一種檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，包括，富集油脂中極性組分的步驟；將富集到的極性組分分為三組，第一組添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，第二組在酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，第三組經(jīng)固相萃取柱處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5處理的步驟；將處理后三組混合物進行苯硼酸衍生化處理分別得到衍生產(chǎn)物的步驟；將得到的衍生產(chǎn)物分別進行GC-MS檢測的步驟；以及，計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD的含量的步驟。本方法可將油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分別進行檢測，得到游離3-MCPD、3-MCPD單酯和3-MCPD雙酯的含量數(shù)據(jù)?！緦＠f明】—種檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明涉及油脂樣品中危害因子的檢測方法，尤其涉及油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的檢測方法?！?br>背景技術：
】[0002]大量毒理學研究表明，3-氯-1，2-丙二醇(即游離3-MCPD)具有減少精子數(shù)，降低精子活性，并干擾體內(nèi)性激素平衡而減弱雄性動物生殖能力的作用，它可使大鼠致癌，具有潛在的致癌性，且具有腎臟、肝臟和生殖毒性，能造成腎小管增生及肝功能損傷，在體外具有遺傳毒性(ElRamy,R.，OuldElhkim,M.，Lezmi,S.，Poul,J.M.，Evaluationofthegenotoxicpotentialof3-monochloropropane-l,2-diol(3-MCPD)anditsmetabolites,glycidolandbeta-chlorolacticacid,usingthesinglecellgel/cometassay.FoodChemToxicol.2007,45,41-48；Cho,ff.S.,Han,B.S.,Lee,H.,Kim,C.,Nam,K.T.,Park,K.,Choi,M.,Kim,S.J.,Kim,S.H.,Jeong,J.,Jang,D.D.,Subchronictoxicitystudyof3-monochloropropane-l,2-dioladministeredbydrinkingwatertoB6C3Flmice.FoodChemToxicol.2008，46，1666-1673；Cho,ff.S.，Han,B.S.,Nam,K.T.,Park,K.,Choi,M.,Kim,S.H.,Jeong,J.,Jang,D.D.,Carcinogenicitystudyof3-monochloropropane-l,2-diolinSprague-Dawleyrats.FoodChemToxicol.2008,46,3172-3177;Kim,K.,Differentialexpressionofneuronalandinduciblenitricoxidesynthaseinratbrainaftersubchronicadministrationof3-monochloro-l,2-propanediol.FoodChemToxicol.2008，46，955-960)。鑒于3-MCPD的毒性，2001年6月WH0/FA0食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)第57次會議對3-MCPD的危險性進行了評估，根據(jù)最敏感的腎臟毒性提出暫定3-MCPD人體每日最大耐受攝入量(PMTDI)為2μg/kg體重(以安全系數(shù)為500計)((JECFA),J.F.ff.E.C.0.F.A.:Safetyevaluationofcertainfoodadditivesandcontaintspreparedbythefifty-seventhmeetingoftheJointFAO/WHOExpertComitteeonFoodAdditives(JECFA),in:WHOFoodAdditivesSeries48,WHO,Genevs2002,pp.401-432)。油脂中結(jié)合3-MCPD以3-氯-1，2_丙二醇酯(3-MCPDE)的形式存在，是油脂及含油脂食品在熱加工過程中形成的副產(chǎn)物。3-MCPDE是3-MCPD的一個或兩個羥基分別與脂肪酸發(fā)生酯化反應而生成的化合物，有3-氯-1，2-丙二醇雙酯、3-氯-1，2-丙二醇-1-單酯、3-氯-1，2-丙二醇-2-單酯三種。由于3-MCPDE在特定的條件下可水解形成游離的3-MCPD從而表現(xiàn)其毒性，因此研究學者認為其是一種潛在的食品安全危害因子。[0003]最新研究表明3-氯-1，2-丙二醇-1-單酯的毒性要高于3-氯-1，2-丙二醇雙酯(Liu，Μ.，Gao,B.Y.，Qin,F.，Wu,P.P.，Shi,H.M.，Luo,ff.，Ma,A.N.，Jiang,Y.R.，Xu,X.B.,Yu,L.L.,Acuteoraltoxicityof3-MCPDmono-andd1-palmiticestersinSwissmiceandtheircytotoxicityinNRK-52Eratkidneycells.FoodChemToxicol.2012，50，3785-3791)，它們都可作為腸道脂肪酶的底物，但3-氯_1，2_丙二醇-1-單酯生成3-MCPD的速率要快于3-氯-1，2-丙二醇雙酯(Seefelder，ff.，Varga,N.,Studer,A.,Williamson,G.,ScanIan,F.P.,Stadler,R.H.,Estersof3-chloro-l,2-propanediol(3-MCPD)invegetableoils:significanceintheformationof3-MCPD.Foodadditives&contaminants.PartA,Chemistry,analysis,control,exposure&riskassessment.2008，25，391-400)，前者可被Caco_2細胞水解，后者則明顯被Caco_2細胞吸收和代謝(Buhrke,T.,ffeisshaar,R.,Lampen,A.,Absorptionandmetabolismofthefoodcontaminant3-chloro_l,2-propanediol(3-MCPD)anditsfattyacidestersbyhumanintestinalCaco-2cells.ArchToxicol.2011,85,1201-1208)。