專利名稱：一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬病毒性傳染病病原的器具，特別是涉及一種一步檢 測(cè)三種豬病毒性腹瀉疾病病原中至少一種的試紙條。
二、 技術(shù)背景
豬腹瀉性疾病是一類嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的疾病，其中病毒性腹瀉尤其難
以防治。豬流行性腹瀉病毒(PEDV，代號(hào)P)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV，代 號(hào)T)和豬輪狀病毒(RV，代號(hào)R)是引起豬病毒性腹瀉的主要病毒，這三種病毒 引起的豬腹瀉性疾病，其臨床癥狀相似，而且往往在同一個(gè)豬場(chǎng)混合感染的情 況比較多。因此，為了及時(shí)預(yù)防和治療豬病毒性腹瀉，需要快速鑒別診斷豬病 毒性腹瀉的特異方法，即需要快速檢測(cè)相關(guān)病毒及其特異抗體。目前，實(shí)驗(yàn)室 檢測(cè)這三種病毒的方法有(1)病毒分離與鑒定，即取新鮮腹瀉糞便或腸內(nèi)容 物，處理成無(wú)菌病料，接種適合的細(xì)胞系分離培養(yǎng)相應(yīng)病毒，然后用酶或熒光 標(biāo)記的抗體或者標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清鑒定病毒，也可以用免疫電鏡方法檢査病毒；(2) 取新鮮腹瀉糞便或腸內(nèi)容物，制成涂片或冰凍切片，用熒光抗體檢測(cè)其中的病 毒抗原；(3)用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)病料中的病毒核酸。 其中，還可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)中的雙抗體夾心法檢測(cè)糞便中的 TGEV。病毒分離與鑒定、RT-PCR技術(shù)，都需要實(shí)驗(yàn)室條件和專業(yè)人員，操作 過(guò)程繁瑣，檢測(cè)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；ELISA和熒光抗體檢測(cè)法，分別需要酶標(biāo)儀和熒光 顯微鏡，也需要較多的操作步驟和經(jīng)驗(yàn)；而且，這些方法一次只能檢測(cè)一種豬 病的病毒抗原?？梢?jiàn)，上述方法盡管檢測(cè)特異或敏感，但操作不夠簡(jiǎn)便與快速， 均不適合基層或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)或診斷。因此，研究一種簡(jiǎn)便而快速、 一步可以 檢測(cè)這三種豬病病毒抗原的實(shí)時(shí)在線檢測(cè)技術(shù)，非常重要而迫切。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)豬病病原存在的缺點(diǎn)，提供一種
特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便、快速的一步可以檢測(cè)三種豬病毒性腹瀉疾病病原 中至少一種的免疫試紙條。
要解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
本發(fā)明提供一種一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，該試紙條含有 支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層 從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端 的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡；所述吸附金標(biāo)抗體
纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、抗豬流行性腹瀉病毒 PEDV和抗豬輪狀病毒RV單克隆抗體中的任一種或任兩種或三種，所述檢測(cè)印 跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗體液中對(duì)應(yīng)的任一種或任兩種或三種 印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金標(biāo)抗體 纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗體中的任一種 或任兩種或三種，所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV單克隆抗體液中 對(duì)應(yīng)的任一種或任兩種或三種印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗豬的IgG溶液印制。
所述吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV 三種單克隆抗體的混合液，所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三種 多克隆抗體液印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述 吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三種多克 隆抗體的混合液，所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三種單克隆抗 體液印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗豬的IgG溶液印制。
所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的單克隆抗體液印制為用抗 TGEV、抗PEDV和抗RV的單克隆抗體的IgG溶液印制；所述檢測(cè)印跡用抗 TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗體液印制為用抗TGEV、抗PEDV和抗 RV的多克隆抗體的IgG溶液印制。
所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠片條或硬紙條制成；所述測(cè)試端樣品吸附 纖維層用玻璃棉、或尼龍纖維、或聚酯纖維制成；所述吸附金標(biāo)抗體纖維層用 玻璃棉制成。
所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚
偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成。
所述吸水材料層用吸水紙制成。
所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜線式、或?qū)嵭膱A點(diǎn)，所述纖維素
膜層上含有一條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)， 一條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為 <formula>formula see original document page 6</formula>" "、 "/ "、 " ％ "中的任一種；纖維素膜層上含有兩條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)， 兩條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為<formula>formula see original document page 6</formula>
<formula>formula see original document page 6</formula>"7T "中的任一種；纖維素膜層上含有三條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)，三條或個(gè)檢 測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為"I I I I "、"目<formula>formula see original document page 6</formula>中的任一種。
