一種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色傳感檢測(cè)方法。向0.05～10mM?PNC中加入1～50mg/mL的EDC和1～50mg/mL的NHS，反應(yīng)5～90min，與1～100μg/L的微囊藻毒素抗體混合，10～50℃震蕩1～24h，靜置1～24h。用截留分子量為30K納濾膜進(jìn)行分離，加入不大于10μg/L的微囊藻毒素，30～50℃震蕩0.5～12h，用截留分子量為50K的納濾膜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，加入0.01～10mg/mL顯色劑1～60min，加入0.1～10.0M終止液。比傳統(tǒng)酶檢測(cè)方法成本低，穩(wěn)定性、實(shí)用性強(qiáng)。
【專利說明】—種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于納米二氧化鈰仿生氧化酶的微囊藻毒素比色傳感檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一類由產(chǎn)毒水華藍(lán)藻分泌的次級(jí)代謝物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的肝毒性。其中，毒性最大的Microcystin-LR (MC-LR)對(duì)小白鼠的LD5tl值僅為43 μ g/kg,低于劇毒物質(zhì)氰化鉀。如今，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度加劇,水華頻發(fā),飲用水源水和自來水廠出水中均有微囊藻毒素檢出，其對(duì)水體環(huán)境和人群健康造成嚴(yán)重威脅，已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題之一。由于其急性毒性強(qiáng)，世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)僅為I μ g/L。因此，發(fā)展靈敏、快速、高效、實(shí)時(shí)的檢測(cè)方法對(duì)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的微囊藻毒素具有重要意義。
[0003]傳統(tǒng)的微囊藻毒素檢測(cè)方法有儀器檢測(cè)法，生物法/生化法等，由于其固有的缺陷已難以應(yīng)對(duì)目前的環(huán)境監(jiān)測(cè)需求。例如，高效液相色譜法耗時(shí)、費(fèi)力、成本高；全細(xì)胞法靈敏度低、特異性差；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定雖然具有較高的靈敏度和選擇性，但操作過程復(fù)雜，體系對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性差，阻礙了該法的推廣使用。近年來，無機(jī)納米材料仿生酶，包括仿生過氧化酶、仿生氧化酶等，可在分子層面上模仿天然酶，不僅擁有接近或高于天然酶的催化性能，且相較于天然酶更穩(wěn)定，實(shí)用性更強(qiáng)，更加經(jīng)濟(jì)易于生產(chǎn)，已被廣泛運(yùn)用于傳感分析檢測(cè)中(Chemical Communications, 2011, 47 (23), 6695-6697 ；ACS ΝΑΝΟ, 2012，6(4)，3142-3151)。目前，人們也已利用仿生酶材料成功建立了一些針對(duì)藻毒素檢測(cè)的傳感平臺(tái)(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2013, 103, 38-44 ；Science, 2010, 330 (6001)，188-189)，但這些方法均基于仿生過氧化酶的催化性能，即必須在反應(yīng)體系中加入一定量的H2O2，才能實(shí)現(xiàn)催化過程的順利進(jìn)行。由于H2O2不僅易降解，在長(zhǎng)期存儲(chǔ)過程中易失效，而且其強(qiáng)氧化性易造成生物底物組織結(jié)構(gòu)破壞，影響了實(shí)驗(yàn)效率與檢測(cè)結(jié)果。
[0004]納米二氧化鈰，基于Ce3+與Ce4+的相互轉(zhuǎn)化作用而具有仿生氧化酶的催化性質(zhì)，從而可以快速催化氧化多種有機(jī)底物，而無需額外添加任何氧化劑。如今納米二氧化鈰仿生氧化酶材料由于其優(yōu)異的性質(zhì)已被用于傳感分析中(AngewandteChemie-1nternationalEdition, 2009, 48(13), 2308-2312 ；Biosensors and Bioelectronics, 2014, 52, 397-402)。本發(fā)明將納米二氧化鈰仿生氧化酶材料應(yīng)用于水中微囊藻毒素的檢測(cè)，建立一種微囊藻毒素的比色分析方法，解決了傳統(tǒng)方法繁瑣耗時(shí)、成本高、實(shí)用性差等缺點(diǎn)，應(yīng)用前景非常廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測(cè)微囊藻毒素方法繁瑣耗時(shí)、前處理過程復(fù)雜、成本高、實(shí)用性差等不足，提供了一種簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的檢測(cè)水中微囊藻毒素的方法。
[0006]六水合硝酸鈰和聚丙烯酸在氨水存在條件下，經(jīng)攪拌，一步合成聚丙烯酸包被的納米二氧化鈰(PNC)，其仿生氧化酶的催化性能可使底物中的顯色劑從常態(tài)氧化至氧化態(tài)，從而使體系吸光度值發(fā)生改變。PNC表面羧基經(jīng)過活化，與微囊藻毒素抗體通過脫水縮合反應(yīng)結(jié)合，形成抗體-納米二氧化鈰復(fù)合物。檢測(cè)時(shí)利用納濾膜分離去除游離的納米二氧化鈰后，與目標(biāo)物分子，即微囊藻毒素發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-納米二氧化鈰復(fù)合物。再利用納濾膜過濾分離去除未進(jìn)行特異性結(jié)合的游離的抗體-納米二氧化鈰復(fù)合物。過濾截留的抗原-抗體-納米二氧化鈰復(fù)合物的濃度與目標(biāo)物微囊藻毒素的濃度正相關(guān)，在顯色劑存在條件下，復(fù)合物與顯色劑發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，并且體系吸光度值在一定范圍內(nèi)與微囊藻毒素的濃度正相關(guān)，從而為微囊藻毒素的定量分析提供依據(jù)。
