鴉蔥指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鴉蔥指紋圖譜的建立方法，具體步驟為將鴉蔥制備成供試品溶液，在一定的條件下經(jīng)過高效液相色譜儀的分離檢測，獲得鴉蔥的指紋圖譜，本發(fā)明同時提供了由該方法得到的鴉蔥的標(biāo)準指紋圖譜，該圖譜能夠為鴉蔥鑒別和內(nèi)在的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)，本發(fā)明操作簡便，穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、特征峰多，能全面、準確地評價鴉蔥藥材的質(zhì)量。
【專利說明】鴉蔥指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準指紋圖譜
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鴉蔥指紋圖譜的建立方法，以及由該方法所得的鴉蔥標(biāo)準指紋圖譜，屬于中藥分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鴉蔥為菊科植物Scorzonera austriaca Wild的干燥全草。五月?六月米挖、曬干。本品全長10?40厘米；根粗壯，倒圓錐狀，直徑約0.3?3厘米；莖多數(shù)，簇生于根頸頂端，不分枝，光滑無毛，莖基被稠密褐色的纖維狀撕裂的鞘狀殘遺；基生葉廣披針形至長圓狀卵形，長20?30 (-40)厘米，寬1.2?3.5 (-5)厘米，邊緣平展，基部鞘狀擴大，鞘內(nèi)被稠密的棉毛，基部邊緣有棉毛；莖生葉少數(shù)，I?3枚，鱗片狀；頭狀花序單生莖頂，瘦果無毛。鴉蔥作為傳統(tǒng)中藥，全草入藥，具有清熱解毒、消炎、通乳的功效，主治癰瘡、淋病、婦女帶下、乳腺炎等癥。鴉蔥也是一味傳統(tǒng)藏藥(藏名:巴多拉)。關(guān)于鴉蔥化學(xué)成分的研究除本研究室外，只有武全香等報道了鴉蔥中倍半萜類和三萜類化學(xué)成分的研究(武全香，李娟，祝英.藏藥鴉蔥化學(xué)成分的研究[J].有機化學(xué)，2003，23 (11):446)，Ting-Fu Jiang等報道了香豆素類化學(xué)成分的研究(T.F.Jiang et.al.Determinationof kavalactones and flavonoid glycoside in Scorzonera austriaca by capillaryzone electrophoresis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2007,43(3):854-858) 0本研究室對鴉蔥中黃酮類化學(xué)成分進行了研究(李泉妙，王廣樹.鴉蔥中黃酮苷類成分的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010, 36 (I): 10-12)、(劉欣，張子龍，王廣樹等.鴉蔥中黃酮成分的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2012，38 (3):595-597)、(何碌.鴉蔥中黃酮類化合物的研究[D].吉林大學(xué)研究生學(xué)位論文，2012)、(李泉妙.鴉蔥中化學(xué)成分的研究及保肝活性的初探[D].吉林大學(xué)研究生學(xué)位論文，2008)。迄今為止，本研究室從鴉蔥中分得了 10余種黃酮類化合物，對總黃酮提取物進行了生物活性研究，發(fā)現(xiàn)鴉蔥總黃酮具有治療肝炎和保肝作用，于2013年獲得了中國發(fā)明專利(一種鴉蔥總提取物及其在制備治療肝炎或保肝藥物中的用途，專利號ZL201110255235.1，授權(quán)公告日2013-06-04)。本研究室正在進行以鴉蔥為原料，以鴉蔥總黃酮為有效部位，以治療病毒性肝炎為目標(biāo)的新藥創(chuàng)制的研究，并獲得了國家科技重大專項的資助(國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”，治療病毒性肝炎創(chuàng)新藥物-YCZT 的研究，2013ZX09103002-007)。