因此有如下結(jié)論:在人體腸道中3-氯-1，2-丙二醇-1-單酯可水解，腸道細胞有能力代謝3-氯-1，2-丙二醇雙酯，從而使3-氯-1，2-丙二醇-1-單酯的毒性高于3-氯-1，2-丙二醇雙酉旨(Buhrke,T.,ffeisshaar,R.,Lampen,A.,Absorptionandmetabolismofthefoodcontaminant3-chloro_l,2-propanediol(3-MCPD)anditsfattyacidestersbyhumanintestinalCaco-2cells.ArchToxicol.2011,85,1201-1208)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)論，3-MCPD單酯對人體健康的危害更大些，為進一步研究油脂中3-MCPDE這種潛在的食品安全危害因子對人體健康的危害程度，準確的測定出不同存在形式的3-MCPD(尤其是3-MCPD單酯)含量是非常關鍵的。[0004]文獻報道的檢測油脂中游離及結(jié)合3-MCPD的方法中，根據(jù)所針對的目標化合物的種類，可以大體分為兩類:間接法和直接法。間接法是通過將結(jié)合3-MCPD通過堿催化、酶催化或酸催化的方法進行醇解后生成游離3-MCPD，再對游離3-MCPD進行衍生化反應后通過GC-MS檢測；直接法是將結(jié)合3-MCPD通過LC-MS進行分析，而不需進行醇解操作。由于油脂組成中脂肪酸的種類較多，按照植物油中主要的7種脂肪酸來計算，3-MCPDE在甘油骨架sn-1、sn-2位的排列組合的種類就有63種之多，若將其余種類的脂肪酸也統(tǒng)計進來，3-MCPDE的種類將更加繁多。直接測定方法的主要缺陷就在于可商品化供應的3-氯丙醇酯及相應的氘代3-氯丙醇酯的種類有限，無法從市場上購買到不同碳數(shù)脂肪酸組成的3-氯丙醇酯及相應的氘代3-氯丙醇酯化合物標準品，要想對油脂樣品中的3-氯丙醇酯用3-氯丙醇酯及相應的氘代3-氯丙醇酯化合物標準品進行一一的對應非常困難。因此，目前研究學者多數(shù)采用間接法對游離及結(jié)合3-MCPD進行檢測。但是目前將油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分別進行檢測的方法尚未見文獻報道?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。[0006]鑒于上述和/或現(xiàn)有檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法中存在的問題，提出了本發(fā)明。[0007]因此，本發(fā)明的目的是提供了一種靈敏度高、重復性好的用于檢測油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的方法，在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等許多分析領域有著較高的應用價值。[0008]為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下技術方案:一種檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，包括，富集油脂中極性組分的步驟；將富集到的極性組分分為三組，第一組添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，第二組在酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，第三組經(jīng)固相萃取柱處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5處理的步驟；將處理后三組混合物進行苯硼酸衍生化處理分別得到衍生產(chǎn)物的步驟；將得到的衍生產(chǎn)物分別進行GC-MS檢測的步驟；以及，計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD的含量的步驟。[0009]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:所述富集油脂中極性組分的步驟中采用的富集方法為，稱取油脂并添加油脂體積2.5?6倍的乙腈，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將乙腈相轉(zhuǎn)出，真空條件下50?55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干乙腈得到干殘渣。[0010]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:將所述干殘渣用體積比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷溶液溶解，上樣到活化好的硅膠SPE固相萃取柱，用體積比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷洗脫，并收集洗脫液，于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑得到殘留物。[0011]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:將所述干殘渣和所述殘留物分別用THF溶解并添加98%濃度的硫酸與甲醇體積比1:100?1.8:100的溶液，40°C水浴加熱16?24h，室溫冷卻，加飽和碳酸氫鈉溶液中和，旋渦振蕩充分混勻，添加適量氘代3-氯-1，2-丙二醇內(nèi)標，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶齊U，然后用超純水溶解，添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，再次添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，水相用于后續(xù)衍生化處理。