專利名稱：一種檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙，具體涉及一種檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙。
背景技術(shù)：
免疫層析試紙是一種利用層析原理將待檢測(cè)液中的目標(biāo)檢測(cè)分子或成分等在試紙條上流動(dòng)至檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，當(dāng)檢測(cè)線發(fā)生顏色變化則說明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性，當(dāng)質(zhì)控線發(fā)生顏色變化時(shí)，則說明檢測(cè)結(jié)果有效，否則無效。免疫層析試紙?jiān)跈z測(cè)或診斷某些疾病時(shí)具有非常便利的優(yōu)點(diǎn)，因此其已被充分運(yùn)用到多種疾病或癥狀的檢測(cè)或診斷過程中，例如早孕試紙。一般情況下，免疫層析試紙包含有以下幾種結(jié)構(gòu):樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊、膠板，所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜和吸水墊依次粘貼在膠板上；所述層析膜上依次設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線；其工作原理為:將待測(cè)液滴加至樣品墊上，待測(cè)液利用層析原理流向膠體金結(jié)合墊，待測(cè)液溶解膠體金結(jié)合墊中的膠體金結(jié)合物，并與其共同依次流向?qū)游瞿ど系臋z測(cè)線和質(zhì)控線；當(dāng)待測(cè)液中含有目標(biāo)檢測(cè)分子，則目標(biāo)檢測(cè)分子、膠體金結(jié)合物會(huì)與檢測(cè)線內(nèi)包含的抗體成分結(jié)合從而形成免疫復(fù)合物，同時(shí)檢測(cè)線顏色發(fā)生變化；當(dāng)待測(cè)液流至質(zhì)控線時(shí)，質(zhì)控線內(nèi)包含的抗體成分會(huì)與膠體金結(jié)合物結(jié)合，從而質(zhì)控線顏色發(fā)生變化。胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane,簡(jiǎn)稱ROM)在孕期可能隨時(shí)發(fā)生,在臨產(chǎn)前發(fā)生的胎膜破裂稱為胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周后)PR0M的發(fā)生率約為10%，足月前(37孕周前)PROM的發(fā)生率為2-3.5%。胎膜早破是引起產(chǎn)科病人產(chǎn)前、產(chǎn)后并發(fā)癥的主要因素，也是導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)和新生兒必須入住重癥監(jiān)護(hù)室的主要原因。由于醫(yī)務(wù)人員不得不在延長(zhǎng)孕周與宮內(nèi)及孕婦感染的風(fēng)險(xiǎn)和胎兒肺發(fā)育問題之間求平衡，因而對(duì)胎膜早破患者的管理成本高、難度大，準(zhǔn)確及時(shí)診斷孕婦是否發(fā)生胎膜早破至關(guān)重要?，F(xiàn)有檢測(cè)胎膜·早破的方法中除以往的臨床詢問病史等方法外，主要以妊娠婦女陰道分泌物中的可溶性細(xì)胞間粘附分子-1 (簡(jiǎn)稱SlCAM-1)為檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)工具為較新的方法。其中以sICAM-1為檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)胎膜早破免疫層析試紙對(duì)于產(chǎn)科病人及時(shí)診斷是否發(fā)生胎膜早破起到了較好的效果；所述免疫層析試紙的檢測(cè)線內(nèi)包被有羊抗人sICAM-1多克隆抗體工作液，質(zhì)控線內(nèi)包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體工作液，膠體金結(jié)合物中含有鼠抗人sICAM-1單克隆抗體?，F(xiàn)有臨床對(duì)胎膜早破的診斷過程中，部分胎膜破口大、陰道羊水流量大的產(chǎn)科病人能夠得到及時(shí)的診斷，而對(duì)于部分胎膜破口小、破口位置高、陰道羊水流量小的產(chǎn)科病人而言，目前臨床診斷仍然存在一定的困難，從而容易耽誤產(chǎn)科病人及時(shí)就診的時(shí)間；而現(xiàn)有僅以sICAM-1為檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙對(duì)于前述的胎膜破口小、破口位置高、陰道羊水流量小的產(chǎn)科病人而言，其檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和特異性往往受限，不夠理想，從而容易造成誤診，對(duì)產(chǎn)科病人來說同樣會(huì)造成不便。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，該免疫層析試紙?jiān)跈z測(cè)胎膜早破時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和特異性有較明顯的提高，分別可達(dá)到99%以上和96%以上，從而減少誤診的發(fā)生率。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是采用一種檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，該免疫層析試紙包括有樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊、膠板；所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次按順序與膠板連接；所述層析膜上依次設(shè)置有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)靠近膠體金結(jié)合墊一端，所述質(zhì)控區(qū)靠近吸水墊一端；所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)設(shè)置有檢測(cè)線，所述檢測(cè)線依次設(shè)置為主檢測(cè)線和副檢測(cè)線，所述主檢測(cè)線為由羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體包被形成；所述副檢測(cè)線為由一種或兩種不同的抗體分別包被形成一條或兩條副檢測(cè)線；所述副檢測(cè)線中包被的抗體為選自兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體以及兔抗人Axl多克隆抗體；所述質(zhì)控區(qū)內(nèi)設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線為由羊抗鼠IgG多克隆抗體包被形成；所述各抗體的工作液濃度為:羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體1-2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體0.2_2mg/mL、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體0.5-2.5mg/mL、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體0.5-2.5mg/mL、兔抗人Axl多克隆抗體0.5-2mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗體0.5-2mg/mL ；所述膠體金結(jié)合墊中包被有鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體。