[0003]中藥指紋圖譜技術(shù)是目前國內(nèi)外公認的用來控制中藥、天然藥物或中藥材整體質(zhì)量最有效、最準確、最直接的手段，是一種綜合的、宏觀的和可量化的鑒別方法，其基本屬性是“整體性”和“模糊性”?！罢w性”是指完整地比較色譜的特征“面貌”；“模糊性”強調(diào)的是對照物與待測樣品指紋圖譜的相似性。運用指紋圖譜技術(shù)可以鑒別中藥材和中成藥的真?zhèn)?，評價原料藥材、半成品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。但是，迄今為止，有關(guān)鴉蔥藥材的指紋圖譜還未見報道。
[0004]鑒于以上不足，有必要發(fā)明一種建立鴉蔥指紋圖譜的新方法，使之既能操作簡便、穩(wěn)定和重現(xiàn)性好，又能全面、準確地評價鴉蔥藥材的質(zhì)量，從而既能加強對鴉蔥藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地的鑒別，又能對鴉蔥藥材的質(zhì)量和品質(zhì)進行全面評價和控制，彌補了現(xiàn)有鴉蔥質(zhì)量藥材控制方法的不足，使其更加完善和科學(xué)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有鴉蔥藥材質(zhì)量控制方法的不足而提供一種鴉蔥指紋圖譜的建立方法，其特點是將鴉蔥制備成供試品溶液后，經(jīng)過高效液相色譜儀分離檢測，獲得鴉蔥的指紋圖譜，從而為鴉蔥的鑒別和內(nèi)在的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。
[0006]本發(fā)明一種鴉蔥指紋圖譜的建立方法具體包括如下步驟:
[0007]I)供試品溶液的制備:取鴉蔥藥材粗粉，以乙醇溶液超聲提取，過濾，取濾液適量采用微孔濾膜濾過，作為供試品溶液；2)參照物溶液的制備:取鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-13-D-批喃葡萄糖碳苷)、鴉蔥黃酮苷D (5，7，4'-三羥基黃酮-S-C-β -D-吡喃葡萄糖碳苷)對照品，溶于甲醇溶液作為參照物溶液；
[0008]3)制作鴉蔥指紋圖譜:分別精密吸取供試液溶液和參照物溶液，經(jīng)高效液相色譜儀分離檢測，其中，流動相的組成為14.6mmol.L-1的磷酸溶液-乙腈；采用梯度洗脫；得到鴉蔥指紋圖譜。
[0009]其中，供試品溶液按如下步驟制備:精密稱取鴉蔥藥材粗粉2.00g，置具塞容器中，精密加入70%乙醇50ml，密塞后稱定重量，超聲提取lh，靜置，放冷，70%乙醇補足缺失重量，搖勻，濾過。取濾液適量采用0.45 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。
[0010]對照物溶液按如下步驟制備:取鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)、D (5，7，4'-三羥基黃酮-8-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1ml中黃酮苷Α(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)0.lmg, D (5，7，4'-三羥基黃酮-8-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)0.1mg的混合溶液,搖勻。
[0011]色譜條件為:色譜柱為:PhenomenexGemini5u C18110A(250X4.60mm5micron)柱；流動相為14.6mmol *L_1的磷酸-乙腈；采用梯度洗脫:00min — 15min — 30min — 50min—70min — 75min,乙臆 15%— 18% — 30% — 40% — 66% ;流速 Iml *min-l ;檢測波長為273nm ;進樣量10 μ I ;柱溫25°C。
[0012]本發(fā)明還提供由上述鴉蔥指紋圖譜的建立方法得到的鴉蔥標(biāo)準指紋圖譜。
[0013]將12份鴉蔥樣品按上述方法制備成供試品溶液，在高效液相色譜儀上分離檢測，使用國家藥典委員會的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版》軟件分析，得到鴉蔥標(biāo)準指紋圖譜。
