專利名稱：檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬病毒性傳染病抗體的器具，特別是涉及一種檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條。
背景技術(shù)：
豬腹瀉性疾病是一類嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的疾病，其中的病毒性腹瀉尤其難以防治。豬流行性腹瀉病毒(PEDV，代號P)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV，代號T)和輪狀病毒(RV，代號R)是引起豬病毒性腹瀉的主要病毒，這三種病毒引起的豬腹瀉性疾病，其臨床癥狀相似，而且往往在同一個豬場混合感染的情況比較多。因此，為了及時預(yù)防和治療豬病毒性腹瀉，需要快速鑒別診斷豬病毒性腹瀉的特異方法，即需要快速檢測相關(guān)病毒或其特異抗體。目前，實驗室檢測這3種病毒抗體的方法有(1)在細胞系上培養(yǎng)相應(yīng)陽性病毒，以檢測血清樣品中的相應(yīng)病毒抗體；(2)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清樣品中的相應(yīng)病毒抗體。以培養(yǎng)病毒來檢測抗體，需要實驗室條件、高級專業(yè)人員和比較昂貴的儀器設(shè)備，操作繁瑣，檢測費時、費力；ELISA需要酶標(biāo)儀、較多的操作步驟和經(jīng)驗；而且，這些方法一次只檢測一種豬病的抗體?？梢?，上述方法盡管檢測特異或敏感，但操作不夠簡便與快速，均不適合基層或現(xiàn)場快速檢測或診斷。因此，研究一種簡便而快速的、可以檢測這3種豬病病毒抗體的實時在線檢測技術(shù)，非常重要而迫切。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提出一種檢測準(zhǔn)確、快速、使用方便、成本低的一步檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條，含有支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，反應(yīng)試劑載體吸附層粘貼于支撐層上，反應(yīng)試劑載體吸附層由樣品端依次為測試端纖維層、吸附金標(biāo)SPA蛋白或與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上含有一個用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任一種印制的檢測印跡，或含有純化的TGEV、PDEV和RV溶液中分別任選兩種印制的檢測印跡，或含有純化的TGEV、PDEV和RV三種溶液任選一種排列順序印制的檢測印跡，纖維素膜層上還含有用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液印制的對照印跡，或者含有用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液、抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液和抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液中的任一種或任兩種或三種印制的對照印跡。
與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原為金標(biāo)純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV中的任一種、或任兩種、或全部，金標(biāo)抗原的成分與纖維素膜層上的檢測印跡所用的溶液成分對應(yīng)，纖維素膜層上的羊或兔抗SPA蛋白的IgG與所述金標(biāo)SPA蛋白對應(yīng)，纖維素膜層上的羊或兔抗病毒的IgG與所述纖維素膜層上的檢測印跡所用的溶液成分對應(yīng)。
支撐層用硬質(zhì)塑膠片條，或不吸水的硬紙片條；測試端纖維層用玻璃棉，或尼龍纖維膜，或聚酯纖維膜；吸水材料層用吸水紙；纖維素膜層用硝酸纖維素膜，或純纖維素膜，或羧化纖維素膜，或聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF；吸附金標(biāo)SPA蛋白或與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原纖維層用玻璃棉，或尼龍纖維膜，或聚酯纖維膜。
纖維素膜層上含有一條或個檢測印跡時，一條或個檢測印跡和對照印跡的排列形式為
中的任一種；纖維素膜層上含有兩條或個檢測印跡時，兩條或個檢測印跡和對照印跡的排列形式為
中的任一種；纖維素膜層上含有三條或個檢測印跡時，三條或個檢測印跡和對照印跡的排列形式為
中的任一種。
纖維素膜層上依次含有用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任一種印制的直線式檢測印跡
用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液/抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液/抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液中的任一種印制的直線式對照印跡
纖維素膜層上依次含有用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任兩種印制的雙平行直線式檢測印跡
用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液/抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液/抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液中的任兩種合并印制的一條直線式對照印跡
纖維素膜層上依次含有用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液印制的三條平行直線式檢測印跡
用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液、或用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液和抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液和抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液合并印制的一條直線式對照印跡
在測試端纖維層、吸附金標(biāo)SPA蛋白或金標(biāo)抗原纖維層及吸水材料層上覆蓋有塑膠保護膜，在測試端纖維層與金標(biāo)SPA蛋白或金標(biāo)抗原纖維層交界處對應(yīng)的塑膠保護膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測試端纖維層一側(cè)0.5cm處。
