專利名稱：一種檢測脂蛋白殘粒膽固醇濃度的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種血清或血漿中的脂蛋白殘粒膽固醇(RLP-C)，具體來說是一種檢測脂蛋白殘粒膽固醇濃度的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
:脂蛋白殘粒(remnantlipoprotein, RLP)又稱富含甘油三酯(triglyceride,TG),脂蛋白殘粒(TRL)是乳糜微粒(chylomicron, CM)和極低密度脂蛋白(very lowdensitylipoprotein, VLDL)經(jīng)脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)水解逐漸失去甘油三酯、磷脂、脂蛋白A (apoprotein A, apoA)和apoC后,轉(zhuǎn)變成的富含膽固醇、膽固醇脂和apoE的較小顆粒。近年來，隨著對脂蛋白殘粒的深入了解，RLP測定的臨床意義日趨受重視。大量研究表明，濃度在動脈粥樣硬化性疾病及動脈粥樣相關(guān)的疾病(如II型糖尿病、III型高脂血癥和慢性腎功能衰竭及肥胖患者)中顯著增加。另外，從人動脈粥樣斑塊中分離的脂蛋白在結(jié)構(gòu)上與富含TG脂蛋白殘粒相似。因此，血清或血漿脂蛋白殘粒膽固醇(RLP-C)水平升高是動脈粥樣硬化性疾病和冠心病(coronary heart、disease, CHD)以及與動脈粥樣硬化性有關(guān)的代謝性疾病的重要危險因素。所以，準(zhǔn)確、快速測定RLP非常重要。然而，現(xiàn)有技術(shù)中測定RLP的傳統(tǒng)方法多用超速離心法和凝膠電泳法。脂蛋白殘粒是一組在大小、密度、電泳遷移率、化學(xué)組成及受體識別等方面呈高度異質(zhì)性的顆粒，現(xiàn)有的分離方法主要是根據(jù)其不同的物理和化學(xué)特征來測定脂蛋白殘粒。超速離心是脂蛋白分離的參考方法，先前常用LDL (1.006<d>ll.009kg/L或Svl2 20)反映殘粒狀態(tài)，后來有學(xué)者提出Svl2 60的脂蛋白反映顆粒狀態(tài)比Svl2 20的脂蛋白好。但是在此范圍的脂蛋白包括LDL (1.006〈d>ll.009kg/L或Svl2 20)和介于d〈l.006kg/L組分中的小VLDL顆粒，因此，此法并不 能作為分離脂蛋白殘粒的參考方法；而聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)法根據(jù)分子大小來分離脂蛋白，用LDL來反映脂蛋白殘粒狀態(tài)，包括大小在VLDL和LDL的任何脂蛋白殘粒。但是，此兩種方法因需特殊儀器，費(fèi)時或操作繁瑣，均難于在普通實驗室展開。由Naka jima et al創(chuàng)建了一種基于脂蛋白殘粒表面的載脂蛋白組成而建立的免疫分離法。使用免疫親和膠混合了抗人apoB-100單抗(J1-H)，單抗識別正常血脂水平與高TG血癥樣本中絕大多數(shù)apo B-100-VLDL以及幾乎所有的IDL和LDL，但不識別富含apoE的一小部分VLDL ；電鏡下，非結(jié)合部分的脂蛋白主要是直徑在30-80um的VLDL ；HPLC分析，同樣支持其VLDL的主要成分；免疫親和膠含有的抗人apo Al單抗用以去除幾乎所有的HDL顆粒，SDS-PAGE顯示非結(jié)合部分包含了 apoB-100，B-48，E，C，但沒有apo Al的脂蛋白；在瓊脂糖電泳中，非結(jié)合脂蛋白(d〈1.006kg/L)顯示β或慢pre-β泳動帶，而結(jié)合脂蛋白(d〈l.006kg/L)與正常VLDL則顯示快pre-β泳動帶,此非結(jié)合脂蛋白富含apo E,包含了幾乎所有apo B-48與部分apo B-100的TRL。因此，其組成為CM與VLDL殘粒，被稱為殘粒樣微粒(remnant-like particles, RLP)0
在Naka jima et al 創(chuàng)建的方法，由日本 Immunoresearch Laboratories 生產(chǎn)測定RLP-C免疫分離試劑含有三種試劑:第一種試劑由免疫親和膠組成:含抗人ApoB-100 (J1-H)單克隆抗體，抗人ApoAI (H-12)單克隆抗體；第二種試劑:RLP-C洗滌液、Tris-HceBuffer Solution洗漆液。第三種試劑:膽固醇試劑。其操作方法:經(jīng)室溫平衡后的均勻的免疫親和膠，置IOml基底離心管，用RLP-C Buffer (pH7.4)洗滌三次，混勻后，將3mm直徑鋼珠加入微量樣品杯中，加入300ul洗滌后的免疫分離膠與5ul樣本，室溫條件下在水平振蕩器上振蕩120分鐘，靜置30分鐘后，取上清液備用。第二步，取靜置30min后的上清液20ul備用。第三步，用生化分析儀檢測樣品量20ul第一試劑160ul，5min后加試劑II 53ul，5min讀點，計算其膽固醇濃度。此檢測方法價格昂貴，檢測每份血清需數(shù)百元，而且，分離過程需4-6小時，免疫親和膠需要洗滌三次，費(fèi)人力，操作繁瑣，難于在實驗室開展。因此，需要一種簡單、廉價、快速的檢測血清或血漿中脂蛋白殘粒膽固醇的方法。從上世紀(jì)日本Immunoresearch Laboratories提供RLP-C免疫分離膠上市,但是在方法學(xué)上操作繁瑣、費(fèi)時、費(fèi)力、價格昂貴，僅限于實驗研究用，而且不供應(yīng)中國大陸使用。10多年來，國內(nèi)僅有2篇科研實驗文章發(fā)表，檢測試劑也是通過其他途徑進(jìn)入國內(nèi)實驗室的