[0014]所述標(biāo)準指紋圖譜有13個特征峰，第7、10號色譜峰分別為對應(yīng)鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-13-D-吡喃葡萄糖碳苷)、鴉蔥黃酮苷D(5，7，4'-三羥基黃酮-8_C-13-D-吡喃葡萄糖碳苷)，圖譜總長度為75min，7號峰平均保留時間為31.65min,以7號峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間和相對峰面積，平均相對保留時間和相對峰面積如下:
[0015]I號峰，平均相對保留時間為0.6916，平均相對峰面積為1.1849 ；
[0016]2號峰，平均相對保留時間為0.7769，平均相對峰面積為0.2001 ；[0017]3號峰，平均相對保留時間為0.8470，平均相對峰面積為0.3560 ；
[0018]4號峰，平均相對保留時間為0.9215，平均相對峰面積為0.3585 ；
[0019]5號峰，平均相對保留時間為0.9515，平均相對峰面積為1.2582 ；
[0020]6號峰，平均相對保留時間為0.9636，平均相對峰面積為0.3097 ；
[0021]7號峰，平均相對保留時間為1.0000，平均相對峰面積為1.0000 ；
[0022]8號峰，平均相對保留時間為1.0439，平均相對峰面積為0.3555 ；
[0023]9號峰，平均相對保留時間為1.1185，平均相對峰面積為0.0643 ；
[0024]10號峰，平均相對保留時間為1.1712，平均相對峰面積為0.6158 ；
[0025]11號峰，平均相對保留時間為1.4673，平均相對峰面積為0.2808 ；
[0026]12號峰，平均相對保留時間為1.5434，平均相對峰面積為0.1145 ；
[0027]13號峰，平均相對保留時間為1.6789，平均相對峰面積為0.1384。
[0028]本發(fā)明所述鴉蔥是菊科植物Scorzonera austriaca Wild的干燥全草。
[0029]本發(fā)明鴉蔥指紋圖譜的建立方法及其特征指紋圖譜有如下顯著的優(yōu)點:
[0030](I)供試品溶液的制備方法簡便，易于操作，試驗周期短，制作的供試品溶液雜質(zhì)少，不易污染色譜柱，所得到的色譜圖雜質(zhì)信號干擾少；
[0031](2)色譜條件容易實現(xiàn)，乙腈系統(tǒng)柱壓較低，有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定。
[0032](3)本發(fā)明以70%乙醇提取鴉蔥中的成分，能最大程度提取中的黃酮類小分子藥效成分，并在此基礎(chǔ)上建立鴉蔥的指紋圖譜方法，使其對鴉蔥的質(zhì)量控制更具針對性和實用性；
[0033](4)本發(fā)明色譜條件下的各特征色譜峰均實現(xiàn)了基線分離，不僅能從整體上對鴉蔥進行模糊識別，也可對比參照物色譜對鴉蔥進行清晰鑒別及鴉蔥的多組分定量分析；
[0034](5)本發(fā)明方法穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、特征峰多，能全面、準確地評價鴉蔥藥材的質(zhì)量，適于對鴉蔥真?zhèn)?、產(chǎn)地和品質(zhì)的鑒別與控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是鴉蔥特征指紋圖譜，圖中從左到右分別是第I至13號特征峰。
[0036]圖2是鴉蔥的參照物圖譜，圖中從左到右分別對應(yīng)圖1中的第7、10號色譜峰，依次分別為鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-13 -D-吡喃葡萄糖碳苷)、鴉蔥黃酮苷D (5，7，4'-三羥基黃酮-8-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)。
【具體實施方式】
[0037]實施例1:鴉蔥指紋圖譜的建立
[0038]I)藥品、試劑和儀器
[0039]鴉蔥藥材共12批，均采集于吉林省伊通；使用Shimadzu LC-10AT VP Plus高效液相色譜儀；試劑為色譜純或分析純；
[0040]2)供試品溶液的制備
[0041]精密稱取鴉蔥藥材粗粉2.00g，置具塞容器中，精密加入70%乙醇50ml，密塞后稱定重量，超聲提取lh，靜置，放冷，70%乙醇補足缺失重量，搖勻，濾過。取濾液適量采用
0.45 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品溶液；[0042]3)參照物溶液的制備
