水，加入2 mL 0.06 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.0),以0.1 mol/L HCl調(diào)至pH 4.5 ;于室溫?cái)嚢柘拢鸬渭尤?3 mL辛酸，4°C靜置2 h, 15000 r/min離心30 min,棄沉淀；在離心上清中加入 1/10體積0.01 mol/L PBS (ρΗ7.4)，#0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.4 ;于冰浴條件下加入飽和硫酸銨至終濃度45%，4°C靜置2 h，10000 r/min離心30 min，棄上清；以適量PBS重懸沉淀，對(duì)PBS透析過(guò)夜，換液3次。以分光光度計(jì)法或考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定純化單克隆抗體IgG的蛋白含量在lmg/ml以上，以免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測(cè)定小鼠腹水和純化IgG的抗體效價(jià)在1:1000以上，分裝，凍存。
[0028](3)兔抗小鼠IgG多克隆抗體的制備
以純化小鼠IgG免疫2.0 kg左右健康新西蘭兔，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原，皮下多點(diǎn)注射50mg/只，每次加強(qiáng)免疫間隔3 w,以弗氏不完全佐劑乳化抗原肌肉注射，最后一次加強(qiáng)免疫2 w后，以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)測(cè)定免疫血清抗體效價(jià)高于1:40時(shí)，采集高免兔全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨法純化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)單抗純化，辛酸用量為45 mL/mL血清，測(cè)定抗體效價(jià)和蛋白濃度(10-20 mg/ml )，所制備兔抗小鼠IgG多克隆抗體PAbl可用于檢測(cè)試紙質(zhì)控線(xiàn)C印跡的印制。
[0029](4)單克隆抗體的膠體金標(biāo)記
(4.1)膠體金的制備:取100 mL超純水置于500 mL潔凈的錐形瓶，加入I mL I % (w/V)氯金酸煮沸；在攪拌狀態(tài)下迅速加入新鮮配制的I mL 1% (w/v)檸檬酸鈉溶液，煮沸約3min至溶液顏色由黃色變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸2 min;待溶液涼至室溫，補(bǔ)超純水至100 mL,以0.2 mol/L K2C03iI pH至9.0，4°C避光可保存數(shù)月。
[0030](4.2)最適標(biāo)記蛋白濃度測(cè)定:取待標(biāo)記mAbl IgG對(duì)20 mmol/L硼酸鈉溶液(pH8.0)4°C過(guò)夜透析。在微孔板中以25 mL超純水1:2、1:4、1:8……倍比稀釋待標(biāo)記單抗；各孔加入125 mL膠體金溶液，RT靜置5 min ;加入125 mL I mol/L NaCl溶液；各孔顏色隨蛋白濃度的降低而由紅色變?yōu)樗{(lán)色。以顏色未變藍(lán)的單抗最高稀釋度的蛋白濃度為膠體金最適標(biāo)記濃度，膠體金標(biāo)記時(shí)，蛋白濃度增加20%。
[0031](4.3)單克隆抗體的膠體金標(biāo)記:取2 mL最適蛋白濃度的mAbl待標(biāo)記IgG,加入10 mL膠體金溶液(pH 9.0)，迅速混勻，室溫作用10 min?15 min ;加入1/10體積含10%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的20 mmol/L硼酸鈉溶液,迅速混勻,RT作用10 min?15 min ；40C 15000 g離心30min，小心移去上清；以含1% (w/v)BSA的20 mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金，同上離心，棄上清；重復(fù)洗漆I次，以I mL含1% (w/v) BSA的20mmol/L硼酸鈉溶液重懸膠體金，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032](5)檢測(cè)膜的制備
將硝酸纖維素檢測(cè)膜切成2.5X30 cm2的長(zhǎng)條，置于XYZ 3000噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，并以壓條固定；用PBS (pH 7.2)分別將特異識(shí)別豬瘟病毒毒株但不與牛病毒性腹瀉毒株反應(yīng)的單抗mAb2 IgG、特異識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒毒株而不識(shí)別豬瘟病毒毒株的單抗mAb3IgG稀釋至I mg/mL,并分別放于忙存池；利用B1jet Quanti 3000以I mL/cm分別將抗CSFV mAb2單抗、BVDVmAb3單抗和兔抗鼠IgG溶液噴點(diǎn)于檢測(cè)膜中央，形成豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl、牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2和質(zhì)控線(xiàn)C印跡，檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)相距0.5 cm ;置42°C干燥箱30 min或室溫自然干燥；將檢測(cè)膜置塑料袋，加干燥劑4°C密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0033](6)結(jié)合墊的制備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長(zhǎng)條，置于XYZ 3000噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，并以壓條固定；取ImL 膠體金標(biāo)記物加入 2 mL 含 2% (w/v) BSA>3% (w/v)鹿糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween20 (v/v)和 0.1% (w/v)疊氮鈉的 20 mmol/L 硼酸鈉溶液(pH 8.0);利用 Airjet Quanti3000以15 mL/cm將抗膠體金標(biāo)記物溶液噴點(diǎn)于玻璃棉；置50°C干燥箱30 min干燥；將膠金墊置塑料袋，加干燥劑4°C密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0034](7)樣品墊的制備