所述試紙條吸附層上面含有一層保護(hù)層，保護(hù)層附著在吸附層上，在測(cè)試 端樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在測(cè) 試端樣品吸附纖維層與吸附金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品
標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測(cè)試端樣品吸附纖維層一側(cè)0.5cm處。
根據(jù)測(cè)試要求，選擇上述吸附金標(biāo)抗體纖維層、檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡中對(duì)
應(yīng)的一種表達(dá)形式。
注明如果吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附的是膠體金標(biāo)記的抗病毒的單克隆抗
體液，纖維素膜層上的檢測(cè)印跡應(yīng)用抗相關(guān)病毒的多克隆抗體的抗體液印制，
其對(duì)照印跡用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液印審lj;如果吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附 的是抗病毒的多克隆抗體液，纖維素膜層上的檢測(cè)印跡用抗相關(guān)病毒的單克隆
抗體的抗體液印制，其對(duì)照印跡用羊(或兔)抗豬的IgG溶液印制。
本發(fā)明的積極有益效果
1、檢測(cè)特異性強(qiáng)、敏感性高本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條以膠體金標(biāo)記高親和 力的特異性單克隆抗體或特異性多克隆抗體為基礎(chǔ)而制成，金標(biāo)抗體中金顆粒 與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體 金標(biāo)對(duì)單克隆抗體或多克隆抗體的特異性和結(jié)合力影響很小，并且具有較高的 標(biāo)記率。因此，本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測(cè)到2
納克相應(yīng)病毒的蛋白。
2、 操作簡(jiǎn)便、快速使用本發(fā)明試紙條檢測(cè)時(shí)無(wú)需附加任何其它儀器和試 劑，只需將其測(cè)試端插入待檢的澄清樣品液中30秒左右，然后在5分鐘左右即
可判定檢測(cè)結(jié)果。
3、 檢測(cè)得到的結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確本發(fā)明試紙條以顯示棕紅色的檢測(cè)印 跡和對(duì)照印跡作為檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上只顯示一條(個(gè)) 棕紅色對(duì)照印跡C，表示這3種豬病病毒在被檢測(cè)樣品液中均未檢出；在纖維素
膜上顯示一條(個(gè))棕紅色對(duì)照印跡C和三條(個(gè))棕紅色檢測(cè)印跡T、 P、 R，則 表示在被檢測(cè)樣品液中檢出這3種豬病病毒；在纖維素膜上顯示一條(個(gè))棕 紅色對(duì)照印跡和三條(個(gè))棕紅色檢測(cè)印跡T、 P、 R中的任一條(個(gè))或任兩 條(個(gè))，則表示在被檢測(cè)樣品液中檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的任一種或兩種豬病病毒；檢測(cè) 結(jié)果呈陽(yáng)性。結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性誤判。
4、 減少投資和降低檢測(cè)成本使用本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條，不需另配其它 儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量?jī)x器、設(shè)備和附加試劑費(fèi)用； 一條試紙一次可以 檢測(cè)3種豬病病毒(原)中的至少一種，而且專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時(shí)隨地 進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，無(wú)需支付專家診斷檢査費(fèi)及其相關(guān)費(fèi)用，這樣以來(lái)可以節(jié) 省檢測(cè)成本，降低檢測(cè)費(fèi)用。
5、 應(yīng)用范圍廣、便于推廣應(yīng)用本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)單成"一步 式"或"傻瓜式"，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括 專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個(gè)體 養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
四

圖1 一種一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原試紙條的側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖
圖2 —種一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖
五具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例僅為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。 要制成一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，首先需要制備抗TGEV、 抗PEDV和抗RV的多克隆抗體和單克隆抗體，用于制備檢測(cè)印跡和吸附金標(biāo)
抗體纖維層；其次需要制備羊(兔)抗小鼠的IgG抗體，或者羊(兔)抗豬的 IgG抗體，用于制備對(duì)照印跡。
1、 羊(兔)抗小鼠的IgG抗體、或羊(兔)抗豬的IgG抗體的制備 以飽和硫酸銨法提取小鼠或者豬血清中的IgG:取1份血清加2份PBS液
(pH 7.2 )混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4'C冰箱內(nèi)2h，在4°C 、 10000r/min 離心15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其 最終濃度為33%，置4"C冰箱內(nèi)2h，在4。C、 10000r/min條件下離心15min，棄 上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4"C冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過(guò)夜透 析，換液2 3次，在4。C、 10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以紫 外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。以50"g 100iig (IgG) /kg體重經(jīng)皮下或肌肉 注射抗體陰性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20天后，靜脈采血，以ELISA 測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1: 2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血 清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠或豬的IgG (其提取方法與上述提取小 鼠血清IgG相同，不再重述)，用于制備本發(fā)明試紙條的對(duì)照印跡。
2. 抗TGEV、抗PEDV和抗RV單克隆抗體(Wi)的制備
