專利名稱：一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種檢測農(nóng)藥克百威殘留的免疫傳感器制備方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，農(nóng)藥殘留引起的中毒事件屢屢發(fā)生，果蔬中的有害、劇毒農(nóng)藥的殘留問題一直是人們關(guān)注的焦點，也是現(xiàn)今中國加入WTO后，農(nóng)產(chǎn)品出口遭遇“綠色壁壘”的主要影響因素之一。克百威是氨基甲酸酯類殺蟲劑主要品種之一，它作為一種光譜殺蟲劑被廣泛應(yīng)用于當今農(nóng)業(yè)中。該藥劑具有內(nèi)吸性，能通過根、莖、葉或種子吸收傳導(dǎo)，并輸送到植物體的各器官，也能通過徑流滲透污染地下水。研究發(fā)現(xiàn)克百威的代謝物可引起細胞強烈的DNA單鏈斷裂，具有明顯的細胞毒性。雖然近年來國際上在蔬菜上已禁用該農(nóng)藥，但由于其對某些作物具有生長刺激作用，所以仍有不少違章使用現(xiàn)象。具有這樣高毒性的農(nóng)藥殘留超標的果蔬流入市場，必將會對人們健康造成嚴重危害，因此建立一種快速、靈敏、安全可靠的農(nóng)藥殘留檢測分析方法迫在眉睫。傳統(tǒng)的用于檢測克百威殘留的分析方法有氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯(lián)免疫(ELISA)等，這些傳統(tǒng)的方法雖然具有高選擇性和靈敏度，但其受到樣品前處理耗時、儀器設(shè)備昂貴、操作人員技術(shù)要求高、檢測時間長等諸多因素的限制，只能局限于實驗室操作，不能滿足果蔬現(xiàn)場速測的要求。免疫傳感器是根據(jù)抗原和抗體特異性結(jié)合所引發(fā)的免疫反應(yīng)的原理研制成的傳感器，與傳統(tǒng)的分析方法相比，它具有特異性強、分析速度快、結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉等優(yōu)點。而免疫傳感器的制備過程中，增大電流的響應(yīng)、抗原/抗體的固定化并保持其良好的生物活性以及空間排布是制約傳感器制備的關(guān)鍵步驟，這些將直接影響免疫傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、靈敏度和選擇性等主要性能。

發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷、操作簡單、靈敏度高，選擇性好的檢測農(nóng)藥克百威殘留的電流型免疫傳感器的制備方法。其技術(shù)方案為一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于電流型免疫傳感器的組裝過程為自組裝4’ 4-硫代聯(lián)苯硫酚(DMDPSE)、電沉積納米金(DpAu),重復(fù)第一步和第二步2遍,構(gòu)建穩(wěn)定的金硫體系,然后固定克百威單克隆抗體,最后用BSA封閉電流型免疫傳感器制備結(jié)束，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩Ｋ龅囊环N檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于實驗條件的優(yōu)化，主要包括電沉積納米金的層數(shù)、測試底液的PH以及孵育時間；所制備的電流型免疫傳感器的工作曲線為％ Λ I = 16.676 + 8.7332 IgC (ng/mL);免疫傳感器性能檢測包括特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、再生性以及免疫傳感器對蔬菜樣品回收率的測定。其制備原理為本發(fā)明采用4’ 4-硫代聯(lián)苯硫酚、電沉積納米金對金電極進行修飾，與傳統(tǒng)的方法相比，采用4’ 4-硫代聯(lián)苯硫酚兩端的巰基以及其剛性結(jié)構(gòu)，巰基一端通過金硫鍵連接裸金電極，巰基另一端通過金硫鍵連接電沉積的納米金，并通過層層自組裝的方法，構(gòu)建了一種具有聞穩(wěn)定性、聞度有序的金硫(Au-S)體系。由于納米金較聞的比表面積、穩(wěn)定性和導(dǎo)電性可以增大電極表面電子的轉(zhuǎn)移和生物相容性，進而增大免疫傳感器的響應(yīng)電流；與傳統(tǒng)的滴涂納米金膠的方法相比，電沉積的納米金在電極表面具有更好的穩(wěn)定性、均勻性，并且沉積過程簡單、省時、可控。