將玻璃棉切成1.5X30 cm2的長(zhǎng)條，以將含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20 (v/v)和0.1% (w/v)疊氮鈉的PBS (pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉條；置50°C干燥箱30 min干燥；將樣品墊置塑料袋，加干燥劑RT密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0035](8)吸水墊的制備
將玻璃棉切成2.5X30 cm2的長(zhǎng)條，將吸水墊置塑料袋，加干燥劑RT密閉保存?zhèn)溆谩?br> [0036](9)支撐板的制備
將雙面膠貼于PVC支撐板，切成7.5X30 Cm2的長(zhǎng)板，制備支撐板。
[0037](10)試紙的組裝
利用LM5000試紙裝配儀或手工將上述材料裝配成試紙板。先將檢測(cè)膜粘貼于支撐板中央，然后將膠金墊和樣品墊依次粘貼于檢測(cè)膜的樣品端，各層間重疊I mm?2 mm，再將吸水墊粘貼于檢測(cè)膜的另一端，與檢測(cè)膜重疊I mm?2 mm，在樣品端以白色塑膠膜包裹樣品墊和膠金墊，塑膠膜上印有檢測(cè)方向及檢測(cè)溶液上限標(biāo)記，在手柄端以藍(lán)色塑膠膜包裹吸水墊。
[0038](11)切割與包裝
利用CM4000切割儀將裝配好的試紙板切成0.3 cm的試紙條，將試紙條分裝入塑料袋，加干燥劑4°C密閉保存。
[0039]( 12)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙的實(shí)施結(jié)構(gòu)
參見(jiàn)圖1，圖2，圖中，I為支撐板用不吸水薄片條，實(shí)施中可采用塑膠薄片條或采用不吸水的硬質(zhì)紙片材，反應(yīng)試劑載體吸附層由2，3，4，5，組合而成，從樣品端2開(kāi)始，到手柄端5依次粘貼在支撐層I上面；其中2為樣品端樣品墊，實(shí)施中可使用玻璃纖維棉簡(jiǎn)稱(chēng)玻璃棉，3為吸附膠體金標(biāo)記同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體的金標(biāo)玻璃纖維棉，可采用精制玻璃纖維棉，簡(jiǎn)稱(chēng)為金標(biāo)墊，4為檢測(cè)膜，實(shí)施中可采用硝酸纖維素膜，5為手柄端吸水墊，采用吸水紙，如濾紙或其它吸水紙均可，試紙條總長(zhǎng)8 cm，寬度0.4 cm, 6為用特異識(shí)別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb2在硝酸纖維素膜上印制的豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)印跡“ I ”，7為特異識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒發(fā)生交叉反應(yīng)的單克隆抗體在硝酸纖維素膜上印制的牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)印跡“ I ”，8為兔抗小鼠IgG多克隆抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA在硝酸纖維素膜上印制的質(zhì)控線(xiàn)印跡“ I ”，在檢測(cè)膜上的豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)印跡、牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)印跡和質(zhì)控線(xiàn)印跡組合排列為“ III”。9為保護(hù)膜，覆蓋在玻璃棉及金標(biāo)玻璃棉的保護(hù)膜為9-1，覆蓋在吸水層濾紙上的保護(hù)膜為9-2。在玻璃棉和金標(biāo)玻璃棉交界處對(duì)應(yīng)位置的白色保護(hù)膜上偏向玻璃棉一方0.5 cm處的保護(hù)膜上印有一條標(biāo)記線(xiàn)10，在標(biāo)記線(xiàn)10右邊印有箭頭和Max字樣，手柄端保護(hù)膜可用黃色或其它顏色，2，3，4，5各層彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。
[0040]( 13)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙實(shí)施檢測(cè)反應(yīng)原理
當(dāng)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙樣品端插入待檢測(cè)樣品溶液后，待檢溶液通過(guò)虹吸帶動(dòng)待檢CSFV、BVDV抗原及金標(biāo)抗體mAbl —起向硝酸纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲透到濾紙層中，在擴(kuò)散過(guò)程中金標(biāo)抗體mAbl分別與待檢CSFV、BVDV抗原相結(jié)合，形成金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物，CSFV、BVDV抗原的金標(biāo)復(fù)合物可分別與檢測(cè)膜上的豬瘟病毒檢測(cè)印跡mAb2和牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)印跡mAb3結(jié)合，生成紅棕色“ I I ”標(biāo)記及“ I I ”，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體不能與檢測(cè)印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在檢測(cè)膜上與質(zhì)控印跡中的PAbl或PSA，生成紅棕色標(biāo)記“ 兩種標(biāo)記組合疊加，形成三條紅棕色陽(yáng)性標(biāo)記“ I I |”，表示樣品中同時(shí)含有豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒；CSFV病毒的金標(biāo)復(fù)合物不能與檢測(cè)膜上的BVDV檢測(cè)印跡mAb3結(jié)合，只能與CSFV檢測(cè)印跡mAb2結(jié)合，生成紅棕色“ I ”標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體不能與檢測(cè)印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在檢測(cè)膜上與質(zhì)控印跡中的PAbl或PSA，生成紅棕色標(biāo)記“ I ”，兩種標(biāo)記組合疊加，形成兩條紅棕色陽(yáng)性標(biāo)記“ I I ”，表示樣品中只含有豬瘟病毒；BVDV的金標(biāo)復(fù)合物不能與檢測(cè)膜上的CSFV檢測(cè)印跡mAb2結(jié)合，只能與BVDV檢測(cè)印跡mAb3結(jié)合，生成紅棕色“ I ”標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)抗體不能與檢測(cè)印跡結(jié)合而繼續(xù)擴(kuò)散，在檢測(cè)膜上與質(zhì)控印跡中的PAbl或PSA，生成紅棕色標(biāo)記“ I ”，兩種標(biāo)記組合疊加，形成兩條紅棕色陽(yáng)性標(biāo)記“ I I ”，表示樣品中只含有牛病毒性腹瀉病毒；當(dāng)樣品中不含豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒時(shí)，沒(méi)有金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物形成，不能與CSFV檢測(cè)印跡和BVDV檢測(cè)印跡結(jié)合，則生成陰性標(biāo)記“ I ”。