[0012]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:將所述干殘渣用THF溶解，添加濃度0.001mg/mL的內(nèi)標3-MCPD_d5，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，然后用超純水溶解，添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，再次添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，水相用于后續(xù)衍生化處理。[0013]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:將得到的所述水相，添加衍生劑，于80?90°C水浴加熱30?40min后室溫冷卻，加入適量正己烷，旋渦振蕩，充分混勻，靜置分層后將上層正己烷相移入塑料離心管中，10000轉(zhuǎn)/分，離心分離lOmin，將上層正己烷相進行有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)入玻璃進樣瓶中，準備進行GC-MS分析。[0014]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:所述的GC-MS檢測采用的色譜柱為TR-5MS，程序升溫條件為，以10°C/min速率從50°C升至190°C，然后以30°C/min速率從190°C升至270°C，在270°C保持5min，以30C/min速率從270°C升至300°C，在300°C保持IOmin。[0015]作為本發(fā)明所述檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一種優(yōu)選方案，其中:所述的計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的方法為，將所述第一組中添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，然后進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為Al;將所述第二組中酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，然后進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A2;將所述第三組中固相萃取柱處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，然后進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A3;游離3-MCPD含量記為B，結(jié)合3-MCPD中3-MCPD單酯記為C1，3_MCPD雙酯記為C2，則計算公式為B=Al,C1=A2-A1-A3,C2=A3。[0016]本發(fā)明方法包括富集油脂中的極性組分、將得到的極性組分分別進行添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5和固相萃取柱前處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5的處理后進行苯硼酸衍生化處理、衍生產(chǎn)物進行GC-MS檢測并計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的步驟，可將油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分別進行檢測，得到游離3-MCPD、3-MCPD單酯和3-MCPD雙酯的含量數(shù)據(jù)?！揪唧w實施方式】[0017]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做詳細的說明。[0018]在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。[0019]其次，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。[0020]實施例1[0021]用于油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的檢測方法:[0022]量取IOmL—級大豆油(準確稱量其質(zhì)量為9.12g)于50mL螺旋蓋玻璃試管中，添加25mL乙腈，旋渦振蕩，充分混勻I?3min之后靜置分層約I小時，用一次性吸管將上層乙腈相移入25mL量筒中，讀取乙腈相的體積數(shù)并準確記錄，然后將量筒中的乙腈相移入IOOmL圓底燒瓶中，并用適量乙腈(約3mL)清洗量筒，清洗用的乙腈并入IOOmL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑4°C冰箱冷藏備用。[0023](I)游離型的3-MCPD測定的進一步處理:[0024]上述殘渣用2.5mL四氫呋喃(THF)溶解，移取ImL該四氫呋喃溶液添加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)移入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘渣用2mL超純水重溶，用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行后續(xù)GC-MS分析的衍生化處理。[0025](2)結(jié)合型的3-MCPD測定的進一步處理:[0026]上述殘渣用2.5mL四氫呋喃(THF)溶解，移取ImL該四氫呋喃溶液添加1.8mL硫酸液(98%濃度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，然后密閉，40°C水浴加熱16h，室溫冷卻，加0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液(5%濃度)中和，振蕩混勻，加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)，將混合物轉(zhuǎn)入25mL圓底燒瓶中，并用適量THF(約2mL)清洗圓底燒瓶，清洗用的THF并入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘洛用2mL超純水重溶,用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行后續(xù)GC-MS分析的衍生化處理。