優(yōu)選的，所述副檢測(cè)線中包被的抗體為一種或兩種選自兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體。優(yōu)選的，所述副檢測(cè)線中包被的抗體分別為兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)線以及質(zhì)控線中各抗體的工作液濃度為羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體1.5-2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體l_2mg/mL、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體0.5-1.5mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗體0.5-1.5mg/mL。優(yōu)選的，所述檢測(cè)線以及質(zhì)控線中各抗體的工作液濃度為羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體1.5mg/mL、兔抗人胎盤ct -微球蛋白-1抗體lmg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗體1.5mg/mL。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其詳細(xì)說明如下:本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，該免疫層析試紙包括有樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊、膠板；所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次按順序與膠板連接；所述層析膜上依次設(shè)置有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)靠近膠體金結(jié)合墊一端，所述質(zhì)控區(qū)靠近吸水墊一端；所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)設(shè)置有檢測(cè)線，所述檢測(cè)線依次設(shè)置為主檢測(cè)線和副檢測(cè)線，所述主檢測(cè)線為由羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體包被形成；所述副檢測(cè)線為由一種或兩種不同的抗體分別包被形成一條或兩條副檢測(cè)線；所述副檢測(cè)線中包被的抗體為選自兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體以及兔抗人Axl多克隆抗體；所述質(zhì)控區(qū)內(nèi)設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線為由羊抗鼠IgG多克隆抗體包被形成；所述各抗體的工作液濃度為:羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體1-2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體0.2_2mg/mL、兔抗人胎盤α -微球蛋白-1抗體0.5-2.5mg/mL、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體0.5-2.5mg/mL、兔抗人Axl多克隆抗體0.5-2mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗體0.5-2mg/mL ；所述膠體金結(jié)合墊中包被有鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體。首先,細(xì)胞間粘附分子(intercellularadhesive moleculel,簡(jiǎn)稱 ICAM-1)是一種參與細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與外基質(zhì)之間相互作用的分子統(tǒng)稱，包括有存在于體液中的可溶性細(xì)胞間粘附分子(soluble intercellular adhesive moleculel,簡(jiǎn)稱 sICAM-1)和存在于細(xì)胞表面的膜型細(xì)胞間粘附分子(簡(jiǎn)稱膜型ICAM-1)。其中，sICAM-1不僅保留了膜型ICAM-1的生物學(xué)特性，其還是膜型ICAM-1在體液中的可溶形式。本發(fā)明人經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生胎膜早破的妊娠婦女受羊水中的單核細(xì)胞上sICAM-1的表達(dá)和中性粒細(xì)胞的影響，其陰道分泌物中的sICAM-1含量明顯升高，現(xiàn)已有將sICAM-1為目標(biāo)分子來檢測(cè)胎膜早破的檢測(cè)工具，如免疫層析試紙，但在實(shí)際應(yīng)用過程中，其檢測(cè)目標(biāo)分子單一，若發(fā)生胎膜早破時(shí)，出現(xiàn)胎膜破口小、破口高、陰道羊水流量小的情況時(shí)，則易造成靈敏性和特異性均較低，容易產(chǎn)生誤診。本發(fā)明所述靈敏性為患病人群中得出陽(yáng)性檢測(cè)的樣本占病人總數(shù)的百分比，特異性為健康人群中得 出陰性檢測(cè)的樣本占健康人總數(shù)的百分比。影響本發(fā)明免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果靈敏性和特異性的因素較多，包括有免疫層析試紙本身的差異，如檢測(cè)線工作液的選擇、檢測(cè)線工作液的濃度以及質(zhì)控線工作液的濃度等，另外，試紙本身的制作工藝也同樣會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和特異性有一定的影響。本發(fā)明人經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，sICAM-1是妊娠晚期出現(xiàn)在羊水中的主要蛋白質(zhì)之一，含量一般為14ng/mL左右；而發(fā)生胎膜早破時(shí),羊水中含量較多的sICAM-1則會(huì)出現(xiàn)在陰道分泌物中。另外，除了上述sICAM-1在發(fā)生胎膜早破的婦女陰道液樣本中含量較多夕卜，其他含量明顯增多的抗原還有胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1、胎盤α -微球蛋白-1、甲胎蛋白以及Axl。因此，本發(fā)明主要采用以妊娠婦女陰道分泌物中的多種抗原成分作為共同檢測(cè)目標(biāo)分子。