[0043]取鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6_C_ β-D-吡喃葡萄糖碳苷)、D(5, TA'-三羥基黃酮-8_C-13-D-吡喃葡萄糖碳苷)對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每Iml中黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷)0.lmg、D(5，7，4'-三羥基黃酮_8_C-β-D-批喃葡萄糖碳苷)0.1mg的混合溶液，搖勻；
[0044]4)制作鴉蔥指紋圖譜
[0045]色譜柱為Phenomenex Gemini5u C18110A(250X4.60mm5micron)柱；流動相為14.Bmmol.廠1 的憐酸-乙臆；米用梯度洗脫:00min — 15min —30min —50min — 70min — 75min,乙腈 15%— 18%— 30%— 40%— 66% ;流速 Iml.min-1 ;檢測波長為 273nm ;進樣量10 μ I ;柱溫25°C。分別精密吸取供試液溶液和參照物溶液，在以上色譜條件下經(jīng)高效液相色譜儀分離檢測，得到鴉蔥指紋圖譜，見圖1 ;
[0046]按相同色譜條件得參照物的圖譜，見圖2。
[0047]實施例2:鴉蔥標(biāo)準指紋圖譜
[0048]鴉蔥藥材共12批，均采集于吉林省伊通。按本發(fā)明實施例1所述方法得到各批次鴉蔥指紋圖譜，使用國家藥典委員會的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版》軟件分析，得到鴉蔥標(biāo)準指紋圖譜，確定了 13個共有特征峰，見圖1。
[0049]第7、10號色譜峰分別為對應(yīng)鴉蔥黃酮苷A(5，7，3' ，4'-四羥基黃酮-6-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)、鴉蔥黃酮苷D (5，7，4'-三羥基黃酮-8-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)，圖譜總長度為75min，7號峰平均保留時間為31.65min,以7號峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間和相對峰面積，平均相對保留時間和相對峰面積如下:
[0050]I號峰，平均相對保留時間為0.6916，平均相對峰面積為1.1849 ；
[0051]2號峰，平均相對保留時間為0.7769，平均相對峰面積為0.2001 ；
[0052]3號峰，平均相對保留時間為0.8470，平均相對峰面積為0.3560 ；
[0053]4號峰，平均相對保留時間為0.9215，平均相對峰面積為0.3585 ；
[0054]5號峰，平均相對保留時間為0.9515，平均相對峰面積為1.2582 ；
[0055]6號峰，平均相對保留時間為0.9636，平均相對峰面積為0.3097 ；
[0056]7號峰，平均相對保留時間為1.0000，平均相對峰面積為1.0000 ；
[0057]8號峰，平均相對保留時間為1.0439，平均相對峰面積為0.3555 ；
[0058]9號峰，平均相對保留時間為1.1185，平均相對峰面積為0.0643 ；
[0059]10號峰，平均相對保留時間為1.1712，平均相對峰面積為0.6158 ；
[0060]11號峰，平均相對保留時間為1.4673，平均相對峰面積為0.2808 ；
[0061]12號峰，平均相對保留時間為1.5434，平均相對峰面積為0.1145 ；
[0062]13號峰，平均相對保留時間為1.6789，平均相對峰面積為0.1384。
【權(quán)利要求】
1.鴉蔥指紋圖譜的建立方法，其特征在于將鴉蔥制成供試品溶液，經(jīng)高效液相色譜儀分離檢測，獲得鴉蔥的指紋圖譜； 所述方法包括如下步驟: 1)供試品溶液的制備:取鴉蔥藥材粗粉，以乙醇溶液超聲提取，過濾，取濾液適量采用微孔濾膜濾過，作為供試品溶液； 2)參照物溶液的制備:取鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-13-D-吡喃葡萄糖碳苷)、鴉蔥黃酮苷D (5，7，4'-三羥基黃酮-8-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)對照品，溶于甲醇溶液作為參照物溶液； 3)制作鴉蔥指紋圖譜:分別精密吸取供試液溶液和參照物溶液，經(jīng)高效液相色譜儀分離檢測，其中，流動相的組成為14.6mmol.L—1的磷酸溶液-乙腈；采用梯度洗脫；得到鴉蔥指紋圖譜。