發(fā)明內(nèi)容
:針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測脂蛋白殘粒膽固醇濃度的試劑盒及方法。本發(fā)明提供了一種檢測試劑盒，包括兩種試劑，第一種試劑Rl由β -環(huán)糊精、抗人ΑροΒΙΟΟ單克隆抗體、抗人ApoAI單克隆抗體、抗環(huán)血酸氧化酶、膽固醇酯酶、Tris緩沖液組成，所述的Tris緩沖液的PH值 為7.1-7.5 ;第二種試劑R2由Tris緩沖液、過氧化物酶、膽固醇氧化酶和4-氨基安替比林組成，所述的Tris緩沖液的PH值為7.1-7.5。進(jìn)一步的,所述的抗人ΑροΒΙΟΟ單克隆抗體也可選擇兔或羊抗人ΑροΒΙΟΟ多克隆抗體。進(jìn)一步的,所述的ApoAI單克隆抗體也可選擇兔或羊抗人ApoAI多克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種采用上述的試劑盒檢測脂蛋白殘粒膽固醇濃度的方法，包括一個將樣本采用生化分析儀測定的步驟，在所述的一個將樣本采用生化分析儀測定的步驟中，將樣品加入第一種試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測第I點樣本Al，加入第二種試劑R2，37°C孵育5min，讀測第2點樣本A2，樣本A=樣本A2-樣本Al，還包括一個將校準(zhǔn)品采用生化分析儀測定的步驟，在所述的一個將校準(zhǔn)采用生化分析儀測定的步驟中，將校準(zhǔn)加入第一種試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測第I點校準(zhǔn)Al，加入第二種試劑R2，37°C孵育5min，讀測第2點校準(zhǔn)A2，校準(zhǔn)A=校準(zhǔn)A2-校準(zhǔn)Al ；
權(quán)利要求
1.一種檢測試劑盒，包括兩種試劑，其特征在于:第一種試劑Rl由β-環(huán)糊精、抗人ΑροΒΙΟΟ單克隆抗體、抗人ApoAI單克隆抗體、抗環(huán)血酸氧化酶、膽固醇酯酶、Tris緩沖液組成，所述的Tris緩沖液的PH值為7.1-7.5 ;第二種試劑R2由Tris緩沖液、過氧化物酶、膽固醇氧化酶和4-氨基安替比林組成，所述的Tris緩沖液的PH值為7.1-7.5。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測試劑盒，其特征在于:所述的抗人ΑροΒΙΟΟ單克隆抗體也可選擇兔或羊抗人ΑροΒΙΟΟ多克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測試劑盒，其特征在于:所述的ApoAI單克隆抗體也可選擇兔或羊抗人ApoAI多克隆抗體。
4.一種采用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測脂蛋白殘粒膽固醇濃度的方法，其特征在于包括一個將樣本采用生化分析儀測定的步驟，在所述的一個將樣本采用生化分析儀測定的步驟中，將樣品加入第一種試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測第I點樣本Al，加入第二種試劑R2,37°C孵育5min，讀測第2點樣本A2，樣本A=樣本A2-樣本Al，還包括一個將校準(zhǔn)品采用生化分析儀測定的步驟，在所述的一個將校準(zhǔn)品采用生化分析儀測定的步驟中，將校準(zhǔn)品加入第一種試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測第I點校準(zhǔn)品Al，加入第二種試劑R2，37°C孵育5min,讀測第2點校準(zhǔn)品A2，校準(zhǔn)A=校準(zhǔn)品A2-校準(zhǔn)品Al ；
全文摘要
本發(fā)明一種檢測試劑盒，包括兩種試劑，第一種試劑R1由β-環(huán)糊精、抗人ApoB100單克隆抗體、抗人ApoAI單克隆抗體、抗環(huán)血酸氧化酶、膽固醇酯酶、Tris緩沖液組成；第二種試劑R2由Tris緩沖液、過氧化物酶、膽固醇氧化酶和4-氨基安替比林組成。本發(fā)明還提供了一種檢測脂蛋白殘粒膽固醇濃度的方法，將樣品加入第一種試劑R1后，37℃孵育5min，通過生化分析儀讀測第1點樣本A1，然后加入第二種試劑R2，37℃孵育5min，讀測第2點樣本A2，通過公式計算脂蛋白殘粒膽固醇的濃度，本發(fā)明的測定方法簡便、快速。
文檔編號G01N33/50GK103235114SQ201310170390
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者朱曉敏, 朱慧琳, 王泉龍, 楊杰, 劉穎成, 劉穎冰 申請人:上海北加生化試劑有限公司