本發(fā)明的有益效果 1.本發(fā)明的檢測特異性強，敏感性高。本發(fā)明的檢測試紙條以膠體金標(biāo)記3種純化的豬病病毒抗原(Wi)或SPA為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗原或SPA中金顆粒與抗原或SPA分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對這3種純化豬病病毒抗原(Wi)的特異性影響很小，也不影響SPA與抗體的結(jié)合及抗原與抗體的結(jié)合，且具有較高的標(biāo)記率。因此，該檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到2納克的相應(yīng)的抗體蛋白。
2.本發(fā)明操作簡便，快速。使用本發(fā)明試紙條時無需附加任何其它儀器和試劑，只要將其測試端插入待檢血清中30秒左右，然后在5分鐘左右即可判定檢測結(jié)果。
3.本發(fā)明的檢測結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確。本發(fā)明的檢測試紙條以顯示棕紅色的檢測印跡線和對照印跡線
作為檢測的陽性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上只顯示一條棕紅色
對照印跡線，表示豬病抗體在被檢血清中未檢出，在纖維素膜上顯示一條棕紅色
對照印跡線和1～3條棕紅色檢測印跡線，則表示在被檢血清中檢出相應(yīng)豬病的抗體，檢測結(jié)果呈陽性；結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性誤判。
4.本發(fā)明的檢測投資和檢測成本小。使用該快速檢測試紙條，不需另配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量儀器、設(shè)備和附加試劑費用；一條試紙一次可以檢測1～3種豬病抗體，而且專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進行實時在線檢測，無需支付專家診斷檢查費或送樣品去診斷室的路費，節(jié)省檢測成本，檢測費用低。
5.本發(fā)明應(yīng)用范圍廣，便于普遍推廣應(yīng)用。本發(fā)明快速檢測試紙操作簡單成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。
圖1為本發(fā)明中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖之一；圖2為圖1的俯視結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖之二；圖4為圖3的俯視結(jié)構(gòu)示意圖； 圖5為本發(fā)明中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖之三；圖6為圖5的俯視結(jié)構(gòu)示意圖； 圖7為本發(fā)明中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖之四；圖8為圖7的俯視結(jié)構(gòu)示意圖； 圖9為本發(fā)明中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖之五；圖10為圖9的俯視結(jié)構(gòu)示意圖； 圖11為本發(fā)明中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖之六；圖12為圖11的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式 要制成本發(fā)明的檢測試紙條，需制備純化的TGEV、PDEV和RV及其多克隆抗體，以及抗SPA抗體，用于制備金標(biāo)抗原纖維、檢測印跡和對照印跡。
1.羊或兔抗SPA蛋白的IgG的制備 以50μg～100μg SPA/kg體重經(jīng)皮下和肌肉注射陰性健康羊或家兔3～4次，末次免疫20天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1∶2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清。取1份血清加2份PBS液(pH7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4℃冰箱內(nèi)2h，在4℃、10000r/min離心15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33％，置4℃冰箱內(nèi)2h，在4℃、10000r/min條件下離心15min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2～3次，在4℃、10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以飽和硫酸銨法提取的羊或兔抗SPAIgG，用于制備該快速檢測試紙條的對照印跡。
2.羊或兔抗TGEV、PDEV和RV的IgG(Xi)的制備 采用國家批準(zhǔn)的三種豬病(豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和輪狀病毒(RV))的滅活疫苗或弱毒疫苗，多次免疫接種抗體陰性健康羊或兔。末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測定其血清TGEV、PDEV和RV抗體效價均在1∶2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取抗SPA的IgG相同，不重述)。
3.純化TGEV、PDEV和RV(Wi)的制備 3.1 TGEV增殖純化取適應(yīng)ST或PK15細胞的豬傳染性胃腸炎病毒種毒液，適量接種ST或PK15單層細胞(細胞單層接毒前用PBS洗2遍)，加入不含血清的低糖DMEM維持液(但含有終濃度2g/L的水解乳蛋白)，37℃、5％CO2中靜置繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察，當(dāng)細胞病變達到80％時收獲培養(yǎng)物凍存于-30℃。將病毒細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，8000r/min離心30min去除細胞碎片沉淀，上清液通過孔徑0.3μm無菌濾器過濾。將濾液用飽和硫酸銨沉淀法濃縮至原體積的1/100，以備蔗糖梯度離心。配制20％～50％連續(xù)濃度梯度的蔗糖溶液，從離心管底部逐層向上鋪設(shè)，在蔗糖液上部加濃縮后的病毒液，放入超速離心機，4℃38000r/min離心1.5h，取沉降在36％～40％蔗糖濃度之間的病毒帶，透析濃縮即為純化抗原。-32℃凍存?zhèn)溆谩?br>
3.2PDEV增殖純化取適應(yīng)Vero或ST細胞的豬流行性腹瀉病毒種毒液，適量接種Vero或ST單層細胞(細胞單層接毒前用PBS洗2遍)，37℃、5％CO2中吸附1h，加入2％血清低糖DMEM維持液(含終濃度5μg/mL的胰酶)，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。每天觀察，當(dāng)細胞病變達到80％時收獲培養(yǎng)物凍存于-30℃。將病毒細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，8000r/min離心30min去除細胞碎片沉淀，上清液通過孔徑0.3μm無菌濾器過濾。將濾液用飽和硫酸銨沉淀法濃縮至原體積的1/100，以備蔗糖梯度離心。配制20％～50％連續(xù)濃度梯度的蔗糖溶液，從離心管底部逐層向上鋪設(shè)，在蔗糖液上部加濃縮后的病毒液，放入超速離心機，4℃38000r/min離心1.5h，取沉降在36％～40％蔗糖濃度之間的病毒帶，透析濃縮即為純化抗原。-32℃凍存?zhèn)溆谩?br>