電沉積的納米金為抗體在電極表面的固定提供了一個良好的生物界面，保持了抗體的生物活性以用來和農(nóng)藥有效的特異性結(jié)合。通過層層自組裝，擴大了電極的有效固定面積，提高了電極表面抗體的有效固定量。將經(jīng)過上述步驟修飾過的金電極制成免疫傳感器后，檢測農(nóng)藥克百威的精度更高、實現(xiàn)小型、便捷、適用于現(xiàn)場檢測的目的。采用本發(fā)明制成的電流型免疫傳感器可以在蔬果采收、上市前，進行農(nóng)藥克百威殘留的快速測定，直接對克百威農(nóng)藥殘留是否超標量進行檢測，避免因食含有殘留農(nóng)藥的蔬果而引起中毒，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費提供殘留檢測的技術(shù)支撐。為達到以上目的，采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于(1)配置一系列的克百威標準液，用以得出上述制備的電流型免疫傳感器的工作曲線、檢測范圍和檢測限；⑵配置一系列經(jīng)?；旌鲜褂玫霓r(nóng)藥溶液，以檢測所制備電流型免疫傳感器的選擇性；[31通過循環(huán)伏安掃描多段驗證上述免疫傳感器的穩(wěn)定性，通過解離抗原抗體免疫復(fù)合物和再次免疫檢測其再生性能;(4丨通過檢測實際蔬菜樣品得出免疫傳感器的加標回收率。本發(fā)明采用剛性雙巰基物質(zhì)4’ 4-硫代聯(lián)苯硫酚、電沉積納米金進行電極表面自組裝修飾，與傳統(tǒng)的自組裝納米金膠的方法相比增大了其穩(wěn)定性、固定量，形成的金硫體系具有較高的穩(wěn)定性和高度有序性，增大了傳感器的電流響應(yīng)并提高了傳感器表面抗體的有效固定，從而增大了檢測精度。所述電流型免疫傳感器的制備工藝如下⑴將預(yù)處理好的金電極浸入通氮除氧的2.0 mM 4’4_硫代聯(lián)苯硫酚的乙醇溶液中避光組裝24h，并用氮氣吹干。在5mL O. 3mM的含有O.1M氯化鉀的氯金酸溶液中，在-O. 2V的電壓下應(yīng)用恒電位法電沉積200s。電沉積結(jié)束后用PH=7. 5的PBS緩沖液沖洗，氮氣吹干。⑵重復(fù)步驟一和步驟二 η遍I I將上述制備好的電極浸于克百威單克隆抗體溶液中，4°C條件下浸泡12h，取出后沖去多余部分，晾干待用；四最后將上述制備好的電極最后`浸入2. 5%的BSA溶液中室溫下靜置lh，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點，取出置于室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4°C條件下備用。
具體實施例方式實施例⑴裸金電極的清洗所述裸金電極修飾前，首先用O. 3 μ m、50nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用去離子水洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次5min，重復(fù)二次，然后依次用6M的HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，氮氣吹干；[2]裸金電極的活化徹底洗滌后，電極在O. 5M H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法進行活化，掃描范圍-O. 3 1. 5V，反復(fù)掃描直至達到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。[3]將預(yù)處理好的金電極浸入通氮除氧的2. O mM 4’4-硫代聯(lián)苯硫酚的乙醇溶液中避光組裝24h (記作DMDPSE/Au)，取出電極，用無水乙醇沖洗電極表面以去除沒有吸附上的4’ 4-硫代聯(lián)苯硫酚，并用氮氣吹干。[4)在5mL O. 3mM的含有O.1M氯化鉀的氯金酸溶液中，在-O. 2V的電壓下應(yīng)用恒電位法電沉積200s(記作DpAu/DMDPSE/Au)，電沉積結(jié)束后用PH=7. 5的PBS緩沖液沖洗，氮氣吹干。