一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器。該免疫傳感器利用電極表面修飾技術，將制備碳納米管-離子液體-殼聚糖（MWCNTs-IL-CS）復合物修飾在電極表面，再滴加合成的基金納米粒子（AuNPs）在修飾的電極表面，在修飾己烯雌酚的完全抗原DES-BSA在表面，同時修飾抗體復合物（PRGO-Au-Ab-HRP）和己烯雌酚標準品在電極表面，DES-BSA和標準品同時競爭結合抗體復合物上抗體的結合位點，改變標準品的濃度，在檢測底液添加過氧化氫（H2O2）前后，通過信號變化和標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線?？捎糜跈z測食品中的己烯雌酚。本發(fā)明的電化學免疫傳感器選擇性強、靈敏度高、操作簡單快速，適合檢測食品中的己烯雌酚。
【專利說明】—種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料和食品添加劑，提供了一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器，可以用于食品中己烯雌酚的檢測。
【背景技術】
[0002]己烯雌酚(DES)是一種合成的非留體類激素，廣泛用于臨床醫(yī)學和作為動物生長促進劑。近來，許多研究表明己烯雌酚是一種潛在的致癌物質，在美國和許多歐盟國家，己烯雌酚被禁止用于促進動物生長等方面。因此，建立一種快速、靈敏的，簡單的檢測方法是非常有必要的，目前報道的檢測己烯雌酚的方法主要包括氣相色譜-質譜分析法、化學反光發(fā)和加壓毛細管電色譜非法等，這些方法往往需要復雜的處理步驟，并且一起操作復雜，檢測時間較長。

【發(fā)明內容】

[0003]本研究實現了一種利用免疫反應結合電化學檢測食品中的己烯雌酚的方法，具有靈敏度高，操作簡單及成本低廉等優(yōu)勢。通過在金電極表面修飾一層納米復合物，用來放大傳感器的電信號，然后在將己烯雌酚完全抗原修飾在電極表面，通過其和己烯雌酚的標準品競爭結合被標記的抗體復合物，這樣結合在電極表面的抗體復合物上的酶就可以催化底物產生電信號。利用電信號變化和己烯雌酚標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線，這樣就可以達到檢測己烯雌酚含量的目的。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的內容之一是提供了 一種檢測食品中己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法。
[0005]本發(fā)明的內容之二是將構建的免疫傳感器，用于檢測食品中的己烯雌酚。
[0006]本發(fā)明的技術方案，包括以下步驟:
1、一種檢測食品中己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟；
(I)碳納米管-離子液體-殼聚糖納米復合物(MWCNTS-1L-CS)和金納米粒子的制備:50 mg的殼聚糖溶于20 ml的1%的乙酸中，得到殼聚糖溶于，一定量的碳納米管和粒子通過超聲溶于得到的殼聚糖溶液中，得到MWCNTs-1L-CS。
[0007]取I ml，1%的HAuCl4.4H20溶于99 ml水中，加入一定量的檸檬酸鈉溶液，100°C回流I h,得到AuNPs納米粒子。
[0008](2)抗體復合物的制備:
10 mg DA和I mg GO溶于10 ml pH為8.5的PBS中，超聲2 min，形成均勻的分散溶。60°C攪拌 24 h，得至IJ PRG0，重新溶于 10 ml 水中；500 μ I HAuCl4.4Η20 (10 mg/mL)加如上述得到的溶液中，攪拌2 h后，再加入一定量的檸檬酸鈉溶液，攪拌2 h，離心清洗，再溶于 10 ml 水中；最后，100 μ 1,1 mg/mL 的 HRP 和 100 μ 1,5 μ g/mL 的 Ab 加入到 2 ml 上述溶液中，4°C攪拌一夜，用PBS緩沖液離心清洗，溶于2 ml含有1%BSA的PBS中備用。
[0009](3)檢測己烯雌酚免疫傳感器的制備:
滴加10μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；再滴加20 μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；滴加一定量的己烯雌酚完全抗原DES-BSA在修飾電極表面，室溫下干燥，每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。
[0010]如上所述制備的一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器，用于檢測己烯雌酚的步驟如下:
(1)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測，掃描電壓是0.6一-0.6 V，檢測添加H2O2前后電化學信號的變化和己烯雌酚標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線；
(2)將待測物代替己烯雌酚標準品，按照工作曲線的方法進行檢測。
[0011]所述的一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器，所用材料均在化學試劑公司購買。
[0012]本發(fā)明體現的優(yōu)勢和特點是:
(1)本發(fā)明采用的MWCNTs-1L-CS復合物導電能力強，生物相容性好，成為構建電化學免疫傳感器的優(yōu)良材料；
(2)本發(fā)明制備的傳感器靈敏度高、檢測速度快、操作簡單；
(3)本發(fā)明檢測己烯雌酚的方法，操作簡單、快速，便于實際檢測。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，還應理解，在閱讀了本發(fā)明所講述的內容以后，本領域技術人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所述權利要求書所限定的范圍。
[0014]實施例1
一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法，步驟如下:
(1)10 μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；
(2)滴加20μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；
(3)滴加一定量的己烯雌酹完全抗原DES-BSA在修飾電極表面,室溫下干燥,每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。
[0015](4)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在(3)修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測。
[0016]實施例2
一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法，步驟如下:
(1)20 μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；