3.3RV增殖純化取適應(yīng)猴腎傳代細胞系MA-104或PK15的豬輪狀病毒種毒液，加入終濃度10μg/ml的胰酶，37℃作用30min，然后適量接種MA-104或PK15單層細胞(細胞單層接毒前用PBS洗2遍)，37℃、5％CO2中靜置培養(yǎng)1h后，每瓶加入無血清DMEM液(但含有終濃度1～2μg/ml的胰酶)繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察，當(dāng)細胞病變達到80％時收毒，凍存于-30℃待用。將豬輪狀病毒細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，7000r/min離心40min，取上清，40000r/min離心1.5h，以少許的PBS溶解沉淀物。在超離管中加入50％氯化銫溶液作墊，在其上層加入10％～30％蔗糖溶液，最后層加上述病毒液，40000r/min離心2h，吸取氯化銫溶液墊層表面的濃縮病毒液，透析濃縮即為純化抗原。-32℃保存待用。
4.金標(biāo)純化TGEV、PDEV和RV(Wi)玻璃棉或金標(biāo)SPA玻璃棉的制備 以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50～100ml沸騰的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2％檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體金。以0.1mol/L的K2CO3調(diào)膠體金pH至8.5～9.5，以1∶1000～1300的標(biāo)記比將待標(biāo)記的純化病毒TGEV或PDEV或RV(W1或W2或W3)或者SPA加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標(biāo)記10min后，加20％PEG10000至終濃度0.05％，4℃、1500～3000r/min離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4℃、15000r/min離心1h，棄上清，獲初步純化金標(biāo)病毒或SPA混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，分別獲得膠體金標(biāo)記的TGEV、PDEV和RV或者SPA。將1∶100～500稀釋的膠體金標(biāo)記物吸附于精制玻璃棉中，4℃真空干燥，制備出金標(biāo)抗原或SPA玻璃棉。
5.該快速檢測試紙條實施檢測的原理 當(dāng)該快速檢測試紙條測試端插入待檢測血清后，待檢血清通過虹吸帶動待檢豬病抗體及金標(biāo)抗原玻璃棉中的金標(biāo)抗原(Wi)一起向硝酸纖維素膜擴散，并最終滲入手柄端濾紙中，擴散過程中待檢豬病抗體可與相應(yīng)的金標(biāo)SPA或病毒抗原(Wi)相結(jié)合，該結(jié)合物進而與纖維素膜上的純化病毒抗原檢測印跡結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測印跡T、P、R；而羊(或兔)抗SPA的IgG或抗這3種病毒的IgG則可與金標(biāo)SPA或金標(biāo)病毒抗原(Wi)結(jié)合，形成棕紅色對照印跡C。如果待檢血清中沒有TGEV、PDEV、RV這3種豬病病毒的抗體，試紙條只顯示出一條棕紅色對照印跡C；血清中含有抗TGEV(PDEV或RV)的抗體，則分別與其金標(biāo)抗原W1(W2或W3)或SPA結(jié)合，再與纖維素膜上的純化病毒抗原檢測印跡T(P或R)結(jié)合，顯示棕紅色檢測印跡，為陽性標(biāo)記；如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。
6.該快速檢測試紙條的檢測操作方法 (1)檢測樣品液的制備無菌取病豬的血液，并分離血清，以生理鹽水作1∶10～50倍稀釋血清待測。
(2)檢測操作將該快速檢測試紙條測試端插入待檢測血清中，插入深度不超過標(biāo)記線9，約30秒后取出試紙條，水平放置約1～5分鐘，同時觀察結(jié)果。
(3)結(jié)果判斷如果在檢測試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對照印跡C，表示檢測結(jié)果呈陰性，說明在被檢血清中未檢測出抗TGEV、PDEV和RV的抗體；如果檢測試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)棕紅色的對照印跡C和檢測印跡T或P或R，表示檢測結(jié)果呈陽性，即在待檢血清中檢測出抗TGEV或PDEV或RV的抗體；如果檢測印跡T、P、R同時出現(xiàn)，表示在待檢血清中檢測出抗TGEV、PDEV和RV這3種豬病病毒的抗體；如果纖維素膜上沒有任何一條棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。
實施例一參見圖1～圖2，圖中，1為支撐層，用硬質(zhì)塑膠片條制成，2為測試端纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附有金標(biāo)SPA的纖維層(根據(jù)上述具體制備方法4制備的金標(biāo)SPA玻璃棉)，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層，用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層依次從左至右粘貼在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜層4上，分別用純化TGEV、PDEV和RV病毒溶液印上檢測印跡T、P、R，用羊或兔抗SPAIgG溶液印上對照印跡C，印跡T、P、R、C的排列形式為
中的任一種，8-1為覆蓋在纖維層2和金標(biāo)SPA纖維層3上面的測試端白色塑膠保護膜，在2和3交界處對應(yīng)塑膠保護膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一側(cè)0.5cm處印有標(biāo)記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水層5(手柄端)上覆蓋有黃色塑膠保護膜8-2。待測血清的制備及檢測步驟，同具體操作方法6中的檢測操作方法，不重述。
實施例二參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于3為吸附金標(biāo)抗原纖維層，它為吸附有金標(biāo)純化TGEV、PDEV和RV病毒的纖維層(根據(jù)上述具體制備方法4制備的金標(biāo)抗原玻璃棉)，在硝酸纖維素膜層4上，C為用抗TGEV、PDEV和RV的IgG溶液合并印制的
形對照印跡。
實施例三參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙片條，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例四參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附有金標(biāo)SPA的纖維層3用聚酯纖維膜。