以50 u g 100 ii g/只的TGEV (PEDV或RV)蛋白免疫Balb/c系小鼠三次， 每次間隔15 30天；第三次加強(qiáng)免疫后3 4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸 致死，于75。/。酒精浸泡5 10min，無(wú)菌取其脾細(xì)胞；剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò) 濾，1000r/min離心10min，收集脾細(xì)胞；將1乂108的脾細(xì)胞與2 5Xl()7的NSO 漿細(xì)胞瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心10min棄上清，細(xì)胞沉淀于37°C的水溶中緩 緩加入0.7 lml的40。/o 50o/oPEG4000 (pH8.5 9.0)作用lmin，然后緩慢加 入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG的作用，37。C水浴5 10min， 1000r/min 離心10min棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入 96孔培養(yǎng)板(10(Hd 200^il/孔)，置于37。C5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 10 天后，以5 u g 10u g/ml的純化TGEV (PEDV或RV)蛋白包被96孔酶標(biāo)板， 以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)雜交瘤的培養(yǎng)上清，挑取強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞克隆 (OD45(^0.5)，進(jìn)行連續(xù)三次的有限稀釋法克隆化，所生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞染色體 數(shù)為92 98，其分泌的抗TGEV (PEDV或RV)的單克隆抗體Wl (W2或W3)特異地與TGEV (PEDV或RV)反應(yīng)，而不與其它豬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)， 親和力常數(shù)達(dá)109~1G，輕鏈亞型為k或A ，重鏈亞型為IgGp IgG2a、 IgG2b、 IgG3; 抗這3種病毒的單克隆抗體，用于制備金標(biāo)單克隆抗體或檢測(cè)印跡。
3. 抗TGEV、抗PEDV和抗RV金標(biāo)單克隆抗體(Wi)和金標(biāo)單抗玻璃棉 的制備
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠即在50 100ml沸騰的0.01 0.05%氯金酸 水溶液中加入2 4ml的0.5 2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體 金。以O(shè).lmol/L的K2C03調(diào)膠體金pH至8.5 9.5，以1:1000 1300的標(biāo)記比 將待標(biāo)記的抗TGEV(PEDV或RV)的單克隆抗體Wl (W2或W3)加入pH8.5 9.5的金溶膠中，標(biāo)記10min后，加20%PEG10000至最終濃度為0.05%， 4°C、 1500 3000r/min離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、 15000r/min離心 lh，棄上清，獲初步純化金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析， 分離純化金標(biāo)蛋白，分別獲得膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV的單克 隆抗體。將1:100 500稀釋的膠體金標(biāo)記單克隆抗體中的任一種、任兩種或三 種吸附于精制玻璃棉中，4"C低溫真空干燥，制備金標(biāo)單克隆抗體玻璃棉。
4. 抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗體(Xi)的制備，金標(biāo)多克隆抗 體和金標(biāo)多克隆抗體玻璃棉的制備
分別采用國(guó)家批準(zhǔn)的上述三種豬病的滅活疫苗或弱毒疫苗，多次免疫接種 抗體陰性健康豬。末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在 1:2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取 血清中IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)。
TGEV (代號(hào)T)、 PEDV (代號(hào)P)和RV (代號(hào)R)金標(biāo)多克隆抗體及其 金標(biāo)多克隆抗體玻璃棉的制備，與具體實(shí)施方式
3的方法相同，不再重述。
5. 本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條實(shí)施檢測(cè)的原理
當(dāng)本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條測(cè)試端插入待檢測(cè)樣品溶液后，待檢溶液通過(guò)虹 吸帶動(dòng)待檢豬病病毒及金標(biāo)抗體玻璃棉(吸附金標(biāo)抗體纖維層)中的金標(biāo)抗體 (單抗或多抗) 一起向硝酸纖維素膜(纖維素膜層)擴(kuò)散，并最終滲入手柄端 濾紙(吸水材料層)中，擴(kuò)散過(guò)程中待檢豬病病毒可與該病毒相應(yīng)的金標(biāo)抗體相結(jié)
合，進(jìn)而與纖維素膜上抗該病毒的抗體(多抗或單抗)檢測(cè)印跡結(jié)合，從而顯
示出1 3條(個(gè))棕紅色的檢測(cè)印跡T、 P、 R;而羊(兔)抗小鼠的IgG、或 羊(兔)抗豬的IgG則可與相應(yīng)的金標(biāo)單抗或多抗結(jié)合，形成1條(個(gè))棕紅 色對(duì)照印跡C。如果待檢樣品液中沒(méi)有TGEV、 PEDV、 RV這3種豬病病毒， 試紙條只顯示出一條(個(gè))棕紅色對(duì)照印跡C;樣品溶液中含有TGEV(或PEDV、 或RV)，則分別與其金標(biāo)抗體結(jié)合，再與纖維素膜上的抗該病毒的抗體檢測(cè)印 跡T (P或R)結(jié)合，顯示棕紅色檢測(cè)印跡，為陽(yáng)性標(biāo)記；如果纖維素膜上沒(méi)有 任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。 6.本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)操作方法
(1) 檢測(cè)樣品液的制備無(wú)菌取病豬新鮮腹瀉糞便或小腸內(nèi)容物，用生理
鹽水配成1:2 5的懸液，置4。C澄清或3000r/min離心20分鐘，取上清液待檢。
(2) 檢測(cè)操作將本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條測(cè)試端插入待檢測(cè)樣品澄清液中， 插入深度不超過(guò)標(biāo)記線9，約30秒后取出試紙條，水平放置約1 5分鐘，同時(shí)
觀察結(jié)果。
(3) 結(jié)果判斷如果在檢測(cè)試紙條纖維素膜上只顯示出一條(個(gè))棕紅色 對(duì)照印跡C，表示檢測(cè)結(jié)果呈陰性，說(shuō)明在被檢樣品液中未檢測(cè)出TGEV、PEDV 和RV;如果檢測(cè)試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C和檢測(cè)印跡T或 P或R，表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，即在待檢樣品中檢測(cè)出TGEV、或PEDV、或RV; 如果檢測(cè)印跡T、 P、 R同時(shí)出現(xiàn)，表示在待檢樣品中檢測(cè)出TGEV、 PEDV、 RV這3種豬病病毒；如果纖維素膜上沒(méi)有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條 己失效或操作有誤。
實(shí)施例一 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條 .