[0027](3)3-MCPD雙酯測定的進一步處理:[0028]上述殘渣用20mL濃度2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(體積比))溶解，移取ImL該溶解液并用2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(體積比))定容至10mL，將定容后的2mL樣品上樣到活化好的硅膠SPE固相萃取柱(505048SupelcoSupelcleanTMLC-SiSPETubebed)，用11.5mL濃度2%的乙醚-正己烷洗脫并收集洗脫液(共收集13.5mL于圓底燒瓶中)，于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，添加ImLTHF移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，添加1.8mL硫酸液(98%濃度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)，密閉，40°C水浴加熱16h—室溫冷卻，加0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液(5%濃度)中和，振蕩混勻，加ImL內(nèi)標3-MCPD_d5(濃度0.001mg/mL)，將混合物轉(zhuǎn)入25mL圓底燒瓶中，并用適量THF(約2mL)清洗圓底燒瓶，清洗用的THF并入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘渣用2mL水(娃哈哈純凈水)重溶，用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己燒，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行苯硼酸衍生化。[0029]苯硼酸衍生化處理:[0030]將ImL上述水相添加400μL衍生劑(5g苯硼酸溶解于19mL丙酮+ImL水)移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，密閉，90°C水浴加熱30min，室溫冷卻后加入3mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相約2mL移入塑料離心管中，于10000轉(zhuǎn)/分，離心分離IOmin后將上層正己烷相進行有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)入2mL玻璃進樣瓶中，用封口膜封口，于冰箱冷凍室儲藏備用，準備進行GC-MS分析。[0031]苯硼酸衍生產(chǎn)物的GC-MS檢測:[0032]采用的色譜柱為TR-5MS(0.25mmX30m,0.25μm)，程序升溫條件為:以10°C/min速率從50°C(Imin)升至190°C，然后以30°C/min速率從190°C升至270°C，在270°C保持5min,以3°C/min速率從270°C升至300°C，在300°C保持IOmin；內(nèi)標3-MCPD_d5用于定量。[0033]計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的方法:[0034]將權利要求1所述的步驟(2)中添加內(nèi)標物3-MCPD_d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為Al，將權利要求1所述的步驟(2)中酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A2，將權利要求1所述的步驟(2)中固相萃取柱前處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A3，游離3-MCPD含量記為B，結(jié)合3-MCPD中3-MCPD單酯記為C1、3-MCPD雙酯記為C2[0035]檢測的Al為2.4μg/kg,A2為4.5μg/kg,A3為4μg/kg。[0036]根據(jù)計算公式B=Al，為2.4μg/kg;C1=A2-A1_A3，為0.5μg/kg,C2=A3,為4μg/kgο[0037]實施例2[0038]用于油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的檢測方法:[0039]量取IOmL食用調(diào)和油(準確稱量其質(zhì)量為9.02g)于50mL螺旋蓋玻璃試管中，添加25mL乙腈，旋渦振蕩，充分混勻I?3min之后靜置分層約I小時，用一次性吸管將上層乙腈相移入25mL量筒中，讀取乙腈相的體積數(shù)并準確記錄，然后將量筒中的乙腈相移入IOOmL圓底燒瓶中，并用適量乙腈(約3mL)清洗量筒，清洗用的乙腈并入IOOmL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑4°C冰箱冷藏備用。[0040](I)游離型的3-MCPD測定的進一步處理:[0041]上述殘渣用2.5mL四氫呋喃(THF)溶解，移取ImL該四氫呋喃溶液添加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)移入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘渣用2mL超純水重溶，用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行后續(xù)GC-MS分析的衍生化處理。