實施例五參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例六參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜。
實施例七參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例八參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例九參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例十參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜。
實施例十一參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附有金標(biāo)SPA的纖維層3用聚酯纖維膜。
實施例十二參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例十三參見圖1～圖2，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例十四參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙片條，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例十五參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附金標(biāo)抗原纖維層3用尼龍纖維膜。
實施例十六參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例十七參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，吸附金標(biāo)抗原纖維層3用尼龍纖維膜。
實施例十八參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例十九參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例二十參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例二十一參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜。
實施例二十二參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例二十三參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例二十四參見圖1～圖2，本實施例同實施例二基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例二十五參見圖3～圖4，圖中，1為支撐層，用硬質(zhì)塑膠片條制成，2為測試端纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附有金標(biāo)SPA的纖維層(根據(jù)上述具體制備方法4制備的金標(biāo)SPA玻璃棉)，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層，用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層從左至右粘貼在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜層4上，分別用純化TGEV、PDEV病毒溶液印上檢測印跡T、P，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上對照印跡C，印跡T、P、C的排列形式為
中的任一種，8-1為覆蓋在纖維層2和金標(biāo)SPA纖維層3上面的測試端白色塑膠保護膜，在2和3交界處對應(yīng)塑膠保護膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一側(cè)0.5cm處印有標(biāo)記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水層5(手柄端)上覆蓋有黃色塑膠保護膜8-2。待測血清的制備及檢測步驟，同具體操作方法6中的檢測操作方法，不重述。
實施例二十六參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于3為吸附金標(biāo)抗原纖維層，它為吸附有金標(biāo)純化TGEV和PDEV病毒液的纖維層(根據(jù)上述具體制備方法4制備的金標(biāo)抗原玻璃棉)，在硝酸纖維素膜層4上，C為用抗TGEV、PDEV的IgG溶液合并印制的
形對照印跡。
實施例二十七參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙片條，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜。
實施例二十八參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附有金標(biāo)SPA的纖維層3用聚酯纖維膜。
實施例二十九參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例三十參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜。
實施例三十一參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例三十二參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例三十三參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例三十四參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，吸附有金標(biāo)SPA的纖維層3用聚酯纖維膜。
實施例三十五參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例三十六參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例三十七參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例三十八參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙片條，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜。
實施例三十九參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附金標(biāo)抗原纖維層3用尼龍纖維膜。
實施例四十參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例四十一參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜。