[0007]本發(fā)明提供了一種基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的檢測(cè)方法，具體步驟如下:
[0008](I)向0.05?IOmM PNC中依次加入濃度為I?50mg/mL的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和濃度為I?50mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)5?90min，活化PNC表面原有的羧基官能團(tuán)。
[0009](2)將步驟⑴獲得的表面羧基活化的PNC與濃度為I?100 μ g/L的微囊藻毒素抗體混合，10?50°C溫度下震蕩I?24h，然后靜置I?24h。利用截留分子量為30K納濾膜對(duì)溶液進(jìn)行分離，去除游離的PNC。向去除游離PNC后的溶液中加入濃度不大于10 μ g/L的微囊藻毒素，30?50°C溫度條件下震蕩0.5?12h，用截留分子量為50K的納濾膜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，去除未進(jìn)行特異性結(jié)合的游離抗體-PNC復(fù)合物。
[0010](3)向步驟⑵得到的產(chǎn)物中加入0.01?10mg/mL顯色劑，反應(yīng)I?60min，加入
0.1?10.0M終止液終止反應(yīng)。
[0011]所述的顯色劑包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2_聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等。
[0012]所述的終止液為硫酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。
[0013]所述的微囊藻毒素抗體為微囊藻毒素單克隆抗體。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
[0015](I)檢測(cè)下限可達(dá)0.45 μ g/L,符合WHO規(guī)定的飲用水中微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)I μ g/L0
[0016](2)納米二氧化鈰仿生氧化酶的制備采用磁力攪拌一步合成，過程簡(jiǎn)單、快捷。
[0017](3)相較于傳統(tǒng)天然酶檢測(cè)方法，成本低，穩(wěn)定性、實(shí)用性強(qiáng)。
[0018](4)相較于傳統(tǒng)仿生過氧化酶?jìng)鞲袡z測(cè)方法，體系無需H2O2,過程安全且對(duì)生物分子無影響，便于運(yùn)輸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明所述的檢測(cè)微囊藻毒素的方法過程示意圖。
[0020]圖2是本發(fā)明的方法獲得的檢測(cè)微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0021]圖中:藝表面包被聚丙烯酸的納米二氧化鈰(PNC)；[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的檢測(cè)方法，其特征在于如下步驟: (1)向0.05?IOmM PNC中依次加入濃度為I?50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和濃度為I?50mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應(yīng)5?90min，活化PNC表面原有的羧基官能團(tuán)； (2)將步驟(I)獲得的表面羧基活化的PNC與濃度為I?100μ g/L的微囊藻毒素抗體混合，10?50°C溫度下震蕩I?24h，然后靜置I?24h ;利用截留分子量為30K納濾膜對(duì)溶液進(jìn)行分離，去除游離的PNC ；向去除游離PNC后的溶液中加入濃度不大于10 μ g/L的微囊藻毒素，30?50°C溫度條件下震蕩0.5?12h，再用截留分子量為50K的納濾膜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，去除未進(jìn)行特異性結(jié)合的游離抗體-PNC復(fù)合物； (3)向步驟(2)得到的產(chǎn)物中加入0.01?10mg/mL顯色劑，反應(yīng)I?60min后，加入0.1?10.0M終止液終止反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺或2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的終止液為硫酸或十二烷基硫酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的微囊藻毒素抗體為微囊藻毒素單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的微囊藻毒素抗體為微囊藻毒素單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103983777SQ201410191509
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】趙慧敏, 袁芳, 全燮, 陳碩 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)