參見(jiàn)圖1和圖2，圖中l(wèi)為支撐層，用硬質(zhì)塑膠薄片條制成，2為測(cè)試端的 樣品吸附纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附金標(biāo)抗體纖維層，吸附有膠體金標(biāo)記 的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三種單克隆抗體的玻璃棉，根據(jù)上述具體實(shí)施方 式3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單克隆抗體玻璃棉，4為纖維素膜層，采用硝 酸纖維素膜制成，5為吸水材料層，用吸水濾紙制成，將編號(hào)2、 3、 4、 5各層 從左端測(cè)試端至右粘貼在硬質(zhì)塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗TGEV、抗PEDV和抗RV三種多 克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T、 P、 R， 7為用羊或兔抗小鼠的IgG溶 液印制的對(duì)照印跡C，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜線式、或?qū)嵭膱A點(diǎn)， 兩種印跡帶排,l」形成的組合形式為"I I I 1"、:巨"、"/ / / /"、 "\ \\\"、 " l "、 " "、 " / "、 " " 中的任一種。8—1 為覆蓋在測(cè)試端樣品吸附纖維層2和吸附金標(biāo)抗體纖維層3上面的白色保護(hù)膜， 在2和3交界處對(duì)應(yīng)保護(hù)膜8-1位置上偏向于樣品吸附纖維層2 —側(cè)0.5cm處印 冇標(biāo)記線9， 9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5 (手柄端)上覆蓋有 其它顏色(如黃色)保護(hù)膜8-2。
待測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)操作方 法相同，不再重述。
實(shí)施例二 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例一基本相 同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV 二種多克隆抗體的玻璃棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制 備其金標(biāo)多克隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗TGEV、抗 PEDV和抗RV三種單克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T、 P、 R " I "， 7 為用羊(或兔)抗豬的IgG溶液印制的對(duì)照印跡C " I "，兩種印跡平行排列組 合為"I I I I "。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí) 施方式6中的操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例三 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例一基本相
同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV單克隆抗體的玻璃 棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單克隆抗體玻 璃棉，6為用抗TGEV的多克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T， 7為用羊或 兔抗小鼠的IgG溶液印制的對(duì)照印跡C，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜 線式、或?qū)嵭膱A點(diǎn)，兩種印跡帶排列的組合形式為"I I "、 " = "、 "http://"、 "\
\ " " — J ，， " J —" " +" " 丄 " " " " * " "" " " 中的任一種。待測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)操 作方法相同，不再重述。
實(shí)施例四 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例三基本相 同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV多克隆抗體的玻璃
棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多克隆抗體玻 璃棉，6為用抗TGEV的單克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡線"I " T， 7 為用羊或兔抗豬的IgG溶液印制的對(duì)照印跡線"I "C，兩種印跡線平行排列組 合為"I I "。待測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與具體實(shí)施方式
6中的檢 測(cè)操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例五 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例三基本相 同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV單克隆抗體的玻璃 棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單克隆抗體玻 璃棉，6為用抗PEDV的多克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡P， 7為用羊或 兔抗小鼠的IgG溶液印制的對(duì)照印跡C，兩種印跡線平行排列組合為" "。待 測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)操作方法相同， 不再重述。
實(shí)施例六 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例五基本相 同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV多克隆抗體的玻璃 棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多克隆抗體玻 璃棉，6為用抗PEDV的單克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡P， 7為用羊或 兔抗豬的IgG溶液印制的對(duì)照印跡C，兩種印跡線平行排列組合為"/ /"。待 測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)操作方法相同， 不再重述。
實(shí)施例七 一歩檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例三基本相 同，不同之處在于吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗RV單克隆抗體的玻璃棉制 成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單克隆抗體玻璃棉， 6為用抗RV的多克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡R， 7為用羊或兔抗小鼠 的IgG溶液印制的對(duì)照印跡C。待測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與具體 實(shí)施方式6中的檢測(cè)操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例八 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例七基本相
同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗RV多克隆抗體的玻璃棉制 成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多克隆抗體玻璃棉， 6為用抗RV的單克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡R， 7為用羊或兔抗豬的 IgG溶液印制的對(duì)照印跡C，兩種印跡線平行排列組合為"\\"。待測(cè)樣品溶 液的制備及檢測(cè)操作歩驟，與具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)操作方法相同，不再重 述。