實施例四十二參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例四十三參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例四十四參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例四十五參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，吸附金標(biāo)抗原纖維層3用尼龍纖維膜。
實施例四十六參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例四十七參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例四十八參見圖3～圖4，本實施例同實施例二十六基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例四十九參見圖5～圖6，圖中，1為支撐層，用硬質(zhì)塑膠片條制成，2為測試端纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附有金標(biāo)SPA的纖維層(根據(jù)上述具體制備方法4制備的金標(biāo)SPA玻璃棉)，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層，用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層從左至右粘貼在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜層4上，用純化PDEV病毒溶液印上檢測印跡P，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上對照印跡C，印跡P、C的排列形式為
中的任一種，8-1為覆蓋在纖維層2和金標(biāo)SPA纖維層3上面的測試端白色塑膠保護膜，在2和3交界處對應(yīng)塑膠保護膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一側(cè)0.5cm處印有標(biāo)記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水層5(手柄端)上覆蓋有黃色塑膠保護膜8-2。待測血清的制備及檢測步驟，同具體操作方法6中的檢測操作方法，不重述。
實施例五十參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于3為吸附金標(biāo)抗原纖維層，它為吸附有金標(biāo)純化PDEV病毒液的纖維層(根據(jù)上述具體制備方法4制備的金標(biāo)抗原玻璃棉)，在硝酸纖維素膜層4上，C為用抗PDEV的IgG溶液印制的
形對照印跡。
實施例五十一參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙片條，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例五十二參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附有金標(biāo)SPA的纖維層3用聚酯纖維膜。
實施例五十三參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例五十四參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜。
實施例五十五參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例五十六參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例五十七參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例五十八參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，吸附有金標(biāo)SPA的纖維層3用聚酯纖維膜。
實施例五十九參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例六十參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例六十一參見圖5～圖6，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例六十二參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙片條，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例六十三參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用純纖維素膜，吸附金標(biāo)抗原纖維層3用尼龍纖維膜。
實施例六十四參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例六十五參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，吸附金標(biāo)抗原纖維層3用尼龍纖維膜。
實施例六十六參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例六十七參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例六十八參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例六十九參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜。
實施例七十參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
實施例七十一參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜。
實施例七十二參見圖5～圖6，本實施例同實施例五十基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于測試端纖維層2用尼龍纖維膜，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF。
實施例七十三參見圖7～圖8，本實施例同實施例一基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于在硝酸纖維素膜層4上，分別用純化RV、PDEV和TGEV病毒溶液印上檢測印跡R、P、T，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上對照印跡C，印跡R、P、T、C的排列形式為
中的任一種。
實施例七十四參見圖9～圖10，本實施例同實施例二十五基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于在硝酸纖維素膜層4上，分別用純化RV、PDEV病毒溶液印上檢測印跡R、P，用羊或兔抗SPAIgG溶液印上對照印跡C，印跡R、P、C的排列形式為
中的任一種。
實施例七十五參見圖11～圖12，本實施例同實施例四十九基本相同，相同之處不再重述，不同之處在于在硝酸纖維素膜層4上，用純化TGEV病毒溶液印上檢測印跡T，用羊或兔抗SPA IgG溶液印上對照印跡C，印跡T、C的排列形式為
中的任一種。
權(quán)利要求