如果檢測(cè)膜上沒(méi)有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條已失效。
(14)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙檢測(cè)實(shí)例操作方法(14.1)檢測(cè)樣品溶液的制備:采集病(死)豬、牛的病變組織，包括肺、肝、脾、腎、氣管、小腸、大腸和淋巴結(jié)等，以1:5或1:10加適量PBS或水進(jìn)行簡(jiǎn)單研磨，制備待檢溶液。
[0041](14.2)試紙檢測(cè):將豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙樣品端浸入待檢溶液10 S?20 S ;取出試紙水平放置5 min?10 min觀(guān)察結(jié)果。
[0042](14.3)檢測(cè)結(jié)果判定:試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(CSFV檢測(cè)線(xiàn)、BVDV檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“I I I ”為CSFV、BVDV陽(yáng)性，表示待檢樣品中同時(shí)含有CSFV、BVDV抗原；兩條紅棕色條帶(CSFV檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I ”為CSFV陽(yáng)性，表示待檢樣品中僅含有CSFV抗原；兩條紅棕色條帶(BVDV檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I ”為BVDV陽(yáng)性，表示待檢樣品中僅含有BVDV抗原；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線(xiàn))“ I ”為CSFV、BVDV陰性，表示待檢樣品未檢出CSFV、BVDV抗原；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
[0043]實(shí)施例一，豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒快速診斷，采集病(死)豬、牛的病變組織，包括肺、肝、脾、腎、氣管、小腸、大腸和淋巴結(jié)等，以1:5或1:10加適量PBS或水進(jìn)行簡(jiǎn)單研磨，制備待檢溶液，以豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙按(14)操作方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，鑒別診斷病(死)豬、牛CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染、CSFV感染或CSFV免疫、BVDV感染。試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)、牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“I I I ”為CSFV、BVDV陽(yáng)性，表示待檢豬、牛為CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染；兩條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“I I ”為CSFV陽(yáng)性，表示待檢豬、牛為CFSV感染或免疫，無(wú)BVDV感染；兩條紅棕色條帶(牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“I I ”為BVDV陽(yáng)性，表示待檢豬、牛為BVDV感染，無(wú)CFSV感染或免疫；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線(xiàn))“ I ”為CSFV、BVDV陰性，表示待檢豬、牛無(wú)BVDV感染、CSFV感染或免疫；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
[0044]實(shí)施例二，外表健康及發(fā)熱期病豬、牛檢驗(yàn)檢疫，采集外表健康豬、牛拭子(咽拭和肛拭)、糞便或發(fā)熱期血樣，以1:5或1:10加適量PBS或水進(jìn)行簡(jiǎn)單混懸，以豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙按(14)操作方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，鑒別外表健康及發(fā)熱期病豬、牛的CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染、CSFV感染或CSFV免疫、BVDV感染。試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)、牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I I”為CSFV、BVDV陽(yáng)性，表示待檢豬、牛為CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染；兩條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I ”為CSFV陽(yáng)性，表示待檢豬、牛為CFSV感染或免疫，無(wú)BVDV感染；兩條紅棕色條帶(牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I ”為BVDV陽(yáng)性，表示待檢豬、牛為BVDV感染、無(wú)CFSV感染或免疫；僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線(xiàn))“ I ”為CSFV.BVDV陰性，表示待檢豬、牛無(wú)BVDV感染、無(wú)CFSV感染或免疫；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