本發(fā)明經(jīng)過蛋白芯片篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，確診的胎膜早破產(chǎn)婦與確診的非胎膜早破產(chǎn)婦相比(兩組產(chǎn)婦的年齡與妊娠周齡匹配，無基礎(chǔ)疾病，無妊娠合并癥)，其陰道分泌物樣本中sICAM-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1、胎盤α-微球蛋白-1、甲胎蛋白以及Axl的濃度具有明顯差異；其中，確診的胎膜早破產(chǎn)婦陰道分泌物樣本中sICAM-1的濃度90%以上均在2ng/mL以上，而確診的非胎膜早破產(chǎn)婦陰道分泌物樣本中sICAM-1的濃度90%以上均在Ing/mL以下；確診的胎膜早破產(chǎn)婦以及健康對(duì)照組的陰道分泌物樣本中的sICAM-1的平均濃度、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1的平均濃度、以及Axl的平均濃度可參見下表(詳見實(shí)施例1);胎盤α -微球蛋白-1在檢測(cè)妊娠婦女胎膜早破的應(yīng)用等數(shù)據(jù)可參考文獻(xiàn):郭廣玲，劉永珍，等.檢測(cè)陰道液中胎盤α微球蛋白-1診斷胎膜早破的價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志，2010，33 (15);甲胎蛋白的平均濃度可參見文獻(xiàn):易媛媛，其木格，等.檢測(cè)陰道液HCG及AFP水平診斷胎膜早破的臨床價(jià)值[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2008，40 (7):794-797.本發(fā)明中不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，該免疫層析試紙包括有樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊、膠板；所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次按順序與膠板連接；其特征在于:所述層析膜上依次設(shè)置有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)靠近膠體金結(jié)合墊一端，所述質(zhì)控區(qū)靠近吸水墊一端；所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)設(shè)置有檢測(cè)線，所述檢測(cè)線依次設(shè)置為主檢測(cè)線和副檢測(cè)線，所述主檢測(cè)線為由羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體包被形成；所述副檢測(cè)線為由一種或兩種不同的抗體分別包被形成一條或兩條副檢測(cè)線；所述副檢測(cè)線中包被的抗體為選自兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體以及兔抗人Axl多克隆抗體；所述質(zhì)控區(qū)內(nèi)設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線為由羊抗鼠IgG多克隆抗體包被形成； 所述各抗體的工作液濃度為:羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體1-2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體0.2-2mg/mL、兔抗人胎盤a-微球蛋白-1抗體0.5-2.5mg/mL、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體0.5-2.5mg/mL、兔抗人Axl多克隆抗體0.5-2mg/mL、羊抗鼠 IgG 多克隆抗體 0.5-2mg/mL ； 所述膠體金結(jié)合墊中包被有鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，其特征在于:所述副檢測(cè)線中包被的抗體為一種或兩種選自兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a-微球蛋白-1抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，其特征在于:所述副檢測(cè)線中包被的抗體分別為兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤a-微球蛋白-1抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，其特征在于:所述檢測(cè)線以及質(zhì)控線中各抗體的工作液濃度為羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體1.5-2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體l_2mg/mL、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體0.5-1.5mg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗體0.5-1.5mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙，其特征在于:所述檢測(cè)線以及質(zhì)控線中各抗體的工作液濃度為羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體2.5mg/mL、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體1.5mg/mL、兔抗人胎盤a -微球蛋白-1抗體lmg/mL、羊抗鼠IgG多克隆抗體1.5mg/mL。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于包括有以下各步驟: A、將各抗體檢測(cè)線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，所得硝酸纖維素膜在36-38°C下干燥8-12小時(shí)得層析膜； B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊； C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測(cè)胎膜早破免疫層析試紙。
全文摘要
本發(fā)明公開一種免疫層析試紙，具體涉及一種檢測(cè)胎膜早破的免疫層析試紙。所述免疫層析試紙上設(shè)置有多條檢測(cè)線，每條檢測(cè)線由不同的抗體包被形成，所述抗體選自羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體、兔抗人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1抗體、兔抗人胎盤α-微球蛋白-1抗體、兔抗人甲胎蛋白多克隆抗體以及兔抗人Axl多克隆抗體；質(zhì)控線為由羊抗鼠IgG多克隆抗體包被形成；本發(fā)明免疫層析試紙?jiān)跈z測(cè)胎膜早破時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和特異性有較明顯的提高，分別可達(dá)到99%以上和96%以上，從而減少誤診的發(fā)生率。
文檔編號(hào)G01N33/531GK103235134SQ20131016695
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者關(guān)祥乾, 胡懷忠 申請(qǐng)人:成都創(chuàng)宜生物科技有限公司