丨5丨重復(fù)步驟一和步驟二 2遍(記作{DpAu/DMDPSE}2/Au),l6l將上述制備好的電極浸于克百威單克隆抗體溶液中，4°C條件下浸泡8h，取出后沖去多余部分，晾干待用；[7)最后將上述制備好的電極最后浸入1%的BSA溶液中室溫下靜置2h，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點，取出置于室溫下晾干，免疫傳感器制作完成(記作BSA/ant1-carbofuran/ { DpAu/DMDPSE }n/Au),保存在4°C條件下備用JGI從電沉積納米金修飾層數(shù)、pH和孵育時間三方面對所制備的免疫傳感器的實驗條件進行優(yōu)化，納米金的修飾層數(shù)為1-3，pH的范圍為5. 0-9. 0，孵育時間的范圍為10-70min。Hl配置O. 1-1.0X106 ng/mL的克百威標準溶液，將上述制備好的電流型免疫傳感器分別浸入不同濃度的克百威標準溶液，在常溫下孵育30min，檢測免疫前后電流變化得到其工作曲線Illll將電流型免疫傳感器分別在1. O X IO3 ng/mL?；旌鲜褂玫霓r(nóng)藥溶液中常溫下孵育40min，以檢測其選擇性；選六根制備好的免疫傳感器檢測其重現(xiàn)性；連續(xù)7天依次檢測相同濃度的克百威溶液以檢測其穩(wěn)定性；將免疫后的傳這器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH 2.8)解離克百威農(nóng)藥5min后再次免疫，檢測其再生能力III丨把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3次，噴灑上一定濃度的農(nóng)藥，放置24h后，用PBS (pH 7. 5)做溶劑超聲處理30min(換溶劑三次)，以檢測實際樣品的回收率。此種免疫傳感器檢測農(nóng)藥克百威殘留的檢測方法操作工藝簡單，檢測時間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力好和回收率符合要求，符合我國農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)發(fā)展和國際化要求。
權(quán)利要求
1.一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于電流型免疫傳感器的組狀過程為自組裝4’4-硫代聯(lián)苯硫酚、電沉積納米金，重復(fù)第一步和第二步2遍，自組裝克百威單克隆抗體，自組裝BSA封閉。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于利用納米金良好的導(dǎo)電性、大的比表面積和生物相容性用于改善電極性能和吸附蛋白A，利用蛋白A可以和抗體的Fe端特異性結(jié)合來定向固定抗體，以更有效的完成目標成分克百威的免疫檢測。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，免疫傳感器的修飾及表征過程，有關(guān)實驗參數(shù)的優(yōu)化，所制備的免疫傳感器的工作曲線為克百威濃度O. l-106ng/mL時，檢測克百威農(nóng)藥的工作曲線為％ΛΙ = 16.676 + 8.7332 IgC (ng/mL)，檢測限為O. 06ng/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測克百威農(nóng)藥殘留的免疫傳感器制備方法，其特征在于自組裝4’4-硫代聯(lián)苯硫酚、電沉積納米金，重復(fù)第一步和第二步2遍，與傳統(tǒng)的方法相比，采用4’4-硫代聯(lián)苯硫酚兩端的巰基以及其剛性結(jié)構(gòu)，巰基一端通過金硫鍵連接裸金電極，巰基另一端通過金硫鍵連接電沉積的納米金，并通過層層自組裝的方法，構(gòu)建了一種具有高穩(wěn)定性、高度有序的金硫體系。由于納米金較高的比表面積、穩(wěn)定性和導(dǎo)電性可以增大電極表面電子的轉(zhuǎn)移和生物相容性；通過層層自組裝，擴大了電極的有效固定面積，提高了電極表面抗體的有效固定量，從而使制備的電流型免疫傳感器檢測時間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力好和回收率符合要求。
文檔編號G01N27/327GK103063842SQ20131000066
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者孫霞, 朱盈, 王相友, 劉君峰, 翟晨 申請人:山東理工大學(xué)