一種檢測(cè)17β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)17β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器。該免疫傳感器利用電極表面修飾技術(shù)，將制備的氧化石墨烯-聚苯胺復(fù)合物(GO-PANI)修飾電極表面，然后通過電聚合的方法在電極表面聚合一層鉑金合金（Au-PtNPs），再修飾17β-雌二醇完全抗原在電極表面，同時(shí)修飾抗體復(fù)合物（PDA-PtNPs-AuNPs-Ab-HRP）和17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在電極表面，這樣其完全抗原和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體復(fù)合物上的抗體，結(jié)合在電極表面的抗體復(fù)合物上的HRP催化底物H2O2產(chǎn)生信號(hào)，這樣通過添加底物H2O2前后的信號(hào)變化和標(biāo)準(zhǔn)品濃度之前的關(guān)系繪制工作曲線，達(dá)到檢測(cè)17β-雌二醇的目的。本文發(fā)明的PDA-PtNPs-AuNPs納米材料是第一次合成，且GO-PANI復(fù)合物導(dǎo)電性能強(qiáng)，Au-PtNPs納米合金具有良好的生物相容性，對(duì)H2O2具有一定的催化性能。電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度高，檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)周期短。便于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)。
【專利說明】—種檢測(cè)17β -雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料和食品添加劑檢測(cè)領(lǐng)域，提供了一種檢測(cè)17 β -雌二醇的的電化學(xué)免疫傳感器，可以用于檢測(cè)食品中的17 β-雌二醇。
【背景技術(shù)】
[0002]雌激素是一種G 18類固醇激素，目前在人體中發(fā)現(xiàn)的雌激素有三種:雌二醇、雌酮和雌三醇，其中雌二醇的生物活性最強(qiáng)。雌二醇可以和體內(nèi)雌激素受體結(jié)合，改變內(nèi)分泌系統(tǒng)正常的生理功。由于其合成代謝的作用而用于畜牧生產(chǎn)中以期促進(jìn)增長(zhǎng)，而低濃度的雌激素可以引起人類性發(fā)育的異常，減少人類精子的數(shù)量。在歐盟一些國(guó)家，雌激素已經(jīng)禁止用于畜牧業(yè)。因此，迫切需要建立一種快速便捷的檢測(cè)方法來檢測(cè)環(huán)境中存在的雌激素的含量。目前檢測(cè)17 β-雌二醇的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法等，但這些方法具有檢測(cè)成本高，樣品處理復(fù)雜且時(shí)間較長(zhǎng)，儀器操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本文研究了一種快速便捷，靈敏度和精確度都較高的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)食品中的17 β-雌二醇，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。在玻碳電極的表面修飾一層可以增加電化學(xué)信號(hào)的納米復(fù)合物，然后將17 β -雌二醇完全抗原通過和修飾在電極表面的金之間的靜電引力吸附在電極表面。我們制備17 β-雌二醇抗體和辣根過氧化物酶的標(biāo)記層，將其和游離的17 β -雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)滴加在電極表面，這樣電極表面修飾的完全抗原和游離的標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記的抗體。清洗電極以后，結(jié)合在電極表面標(biāo)記層上的辣根過氧化物酶催化底物過氧化氫產(chǎn)生電信號(hào)。利用電信號(hào)的變化就可以達(dá)到待測(cè)物檢測(cè)的目的。
[0004]本文
【發(fā)明內(nèi)容】
之一是提供了一種新型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。
[0005]本文
【發(fā)明內(nèi)容】
之二是將制備的免疫傳感器用于檢測(cè)食品中的17 β -雌二醇。
[0006]本文發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟:
1、檢測(cè)17 β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備步驟如下:
(I)石墨烯-聚苯胺的制備:
25 mg的GO溶于50 ml I mo I/L H2SO4中，超聲I h，形成分散均勻的溶液。加入200μ L的苯胺單體再超聲30 min。加入0.06 g的(NH4) 2S408，20 °C超聲2 h。得到的復(fù)合物通過過濾收集，60 0C干燥。
[0007](2)抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記層的制備:
2 ml 1%的H2PtCl6.6H20加入到8 ml水中，80°C攪拌狀態(tài)下加入1%的硼氫化鈉溶液，攪拌4 h，得到PtNPs。5.0 mg的多巴胺加入到5.0 ml PtNPs溶液中，用Tris - HCl將pH調(diào)節(jié)至8.5，室溫下攪拌5 h。離心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs。在將其加入到含有20 mg檸檬酸鈉的HAuCl4溶液中，室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)。離心清洗得到PDA-PtNPs-AuNPs納米材料，溶于5 ml水中備用。100 μ L，lmg/mL的辣根過氧化物酶(HRP)和100 μ L, 5 μ g/mL的雌二醇抗體(Ab)加入到2 ml的上述材料中,4°C下攪拌一夜。用PBS緩沖溶液清洗三次，得到納米復(fù)合物標(biāo)記層PDA-PtNPs-AuNP-HRP-Ab.(3)檢測(cè)17 β -雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備步驟如下: 5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；將修飾的電極浸在含有I mM HAuCl4 and I mM H2PtClJ^0.2 M的似404溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是300 S。這樣在GO-PANI表面修飾了一成Au-PtNPs的納米合金。滴加10 μ 1,10 μ g/mL的17 β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面，室溫下干燥5 h。用10 μ I BSA (1%)封閉殘余的活性位點(diǎn)。每一步修飾后用PBS緩沖溶液清洗電極。得到制備的免疫傳感器電極，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0008]2、如上所制備的一種檢測(cè)17β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)17β-雌二醇的步驟如下:
(I)滴加10 μ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品。
[0009](2)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是50 mV/s。根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0010](3)將待測(cè)樣品代替17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)。
[0011]本文所述的一種檢測(cè)17 β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備及應(yīng)用，所有試劑和抗體均在化學(xué)試劑公司購(gòu)買。
[0012]本發(fā)明體現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)是:
(I)本文發(fā)明的PDA-PtNPs-AuNPs納米材料是第一次合成，且GO-PANI復(fù)合物導(dǎo)電性能強(qiáng)，Au-PtNPs納米合金具有良好的生物相容性，對(duì)H2O2具有一定的催化性能。
[0013](2)本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度高，檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)周期短。
[0014](3)本發(fā)明的檢測(cè)17β-雌二醇的方法，操作簡(jiǎn)單，靈敏，便于實(shí)際樣品的快速檢測(cè)。
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些具體實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明。此外，還需要理解，在閱讀了本發(fā)明所講述的內(nèi)容以后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0016]實(shí)施例1
一種檢測(cè)17 β -雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，步驟如下:
(1)5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；
(2)將修飾的電極浸在含有ImM HAuCl4 and I mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是300 S。
[0017](3)滴加10 μ 1,10 μ g/mL的17 β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面，室溫下干燥5 ho
[0018](4)用10 μ I BSA (1%)封閉的基本面殘余的活性位點(diǎn)。每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極，得到制備的免疫傳感器電極。
[0019](5)滴加10 μ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17 β _雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品。
[0020](6)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是50 mV/s。根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021]實(shí)施例2
(1)5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；
(2)將修飾的電極浸在含有ImM HAuCl4 and I mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是200 s；
(3)滴加10μ 1,10 μ g/mL的17 β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面,室溫下干燥5 h ;
(4)用10μ I BSA (1%)封閉的基本面殘余的活性位點(diǎn)。每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極，得到制備的免疫傳感器電極；
(5)滴加10μ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品；
(6)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是50 mV/s。根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022]實(shí)施例3
(1)5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；
(2)將修飾的電極浸在含有ImM HAuCl4 and I mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是200 s；
(3)滴加10μ 1,10 μ g/mL的17 β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面,室溫下干燥5 h ;
(4)用10μ I BSA (1%)封閉的基本面殘余的活性位點(diǎn)。每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極，得到制備的免疫傳感器電極；
(5)滴加10μ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品；
(6)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有6 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是50 mV/s。根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023]實(shí)施例4
(I)5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；、
(2)將修飾的電極浸在含有ImM HAuCl4 and I mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是200 s；
(3)滴加10μ 1,10 μ g/mL的17 β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面,室溫下干燥5 h ;
(4)用10μ I BSA (1%)封閉的基本面殘余的活性位點(diǎn)。每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極，得到制備的免疫傳感器電極；