1.一種檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條，含有支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，反應(yīng)試劑載體吸附層粘貼于支撐層上，其特征是反應(yīng)試劑載體吸附層由樣品端依次為測試端纖維層、吸附金標(biāo)SPA蛋白或與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上含有一個用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任一種印制的檢測印跡，或含有純化的TGEV、PDEV和RV溶液中分別任選兩種印制的檢測印跡，或含有純化的TGEV、PDEV和RV三種溶液任選一種排列順序印制的檢測印跡，纖維素膜層上還含有用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液印制的對照印跡，或者含有用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液、抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液和抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液中的任一種或任兩種或三種印制的對照印跡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原為金標(biāo)純化豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV中的任一種、或任兩種、或全部，金標(biāo)抗原的成分與纖維素膜層上的檢測印跡所用的溶液成分對應(yīng)，纖維素膜層上的羊或兔抗SPA蛋白的IgG與所述金標(biāo)SPA蛋白對應(yīng)，纖維素膜層上的羊或兔抗病毒的IgG與所述纖維素膜層上的檢測印跡所用的溶液成分對應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是所述支撐層用硬質(zhì)塑膠片條，或不吸水的硬紙片條；所述測試端纖維層用玻璃棉，或尼龍纖維膜，或聚酯纖維膜；所述吸水材料層用吸水紙；所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜，或純纖維素膜，或羧化纖維素膜，或聚偏二氟乙烯纖維膜PVDF；所述吸附金標(biāo)SPA蛋白或與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原纖維層用玻璃棉，或尼龍纖維膜，或聚酯纖維膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層上含有一條或個檢測印跡時，一條或個檢測印跡和對照印跡的排列形式為“||”、“＝”、“//”、“\\”、“-|”、“|-”、“+”、“⊥”、
、“●●”、
中的任一種；纖維素膜層上含有兩條或個檢測印跡時，兩條或個檢測印跡和對照印跡的排列形式為“|||”、
“///”、“\\\”、“●●●”、
中的任一種；纖維素膜層上含有三條或個檢測印跡時，三條或個檢測印跡和對照印跡的排列形式為“||||”、
“////”、“\\\\”、
“●●●●”、
中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層上依次含有用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任一種印制的直線式檢測印跡“|”、用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液/抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液/抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液中的任一種印制的直線式對照印跡“|”。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層上依次含有用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任兩種印制的雙平行直線式檢測印跡“||”、用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液/抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液/抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液中的任兩種合并印制的一條直線式對照印跡“|”。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層上依次含有用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液印制的三條平行直線式檢測印跡“|||”，用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液、或用羊或兔抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的IgG溶液和抗豬流行性腹瀉病毒PDEV的IgG溶液和抗豬輪狀病毒RV的IgG溶液合并印制的一條直線式對照印跡“|”。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是在所述測試端纖維層、吸附金標(biāo)SPA蛋白或金標(biāo)抗原纖維層及吸水材料層上覆蓋有塑膠保護膜，在測試端纖維層與金標(biāo)SPA蛋白或金標(biāo)抗原纖維層交界處對應(yīng)的塑膠保護膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測試端纖維層一側(cè)0.5cm處。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條；該試紙條含有支撐層和粘貼在其上面的反應(yīng)試劑載體吸附層，反應(yīng)試劑載體吸附層由樣品端依次為測試端纖維層、吸附金標(biāo)SPA蛋白或與待檢抗體相應(yīng)的金標(biāo)抗原纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上含有一個或兩個或三個用純化的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、豬流行性腹瀉病毒PDEV和豬輪狀病毒RV溶液中的任一種或任兩種或三種印制的檢測印跡，纖維素膜層上還含有用羊或兔抗SPA蛋白的IgG溶液或者用羊或兔抗TGEV、PDEV、RV的IgG溶液中的任一種或任兩種或三種印制的對照印跡；本發(fā)明提供了一種檢測準(zhǔn)確、快速、使用方便、成本低的檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條。
文檔編號G01N33/569GK101358972SQ20081014116
公開日2009年2月4日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者張改平, 肖治軍, 楊艷艷, 鄧瑞廣, 李學(xué)伍, 楊繼飛, 東 趙, 王愛萍, 邢廣旭, 柴書軍, 劉慶堂 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院