一種酶標抗體試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種酶標抗體試劑，包括組分1、組分2和組分3，組分1中含有pH為6.0的醋酸鹽緩沖液，過碘酸鈉，過氧化脲，三乙醇胺；組分2中含有無水碳酸鈉，碳酸氫鈉；組分3中含有硼氫化鈉，甘氨酸，甘油。本發(fā)明提供的酶標記抗體試劑，直接對游離的抗體和HRP進行淬滅，不需要對酶結(jié)合物進行透析和純化，直接可以應(yīng)用到試劑盒中，不影響本底和檢測結(jié)果；將常規(guī)標記流程中的過夜（18小時）降低到了2小時完成，大大節(jié)省了反應(yīng)時間；將試劑放置到2～8℃和37℃環(huán)境中，試劑能穩(wěn)定長期保存，穩(wěn)定性良好，可以長久應(yīng)用。
【專利說明】一種酶標抗體試劑
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種酶標抗體試劑。
[0002]【背景技術(shù)】
1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linkedimmunosorbent assay, elisA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方法的基本原理是:①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與辣根過氧化物酶(HRP)連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入辣根過氧化物酶(HRP)反應(yīng)的底物液后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
[0003]酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標記物中最常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。
[0004]酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。
[0005]戊二醛二步法的原理:戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。簡易過碘酸鈉法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和Ig結(jié)合，99%的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。
[0006]無論是戊二醛二步法還是簡易過碘酸鈉法，都需要對酶結(jié)合物進行純化，去除游離的抗體和辣根過氧化物酶，操作步驟復(fù)雜繁瑣，而且純化的過程中易造成酶結(jié)合物的流失，增大成本，增加制備時間。同時梅標抗體所用的試劑都需要現(xiàn)配現(xiàn)用，不能長時間放置，這些都限制了酶聯(lián)免疫法中酶標記物的制備。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】

針對于上述常規(guī)酶標抗體存在的問題，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定高效的酶標抗體試劑，保證試劑能在2?8°C條件下穩(wěn)定放置I年，而且酶結(jié)合抗體后，不需要經(jīng)過蛋白鹽析、透析的過程，操作簡單，整個酶標過程只需要2個小時就可以完成，節(jié)省了大量的制備時間。
[0008]本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的: 一種酶標抗體試劑，包括組分1、組分2和組分3，各組分原料含量如下:
組分I中含有pH為6.0的醋酸鹽緩沖液l-10mmol/L，過碘酸鈉0.05-0.5mol/L,過氧化脲 0.5-lg/L，三乙醇胺 0.1-lmL/L ；
組分2中含有無水碳酸鈉63.6 g/L，碳酸氫鈉33.6g/L ；
組分3中含有硼氫化鈉4g/L，甘氨酸2 g/L，甘油lmL/L。
[0009]所述的酶標抗體試劑，各組分原料含量如下:
組分I中含有pH為6.0的醋酸鹽緩沖液5mmol/L，過碘酸鈉0.lmol/L,過氧化脲0.5g/L，三乙醇胺lmL/L ；
組分2中含有無水碳酸鈉63.6 g/L，碳酸氫鈉33.6g/L ；
組分3中含有硼氫化鈉4g/L，甘氨酸2 g/L，甘油lmL/L。
[0010]所述的酶標抗體試劑，稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于ImL組分I中，37°C恒溫孵育60分鐘，加入200 u L組分2，同時加入IOmg需要標記的抗體，37°C恒溫孵育30分鐘，再加入IOOii L組分3，37°C恒溫孵育30分鐘，得到酶標記抗體。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供的酶標記抗體試劑，直接對游離的抗體和HRP進行淬滅，不需要對酶結(jié)合物進行透析和純化，直接可以應(yīng)用到試劑盒中，不影響本底和檢測結(jié)果；將常規(guī)標記流程中的過夜(18小時)降低到了 2小時完成，大大節(jié)省了反應(yīng)時間；將試劑放置到2?8°C和37°C環(huán)境中，試劑能穩(wěn)定長期保存，穩(wěn)定性良好，可以長久應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1實施例3試劑放置在2?8°C條件下的穩(wěn)定性曲線，