(5)滴加10μ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品；
(6)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是50 mV/s。根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0024](7) 將待測(cè)樣品代替17β_雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)；
(8)用構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)牛奶樣品1，平均檢測(cè)6次，為檢測(cè)出含有17 β -雌二醇，屬于合格樣品；加標(biāo)回收試驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.7%。
[0025]實(shí)施例5
(1)5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；
(2)將修飾的電極浸在含有ImM HAuCl4 and I mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是200 s；
(3)滴加10μ 1,10 μ g/mL的17β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面,室溫下干燥5 h ;
(4)用10μ I BSA (1%)封閉的基本面殘余的活性位點(diǎn)。每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極，得到制備的免疫傳感器電極；
(5)滴加10μ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品；
(6)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是50 mV/s。根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026](7)將待測(cè)樣品代替17β_雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)。
[0027](8)用構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)牛奶樣品2，平均檢測(cè)6次，為檢測(cè)出含有17 β -雌二醇，屬于合格樣品；加標(biāo)回收試驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是3.7%。
【權(quán)利要求】
1.本文發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟: .1、檢測(cè)17β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備步驟如下: (1)石墨烯-聚苯胺的制備:
25 mg的GO溶于50 ml I mo I/L H2SO4中，超聲I h，形成分散均勻的溶液；加入200μ L的苯胺單體再超聲30 min ;加入0.06 g的(MM)2S4O8, 20 °C超聲2 h ;得到的復(fù)合物通過過濾收集，60°C干燥； (2)抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記層的制備: .2 ml 1%的H2PtCl6.6H20加入到8 ml水中，80°C攪拌狀態(tài)下加入1%的硼氫化鈉溶液，攪拌4 h，得到PtNPs ;5.0 mg的多巴胺加入到5.0 ml PtNPs溶液中，用Tris - HCl將PH調(diào)節(jié)至8.5，室溫下攪拌5 h ;離心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs ;在將其加入到含有20 mg檸檬酸鈉的HAuCl4溶液中，室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)；離心清洗得到PDA-PtNPs-AuNPs納米材料,溶于5 ml水中備用；100 μ L, lmg/mL的辣根過氧化物酶(HRP)和100 uL, 5 yg/mL的雌二醇抗體(Ab)加入到2 ml的上述材料中，4°C下攪拌一夜；用PBS緩沖溶液清洗三次，得到納米復(fù)合物標(biāo)記層PDA-PtNPs-AuNP-HRP-Ab ； (3)檢測(cè)17β -雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器的制備步驟如下: .5 mg GO-PANI超聲Ih溶于5 mL DMF中，滴加20 μ L的GO-PANI溶液在玻碳電極表面，室溫下晾干；將修飾的電極浸在含有I mM HAuCl4 and I mM H2PtClJ^0.2 M的似404溶液中，通過恒電位方法進(jìn)行掃描還原，掃描電位為-0.2 V，掃描時(shí)間是300 s ;這樣在GO-PANI表面修飾了一成Au-PtNPs的納米合金；滴加10 μ 1,10 μ g/mL的17 β -雌二醇完全抗原在修飾好的電極表面，室溫下干燥5 h;用10 μ I BSA (1%)封閉的基本面殘余的活性位點(diǎn)；每一步修飾后用PBS緩沖溶液曲線電極；得到制備的免疫傳感器電極，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)17β-雌二醇的電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè).17 β-雌二醇的步驟如下: (1)滴加?ομ I抗體標(biāo)記層和10 μ I游離的17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品在制備的電極表面，室溫下培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液沖洗未結(jié)合的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品； (2)以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬絲電極為對(duì)比電極，制備的電極為工作電極，在含有8 mmol/L H2O2的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)法掃描，掃描電壓是-0.4 V至0.6 V，掃描速率是.50 mV/s ;根據(jù)添加H2O2前后的的信號(hào)變化和17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)將待測(cè)樣品代替17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N27/30GK103675062SQ201310696497
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】黃加棟, 李 杰, 劉素 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)