[0042](2)結(jié)合型的3-MCPD測定的進一步處理:[0043]上述殘渣用2.5mL四氫呋喃(THF)溶解，移取ImL該四氫呋喃溶液添加1.8mL硫酸液(98%濃度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，然后密閉，40°C水浴加熱16h，室溫冷卻，加0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液(5%濃度)中和，振蕩混勻，加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)，將混合物轉(zhuǎn)入25mL圓底燒瓶中，并用適量THF(約2mL)清洗圓底燒瓶，清洗用的THF并入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘洛用2mL超純水重溶,用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行后續(xù)GC-MS分析的衍生化處理。[0044](3)3-MCPD雙酯測定的進一步處理:[0045]上述殘渣用20mL濃度2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(體積比))溶解，移取ImL該溶解液并用2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(體積比))定容至IOmL，將定容后的2mL樣品上樣到活化好的硅膠SPE固相萃取柱(7086-03硅膠SPE萃取柱J.T.Baker),用11.5mL濃度2%的乙醚-正己烷洗脫并收集洗脫液(共收集13.5mL于圓底燒瓶中)，于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，添加ImLTHF移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，添加1.8mL硫酸液(98%濃度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)，密閉，40°C水浴加熱16h—室溫冷卻，加0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液(5%濃度)中和，振蕩混勻，加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)，將混合物轉(zhuǎn)入25mL圓底燒瓶中，并用適量THF(約2mL)清洗圓底燒瓶，清洗用的THF并入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘渣用2mL水(娃哈哈純凈水)重溶，用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行苯硼酸衍生化。[0046]苯硼酸衍生化處理:[0047]將ImL上述水相添加400μL衍生劑(5g苯硼酸溶解于19mL丙酮+ImL水)移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，密閉，80°C水浴加熱40min，室溫冷卻后加入3mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相約2mL移入塑料離心管中，于10000轉(zhuǎn)/分，離心分離IOmin后將上層正己烷相進行有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)入2mL玻璃進樣瓶中，用封口膜封口，于冰箱冷凍室儲藏備用，準備進行GC-MS分析。[0048]苯硼酸衍生產(chǎn)物的GC-MS檢測:[0049]采用的色譜柱為TR-5MS(0.25mmX30m,0.25μm)，程序升溫條件為:以10°C/min速率從50°C(Imin)升至190°C，然后以30°C/min速率從190°C升至270°C，在270°C保持5min,以3°C/min速率從270°C升至300°C，在300°C保持IOmin；內(nèi)標3-MCPD_d5用于定量。[0050]計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的方法:[0051]將權利要求1所述的步驟(2)中添加內(nèi)標物3-MCPD_d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為Al，將權利要求1所述的步驟(2)中酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A2，將權利要求1所述的步驟(2)中固相萃取柱前處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A3，游離3-MCPD含量記為B，結(jié)合3-MCPD中3-MCPD單酯記為C1、3-MCPD雙酯記為C2[0052]檢測的Al為63.8μg/kg,A2為17.9μg/kg,A3為15.9μg/kg。[0053]根據(jù)計算公式B=Al，為63.8μg/kg;C1=A2-A1_A3，為2.0μg/kg,C2=A3，為15.9μg/kg。[0054]實施例3[0055]用于油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的檢測方法:[0056]量取IOmL玉米胚芽油(準確稱量其質(zhì)量為9.13g)于50mL螺旋蓋玻璃試管中，添加25mL乙腈，旋渦振蕩，充分混勻I?3min之后靜置分層約I小時，用一次性吸管將上層乙腈相移入25mL量筒中，讀取乙腈相的體積數(shù)并準確記錄，然后將量筒中的乙腈相移入IOOmL圓底燒瓶中，并用適量乙腈(約3mL)清洗量筒，清洗用的乙腈并入IOOmL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑4°C冰箱冷藏備用。[0057](I)游離型的3-MCPD測定的進一步處理:[0058]上述殘渣用2.5mL四氫呋喃(THF)溶解，移取ImL該四氫呋喃溶液添加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)移入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘渣用2mL超純水重溶，用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行后續(xù)GC-MS分析的衍生化處理。