實(shí)施例九 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例一基本相 同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3為吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV和抗PEDV的多克
隆抗體的玻璃棉，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多克
隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗TGEV和抗PEDV的單
克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T、 P， 7為用羊(或兔)抗豬的IgG溶液
印制的對(duì)照印跡C，兩種印跡排列組合的形式為"III "、"三"、"http:///，，、 "\ \ \ ，， " * ，， " Z " " *" " J " " " " 11 — " " II "
"TT "中的任一種。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí)施方式
6中的操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例十 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例九基本相 同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3為吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV和抗PEDV的單克 隆抗體的玻璃棉，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單克 隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗TGEV和抗PEDV的多
克隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡"I " T、 P， 7為用羊(或兔)抗小鼠的 IgG溶液印制的對(duì)照印跡"I " C，兩種印跡平行排列組合為"III "。其它 包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí)施方式
6中的操作方法 相同，不再重述。
實(shí)施例十一 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例九基本 相同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV和抗RV多克隆抗 體的玻璃棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多克 隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗TGEV和抗RV的單克隆 抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T、 R， 7為用羊(或兔)抗豬的IgG溶液印制 的對(duì)照印跡C。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí)施方 式6中的操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例十二 一歩檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例十一基
本相同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV和抗RV的單克隆 抗體的玻璃棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單 克隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗TGEV和抗RV的多克 隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T、 R， 7為用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液 印制的對(duì)照印跡C，兩種印跡平行排列組合為"/ / /"。其它包括檢測(cè)樣品制 備、操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí)施方式
6中的操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例十三 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例九基本
相同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3為吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV和抗RV的單克隆 抗體的玻璃棉，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單克隆 抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗PEDV和抗RV的多克隆抗 體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡P、 R， 7為用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液印制 的對(duì)照印跡C。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí)施方 式6中的操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例十四 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例十三基 本相同，不同之處在于
吸附金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的抗PEDV和抗RV的多克隆 抗體的玻璃棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多 克隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗PEDV和抗RV的單克 隆抗體的IgG溶液印制的檢測(cè)印跡P、 R， 7為用羊(或兔)抗豬的IgG溶液印 制的對(duì)照印跡C，兩種印跡平行排列組合為"\ \ \ "。其它包括檢測(cè)樣品制備、 操作方法和結(jié)果判定等均與具體實(shí)施方式
6中的操作方法相同，不再重述。
實(shí)施例十五 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例一基本 相同，不同之處在于
支撐層1用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖
維素膜層4采用純纖維素膜制成；檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列為"http:////"。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的操作
方法，不再重述。
實(shí)施例十六 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例三基本 相同，不同之處在于
支撐層1用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2用聚酯纖維制成，纖
維素膜層4采用羧化纖維素膜制成；檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列為"\ \"。
其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)
操作方法，不再重述。
實(shí)施例十七 一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，同實(shí)施例五基本 相同，不同之處在于