(2)滴加20μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥； (3)滴加一定量的己烯雌酹完全抗原DES-BSA在修飾電極表面,室溫下干燥,每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。
[0017](4)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在(3)修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測電化學信號的變化。
[0018]實施例3
(1)20 μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；
(2)滴加10μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；
(3)滴加一定量的己烯雌酹完全抗原DES-BSA在修飾電極表面,室溫下干燥,每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。
[0019](4)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在(3)修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測電化學信號的變化。
[0020]實施例4
(1)10 μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；
(2)滴加20μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；
(3)滴加一定量的己烯雌酹完全抗原DES-BSA在修飾電極表面,室溫下干燥,每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。
[0021](4)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在(3)修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測。掃描電壓是0.6—-0.6 V，檢測添加H2O2前后電化學信號的變化和己烯雌酚標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線；
實施例5
(1)10 μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；
(2)滴加20μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；
(3)滴加一定量的己烯雌酹完全抗原DES-BSA在修飾電極表面,室溫下干燥,每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。
[0022](4)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在(3)修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測。掃描電壓是0.6—-0.6 V，檢測添加H2O2前后電化學信號的變化和己烯雌酚標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線；
(5)將待測物代替己烯雌酚標準品，按照工作曲線的方法進行檢測。
[0023](6)采用電化學免疫傳感器檢測從市場購買的牛奶樣品1，平均檢測6次，未檢測出含有己烯雌酚，屬于合格樣品；加標回收試驗，其相對標準偏差為4.5%。
[0024]實施例6
(1)10 μ I的MWCNTs-1L-CS在處理好的金電極表面，室溫下干燥；
(2)滴加20μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；
(3)滴加一定量的己烯雌酹完全抗原DES-BSA在修飾電極表面,室溫下干燥,每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。[0025](4)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在(3)修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測。掃描電壓是0.6—-0.6 V，檢測添加H2O2前后電化學信號的變化和己烯雌酚標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線；
(5)將待測物代替己烯雌酚標準品，按照工作曲線的方法進行檢測。
[0026](6)采用電化學免疫傳感器檢測從市場購買的牛奶樣品2，平均檢測6次，未檢測出含有己烯雌酚，屬于合格樣品；加標回收試驗，其相對標準偏差為5.3%。
【權利要求】
1.一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器，其特征在于，包括以下步驟: (1)碳納米管-離子液體-殼聚糖納米復合物(MWCNTS-1L-CS)和金納米粒子的制備: 50 mg的殼聚糖溶于20 ml的1%的乙酸中，得到殼聚糖溶于，一定量的碳納米管和粒子通過超聲溶于得到的殼聚糖溶液中，得到MWCNTs-1L-CS ;取I ml，1%的HAuCl4.4H20溶于99 ml水中，加入一定量的檸檬酸鈉溶液，100°C回流I h，得到AuNPs納米粒子； (2)抗體復合物的制備: 10 mg DA和I mg GO溶于10 ml pH為8.5的PBS中，超聲2 min，形成均勻的分散溶；60°C攪拌 24 h，得至IJ PRG0，重新溶于 10 ml 水中；500 μ I HAuCl4.4Η20 (10 mg/mL)加如上述得到的溶液中，攪拌2 h后，再加入一定量的檸檬酸鈉溶液，攪拌2 h，離心清洗，再溶于 10 ml 水中；最后，100 μ 1,1 mg/mL 的 HRP 和 100 μ 1,5 μ g/mL 的 Ab 加入到 2 ml 上述溶液中，4°C攪拌一夜，用PBS緩沖液離心清洗，溶于2 ml含有1%BSA的PBS中備用； (3)檢測己烯雌酚免疫傳感器的制備: 滴加10 μ I的MWCNTs-1L-Cs在處理好的金電極表面，室溫下干燥；再滴加20 μ I的AuNPs在修飾的電極表面，室溫下干燥；再滴加一定量的己烯雌酚完全抗原DES-BSA在修飾電極表面，室溫下干燥，每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極。
2.如權利要求1所述的制備的一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器，用于檢測己烯雌酚的步驟如下:(1)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對電極，在修飾電極表面同時滴加己烯雌酚標準品和抗體復合物并作為工作電極，連接電化學工作站，在含有H2O2和HQ的PBS底液中，通過循環(huán)伏安法檢測，掃描電壓是0.6一-0.6 V，檢測添加H2O2前后電化學信號的變化和己烯雌酚標準品濃度之間的關系，繪制工作曲線； (2)將待測物代替己烯雌酚標準品，按照工作曲線的方法進行檢測。
【文檔編號】G01N27/48GK103698383SQ201310696498
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權日:2013年12月18日
【發(fā)明者】黃加棟, 李 杰, 劉素 申請人:濟南大學