[0059](2)結(jié)合型的3-MCPD測定的進一步處理:[0060]上述殘渣用2.5mL四氫呋喃(THF)溶解，移取ImL該四氫呋喃溶液添加1.8mL硫酸液(98%濃度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，然后密閉，40°C水浴加熱16h，室溫冷卻，加0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液(5%濃度)中和，振蕩混勻，加ImL內(nèi)標3-MCPD-d5(濃度0.001mg/mL)，將混合物轉(zhuǎn)入25mL圓底燒瓶中，并用適量THF(約2mL)清洗圓底燒瓶，清洗用的THF并入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘洛用2mL超純水重溶,用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min，靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行后續(xù)GC-MS分析的衍生化處理。[0061](3)3-MCPD雙酯測定的進一步處理:[0062]上述殘渣用20mL濃度2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(體積比))溶解，移取ImL該溶解液并用2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(體積比))定容至10mL，將定容后的2mL樣品上樣到活化好的硅膠SPE固相萃取柱(CertifiedSep-PakSilica[186004615]WaterS)，用11.5mL濃度2%的乙醚-正己烷洗脫并收集洗脫液(共收集13.5mL于圓底燒瓶中)，于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，添加ImLTHF移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，添加1.8mL硫酸液(98%濃度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)，密閉，40°C水浴加熱16h—室溫冷卻，加0.5mL飽和碳酸氫鈉溶液(5%濃度)中和，振蕩混勻，加ImL內(nèi)標3-MCPD_d5(濃度0.001mg/mL)，將混合物轉(zhuǎn)入25mL圓底燒瓶中，并用適量THF(約2mL)清洗圓底燒瓶，清洗用的THF并入25mL圓底燒瓶中，于55°C，真空條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，殘渣用2mL水(娃哈哈純凈水)重溶，用一次性吸管將水相移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，加入2mL正己燒，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，再次加入2mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相移出并舍棄，水相準備進行苯硼酸衍生化。[0063]苯硼酸衍生化處理:[0064]將ImL上述水相添加400μL衍生劑(5g苯硼酸溶解于19mL丙酮+ImL水)移入IOmL螺旋蓋玻璃試管中，密閉，85°C水浴加熱35min，室溫冷卻后加入3mL正己烷，旋渦振蕩，充分混勻I?3min后靜置分層，用一次性吸管將上層正己烷相約2mL移入塑料離心管中，于10000轉(zhuǎn)/分，離心分離IOmin后將上層正己烷相進行有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)入2mL玻璃進樣瓶中，用封口膜封口，于冰箱冷凍室儲藏備用，準備進行GC-MS分析。[0065]苯硼酸衍生產(chǎn)物的GC-MS檢測:[0066]采用的色譜柱為TR-5MS(0.25mmX30m,0.25μm)，程序升溫條件為:以10°C/min速率從50°C(Imin)升至190°C，然后以30°C/min速率從190°C升至270°C，在270°C保持5min,以3°C/min速率從270°C升至300°C，在300°C保持IOmin；內(nèi)標3-MCPD_d5用于定量。[0067]計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的方法:[0068]將權利要求1所述的步驟(2)中添加內(nèi)標物3-MCPD_d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為Al，將權利要求1所述的步驟(2)中酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A2，將權利要求1所述的步驟(2)中固相萃取柱前處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5、進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A3，游離3-MCPD含量記為B，結(jié)合3-MCPD中3-MCPD單酯記為C1、3-MCPD雙酯記為C2[0069]檢測的Al為20.1μg/kg,A2為Oμg/kg,A3為Oμg/kg。[0070]根據(jù)計算公式B=Al，為20.1μg/kg;C1=A2-A1_A3，為Oμg/kg，C2=A3，為Oμg/kg。[0071]由此可見，本發(fā)明方法所用到的固相萃取柱具有如下優(yōu)點:無篩板，完美避免了由篩板引起的“非特異性吸附”;填料穩(wěn)固性能良好，不會出現(xiàn)常見的填料松散等問題；整體填料一體化設計，有效避免了“溝渠效應”;可選用粒徑低至8?10微米的填料，極大地提高了分離效能和載樣量。目前在固相萃取柱中最常用的吸附劑仍然是硅膠或鍵合硅膠，其PH適用范圍2?8。本發(fā)明方法包括富集油脂中的極性組分、將得到的極性組分分別進行添加內(nèi)標物3-MCPD_d5、酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD_d5和固相萃取柱如處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5的處理后進行苯硼酸衍生化處理、衍生產(chǎn)物進行GC-MS檢測并計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的步驟，可將油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分別進行檢測，得到游離3-MCPD、3-MCPD單酯和3-MCPD雙酯的含量數(shù)據(jù)。