[0045]實(shí)施例三,豬痕病毒兔化弱毒疫苗(細(xì)胞源)的質(zhì)量檢測(cè)，以1:5或1:10加適量PBS或水溶解豬瘟兔化弱毒疫苗(細(xì)胞源)，制備待檢疫苗溶液，以豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙按(14)操作方法進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定，檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗(細(xì)胞源)的病毒含量和鑒別檢測(cè)疫苗的牛病毒性腹瀉病毒污染情況。試紙顯現(xiàn)三條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)、牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I I ”為CSFV、BVDV陽(yáng)性，表示待檢疫苗為BVDV污染；兩條紅棕色條帶(豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“I I ”為CSFV陽(yáng)性，表示待檢疫苗無(wú)BVDV污染，豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)的顯色強(qiáng)度與CSFV疫苗含量成正比；兩條紅棕色條帶(牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn))“ I I ”為BVDV陽(yáng)性，表示待檢疫苗有BVDV污染，疫苗無(wú)CSFV ;僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶(質(zhì)控線(xiàn))“ I ”為CSFV、BVDV陰性，表示待檢疫苗無(wú)BVDV污染，同時(shí)也不含疫苗毒；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明檢測(cè)操作不當(dāng)或試紙失效，需以另取檢測(cè)試紙重新檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒鑒別檢測(cè)試紙，由支撐板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測(cè)膜和吸水墊構(gòu)成，其特征是:金標(biāo)墊吸附膠體金標(biāo)記同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的單克隆抗體mAbl，檢測(cè)膜的豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl為特異識(shí)別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb2印跡“ I ”，牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2為特異識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體mAb3印跡“ I ”，質(zhì)控線(xiàn)C為抗小鼠IgG抗體pAbl或金黃色葡萄球菌SPA印跡“丨”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別檢測(cè)試紙,其特征是:豬瘟病毒感染或免疫并混合牛病毒性腹瀉病毒感染時(shí)在檢測(cè)膜顯現(xiàn)豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl，牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2和質(zhì)控線(xiàn)c三條紅色條帶“ III”，豬瘟病毒感染或免疫時(shí)在檢測(cè)膜顯現(xiàn)豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)Tl和質(zhì)控線(xiàn)c兩條紅色條帶“ I I ”，牛病毒性腹瀉病毒感染時(shí)在檢測(cè)膜顯現(xiàn)牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)線(xiàn)T2和質(zhì)控線(xiàn)C兩條紅色條帶“ I I ”，無(wú)豬瘟病毒或牛病毒性腹瀉病毒則只顯現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)c 一條紅色條帶“丨”。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別檢測(cè)試紙，其特征是:單克隆抗體mAbl同時(shí)識(shí)別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒，單克隆抗體mAb2特異識(shí)別豬瘟病毒但不與牛病毒性腹瀉病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，單克隆抗體mAb3特異識(shí)別牛病毒性腹瀉病毒但不與豬瘟病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。
4.根據(jù)要求I或3所述的鑒別檢測(cè)試紙，其特征是:鑒別檢測(cè)試紙的豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒反應(yīng)譜廣，豬瘟病毒檢測(cè)線(xiàn)TI可檢測(cè)CSFV石門(mén)系強(qiáng)毒株(Shimen)、豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)以及多數(shù)豬瘟病毒流行毒株，牛病毒性腹瀉病毒T2可檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒I型(BVDV-1) BA株及多數(shù)牛病毒性腹瀉病毒流行毒株，可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104459143SQ201410763134
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】王麗, 柴書(shū)軍, 楊蘇珍, 孫亞寧, 楊繼飛, 史西保, 李青梅, 郅玉寶, 趙東, 梁躍, 郭軍慶, 楊艷艷, 鄧瑞廣, 張改平 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院