2.如權(quán)利要求1所述的鴉蔥指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述供試溶液按如下步驟制備:精密稱取鴉蔥藥材粗粉2.0Og，置具塞容器中，精密加入70%乙醇50ml，密塞后稱定重量，超聲提取lh，靜置，放冷，70 %乙醇補足缺失重量，搖勻，濾過，取濾液適量采用0.45 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的鴉蔥指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述的高效液相色譜儀分離檢測條件為:色譜柱為:Phenomenex Gemini5u C18110A(250X4.60mm5micron)柱；流動相為14.6mmol *L_1的磷酸-乙腈；采用梯度洗脫:00min — 15min — 30min — 50min — 70min — 75min,乙臆 15%— 18% — 30% — 40% — 66% ;流速 Iml.mirf1 ;檢測波長為273nm ;進樣量 10 μ I ;柱溫 25 °C。
4.如權(quán)利要求1所述的鴉蔥指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述的參照物溶液按如下步驟制備:取鴉蔥黃酮苷Α(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-13-D-吡喃葡萄糖碳苷)、D(5，7，4'-三羥基黃酮-8-C-13-D-吡喃葡萄糖碳苷)對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1ml中黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-Οβ -D-吡喃葡萄糖碳苷)0.lmg、D(5，7，4'-三羥基黃酮_8_C-β-D-批喃葡萄糖碳苷)0.1mg的混合溶液，搖勻。
5.由權(quán)利I至4中任一項所述的鴉蔥指紋圖譜的建立方法得到的鴉蔥標(biāo)準指紋圖譜，其特征在于:圖譜總長度為75min，有13個特征峰，第7、10號色譜峰分別為對應(yīng)鴉蔥黃酮苷A(5，7，3'，4'-四羥基黃酮-6-C-13-D-批喃葡萄糖碳苷)、鴉蔥黃酮苷D (5，7，4'-三羥基黃酮-8-C- β -D-吡喃葡萄糖碳苷)，7號峰平均保留時間為31.65min,以7號峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間和 相對峰面積，平均相對保留時間和相對峰面積如下: I號峰，平均相對保留時間為0.6916，平均相對峰面積為1.1849 ； 2號峰，平均相對保留時間為0.7769，平均相對峰面積為0.2001 ； 3號峰，平均相對保留時間為0.8470，平均相對峰面積為0.3560 ； 4號峰，平均相對保留時間為0.9215，平均相對峰面積為0.3585 ； 5號峰，平均相對保留時間為0.9515，平均相對峰面積為1.2582 ； 6號峰，平均相對保留時間為0.9636，平均相對峰面積為0.3097 ； 7號峰，平均相對保留時間為1.0000，平均相對峰面積為1.0000 ； 8號峰，平均相對保留時間為1.0439，平均相對峰面積為0.3555 ； 9號峰，平均相對保留時間為1.1185，平均相對峰面積為0.0643 ；10號峰，平均相對保留時間為1.1712，平均相對峰面積為0.6158 ；11號峰，平均相對保留時間為1.4673，平均相對峰面積為0.2808 ；12號峰，平均相對保留時間為1.5434，平均相對峰面積為0.1145 ； 13號峰，平均相對保留時間為1.6789，平均相對峰面積為0.1384。
【文檔編號】G01N30/06GK103901152SQ201410168988
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】王廣樹, 張爽, 謝揚, 周小平, 孫薇, 王艷, 楊錦竹, 張沐新, 劉銀燕 申請人:吉林大學(xué)