圖2實施例3試劑放置在37°C條件下的穩(wěn)定性曲線。
【具體實施方式】
[0013]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例來進一步說明。
[0014]實施例1:酶標抗體試劑組分及濃度為 組分I (Rl):
pH為6.0的醋酸鹽緩沖液lmmol/L
過碘酸鈉0.05mol/L
過氧化脲0.5g/L
三乙醇胺0.lmL/L
溶于蒸懼水中制備完成；
組分2 (R2):
無水碳酸鈉63.6 g/L
碳酸氫鈉33.6g/L
溶于蒸懼水中制備完成；
組分3 (R3):
硼氫化鈉4g/L
甘氨酸2 g/L 甘油lmL/L
將甘油溶于蒸餾水中，然后加入甘氨酸和硼氫化鈉進行溶解。
[0015]酶標抗體試劑的應(yīng)用流程為:稱取5mgHRP溶解于ImL Rl組分中，37 °C恒溫孵育60分鐘，加入200 u L R2組分，同時加入IOmg需要標記的抗體，37°C恒溫孵育30分鐘，再加入IOOu L R3組分，37°C恒溫孵育30分鐘。此時酶標記抗體的工作已經(jīng)完成，將酶結(jié)合物加入到IL的0.1M PH7.4 PBS緩沖液中，即得抗HCV單抗-HRP酶結(jié)合物。
[0016]實施例2:酶標抗體試劑組分及濃度為 組分I (Rl):
pH為6.0的醋酸鹽緩沖液5mmol/L
過碘酸鈉0.lmol/L
過氧化脲0.5g/L
三乙醇胺lmL/L
溶于蒸懼水中制備完成；
組分2 (R2):
無水碳酸鈉63.6 g/L
碳酸氫鈉33.6g/L
溶于蒸懼水中制備完成；
組分3 (R3):
硼氫化鈉4g/L
甘氨酸2 g/L
甘油lmL/L
將甘油溶于蒸餾水中，然后加入甘氨酸和硼氫化鈉進行溶解。
[0017]使用方法同實施例1。
[0018]實施例3:酶標抗體試劑組分及濃度為 組分I (Rl):
pH為6.0的醋酸鹽緩沖液10mmol/L
過碘酸鈉0.5mol/L
過氧化脲I g/L
三乙醇胺lmL/L
溶于蒸懼水中制備完成；
組分2 (R2):
無水碳酸鈉63.6 g/L
碳酸氫鈉33.6g/L
溶于蒸懼水中制備完成；
組分3 (R3):
硼氫化鈉4g/L
甘氨酸2 g/L
甘油lmL/L
將甘油溶于蒸餾水中，然后加入甘氨酸和硼氫化鈉進行溶解。[0019]使用方法同實施例1。
[0020]酶標抗體活性驗證:
利用丙型肝炎核心抗原檢測試劑盒(雙抗夾心ELISA)對制備的酶結(jié)合物進行檢測驗證。具體操作步驟為:(I)設(shè)定好加樣孔，將50 ii L系列HCV定標品加在HCV試劑盒的包被板上，平行加入兩組，再分別加入50 y L試劑盒自帶抗HCV單抗-HRP酶結(jié)合物，以及用實施例1、實施例2、實施例3試劑制備的抗HCV單抗-HRP酶結(jié)合物，37°C反應(yīng)I小時后，洗板5次，拍干；(2)每孔加入顯色液A液和B液各50uL，避光37°C顯色15min。(3)每孔加入終止液各50uL，用酶標儀在波長450nm/630nm處讀取吸光度(OD)值。使用丙肝核心抗原試劑盒作為對比。檢測結(jié)果如表1所示:
表1檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種酶標抗體試劑，其特征在于包括組分1、組分2和組分3，各組分原料含量如下: 組分I中含有pH為6.0的醋酸鹽緩沖液l-10mmol/L，過碘酸鈉0.05-0.5mol/L,過氧化脲 0.5-lg/L，三乙醇胺 0.1-lmL/L ； 組分2中含有無水碳酸鈉63.6 g/L，碳酸氫鈉33.6g/L ； 組分3中含有硼氫化鈉4g/L，甘氨酸2 g/L，甘油lmL/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶標抗體試劑，其特征在于各組分原料含量如下: 組分I中含有pH為6.0的醋酸鹽緩沖液5mmol/L，過碘酸鈉0.lmol/L,過氧化脲0.5g/L，三乙醇胺lmL/L ； 組分2中含有無水碳酸鈉63.6 g/L，碳酸氫鈉33.6g/L ； 組分3中含有硼氫化鈉4g/L，甘氨酸2 g/L，甘油lmL/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶標抗體試劑，其特征在于稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于ImL組分I中，37°C恒溫孵育60分鐘，加入200 u L組分2，同時加入IOmg需要標記的抗體，37°C恒溫孵育30分鐘，再加入IOOii L組分3，37°C恒溫孵育30分鐘，得到酶標記抗體。
【文檔編號】G01N33/543GK103616506SQ201310670322
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】譚柏清, 王進, 甘宜梧 申請人:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司