支撐層1用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖 維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維素膜制成；檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列為 "I I "。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6 中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例十八 一歩檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，與實(shí)施例十一基 本相同，不同之處在于
支撐層1用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2用聚酯纖維制成，纖 維素膜層4采用羧化纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列為"* "。 其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè) 操作方法，不再重述。
權(quán)利要求
1、一種一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，其特征是所述吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗豬傳染性胃腸炎病毒TGEV、抗豬流行性腹瀉病毒PEDV和抗豬輪狀病毒RV單克隆抗體中的任一種或任兩種或三種，所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗體液中對(duì)應(yīng)的任一種或任兩種或三種印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗體中的任一種或任兩種或三種，所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV單克隆抗體液中對(duì)應(yīng)的任一種或任兩種或三種印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗豬的IgG溶液印制。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三種單克隆抗體的混合液，所述 檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三種多克隆抗體液印制，對(duì)照印跡用 羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體 金標(biāo)記的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三種多克隆抗體的混合液，所述檢測(cè)印跡 用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三種單克隆抗體液印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔 抗豬的IgG溶液印制。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是:所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、 抗PEDV和抗RV的單克隆抗體液印制為用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的單克 降抗體的IgG溶液印制；所述檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆 抗體液印制為用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗體的IgG溶液印制。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述支撐層用不吸水的硬質(zhì) 塑膠片條或硬紙條制成；所述測(cè)試端樣品吸附纖維層用玻璃棉、或尼龍纖維、 或聚酯纖維制成；所述吸附金標(biāo)抗體纖維層用玻璃棉制成。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層用硝酸纖維 素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述吸水材料層用吸水紙制成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為 直線式、或斜線式、或?qū)嵭膱A點(diǎn)，所述纖維素膜層上含有一條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)， 一條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為"I I "、" = "、"〃"、" \\"、"_ I "、"J 一"、 " + "、 " j_ "、 " 丁 "、 "、 "、 " ，，中的任一禾中；纖維素膜層上含有兩條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)，兩條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形工^^為 "J J J ，， " ^~" ,， a///" a \ \ \ ，， a * " a 、 ""! "、" 二i "、" n— "、 " li "、" it "中的任一種；纖維素膜層 上含有三條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)，三條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為"I I I I ,， " ~" ，， "http:////，， " \ \ \ \ ，， " ，， " *，，"/' "、" "中的任一種。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述試紙條吸附層上面含有 一層保護(hù)層，保護(hù)層附著在吸附層上，在測(cè)試端樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)抗 休纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在測(cè)試端樣品吸附纖維層與吸附金標(biāo) 抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測(cè)試端樣品吸附纖維層一側(cè)0.5cm處。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種一步檢測(cè)豬病毒性腹瀉疾病病原的試紙條，該試紙條含有支撐層、吸附層和保護(hù)層，吸附層從測(cè)試端依次為樣品纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，金標(biāo)抗體纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的抗TGEV、抗PDEV和抗RV的單克隆抗體或多克隆抗體中的至少一種；檢測(cè)印跡用抗TGEV、抗PDEV和抗RV的多克隆抗體液或單克隆抗體液中對(duì)應(yīng)的至少一種印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液、或用羊抗或兔抗豬的IgG溶液印制。本發(fā)明試紙條檢測(cè)時(shí)特異性強(qiáng)、敏感性高，操作簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果直觀、準(zhǔn)確；特別適合現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別診斷。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101339192SQ20081014116
公開(kāi)日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者劉慶堂, 張改平, 李學(xué)伍, 楊繼飛, 楊艷艷, 柴書軍, 王愛(ài)萍, 肖治軍, 東 趙, 鄧瑞廣, 邢廣旭 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院