[0072]應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中?！緳嗬蟆?.一種檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:包括，富集油脂中極性組分的步驟；將富集到的極性組分分為三組，第一組添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，第二組在酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，第三組經(jīng)固相萃取柱處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5處理的步驟；將處理后三組混合物進行苯硼酸衍生化處理分別得到衍生產(chǎn)物的步驟；將得到的衍生產(chǎn)物分別進行GC-MS檢測的步驟；以及，計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD的含量的步驟。2.根據(jù)權利要求1所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:所述富集油脂中極性組分的步驟中采用的富集方法為，稱取油脂并添加油脂體積2.5~6倍的乙腈，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將乙腈相轉(zhuǎn)出，真空條件下50~55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干乙腈得到干殘渣。3.根據(jù)權利要求2所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:將所述干殘渣用體積比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷溶液溶解，上樣到活化好的硅膠SPE固相萃取柱，用體積比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷洗脫，并收集洗脫液，于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑得到殘留物。4.根據(jù)權利要求2或3所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:將所述干殘渣和所述殘留物分別用THF溶解并添加98%濃度的硫酸與甲醇體積比1:100~1.8:100的溶液，40°C水浴加熱16~24h，室溫冷卻，加飽和碳酸氫鈉溶液中和，旋渦振蕩充分混勻，添加適量氘代3-氯-1，2-丙二醇內(nèi)標，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，然后用超純水溶解，添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，再次添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，水相用于后續(xù)衍生化處理。5.根據(jù)權利要求2所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:將所述干殘渣用THF溶解，添加濃度0.001mg/mL的內(nèi)標3-MCPD_d5，真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，然后用超純水溶解，添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，再次添加正己烷，旋渦振蕩充分混勻，待分層后將正己烷相棄去，水相用于后續(xù)衍生化處理。6.根據(jù)權利要求4或5所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:將得到的所述水相，添加衍生劑，于80~90°C水浴加熱30~40min后室溫冷卻，加入適量正己烷，旋渦振蕩，充分混勻，靜置分層后將上層正己烷相移入塑料離心管中，10000轉(zhuǎn)/分，離心分離lOmin，將上層正己烷相進行有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)入玻璃進樣瓶中，準備進行GC-MS分析。7.根據(jù)權利要求1所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:所述的GC-MS檢測采用的色譜柱為TR-5MS，程序升溫條件為，以10°C/min速率從50°C升至190°C，然后以30°C/min速率從190°C升至270°C，在270°C保持5min，以3°C/min速率從270°C升至300°C，在300°C保持IOmin。8.根據(jù)權利要求1所述的檢測油脂中游離及結(jié)合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:所述的計算油脂中游離及結(jié)合3-MCPD含量的方法為，將所述第一組中添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，然后進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為Al；將所述第二組中酸催化醇解后添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，然后進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A2；將所述第三組中固相萃取柱處理后進行酸催化醇解并添加內(nèi)標物3-MCPD-d5，然后進行苯硼酸衍生化處理后檢測到的3-MCPD含量記為A3；游離3-MCPD含量記為B，結(jié)合3-MCPD中3-MCPD單酯記為Cl，3-MCPD雙酯記為C2，則計算公式為B=A1，C1=A2-A1-A3,C2=A3。【文檔編號】G01N30/06GK103913523SQ201410117872【公開日】2014年7月9日申請日期:2014年3月26日優(yōu)先權日:2014年3月26日【發(fā)明者】金青哲,周紅茹,紀聰利,曾君瑞,王興國,劉睿杰,鄒孝強申請人:江南大學