一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品檢測和生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，其公開了一種快速檢測黃曲霉毒素的競爭型免疫傳感器。其制作方案及檢測方法是：以絲網(wǎng)印刷電極為工作電極，通過電沉積法修飾一層銀納米粒子，然后依次加入黃曲霉毒素抗體、牛血清白蛋白、黃曲霉毒素以及負(fù)載銅離子羥基磷灰石標(biāo)記的抗原混合溶液，以稀硫酸溶解負(fù)載銅離子羥基磷灰石，使其內(nèi)部的銅離子釋放出來，使黃曲霉毒素的檢測轉(zhuǎn)化為銅離子的檢測，實現(xiàn)了較高的靈敏度，檢測限可低至0.1ng/kg。
【專利說明】
一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測與生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速檢測黃曲霉毒素的絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器。

【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，主要有B1、B2、Gl、G2以及另外兩種代謝產(chǎn)物Ml、M2。其中Ml和M2是從牛奶中分離出來的。B1、B2、Gl、G2、Ml和M2在分子結(jié)構(gòu)上十分接近。
[0003]黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致癌物質(zhì)，其致癌力比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，黃曲霉毒素BI的半數(shù)致死量為0.36mg/kg體重，屬特劇毒的毒物范圍。它引起人的中毒主要是損害肝臟，發(fā)生肝炎肝硬化，肝壞死等。臨床表現(xiàn)有胃部不適、食欲減退，惡心嘔吐，腹脹及肝區(qū)觸痛等，嚴(yán)重者出現(xiàn)水腫昏迷，以至抽搐而死。
[0004]黃曲霉毒素在農(nóng)產(chǎn)品中幾乎無法避免，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，黃曲霉毒素超標(biāo)的玉米并不少見。國家衛(wèi)生部門禁止企業(yè)使用被嚴(yán)重污染的糧食進(jìn)行食品加工生產(chǎn)，并制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)督企業(yè)執(zhí)行。但黃曲霉毒素即使含量很低依舊會對人體健康造成侵害，很難進(jìn)行控制。
[0005]1995年,世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉毒素最高允許濃度為15Pg/kg ;美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的總量)不能超過15Pg/kg ;人類消費的牛奶中的含量不能超過0.5Pg/kg，其他動物飼料中的含量不能超過30(^g/kg。而歐盟國家規(guī)定更加嚴(yán)格，花生和堅果及其加工產(chǎn)品、所有谷類食品及加工產(chǎn)品中黃曲霉毒素BI限量為2.0Pg/kg ;原奶、熱處理奶及加工奶產(chǎn)品中Ml限量為0.05(^g/kg ;嬰兒食品(包括嬰幼兒奶)中Ml限量為0.025Pg/kg。
[0006]目前國內(nèi)絕大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)都在使用薄膜層析法和液相色譜法進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測。由于其檢測周期長，程序復(fù)雜所需試劑繁多等缺點已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。本發(fā)明采用絲網(wǎng)印刷電極，價格低廉，結(jié)合電化學(xué)技術(shù)和競爭免疫分析方法，提高了傳感器的選擇性并大大提高了檢測的靈敏度，節(jié)省了檢測時間，降低了檢測成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于避免傳統(tǒng)檢測方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣、檢測人員要求高、檢測成本高等缺點，提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡便且價廉易得的檢測黃曲霉毒素的絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器的制備方法。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的。本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。
[0009]1.一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(O負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的制備
將粒徑2(T60nm的納米羥基磷灰石和硫酸銅以質(zhì)量比為1:1飛的比例混合，溶于5?15mL水中，震蕩12?24小時，離心分離； 取5?10 mg獲得的負(fù)載銅離子的納米羥基磷灰石，溶于5?15mL磷酸鹽緩沖溶液，加入0.Γ0.2ml濃度為lPg/mL的黃曲霉毒素抗原溶液，孵化震蕩4?8小時，離心分離；
將獲得的負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原重新加入5?15mL磷酸鹽緩沖溶液，并加入Img的牛血清白蛋白，孵化震蕩4?8小時，離心分離；
將沉淀重新分散到5?10mL磷酸鹽緩沖溶液中，即獲得負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的儲備液；
(2)競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備
在絲網(wǎng)印刷電極上加入50μ?含有0.05mmol/L硝酸銀、0.2mmol/L檸檬酸鈉和0.05mol/L硝酸鉀的水溶液，連接電化學(xué)工作站，以-0.2V進(jìn)行恒電位沉積，沉積時間為3(Tl80s，晾干，制得銀納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷電極；
在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5?1PL濃度為lPg/mL的黃曲霉毒素抗體溶液，孵化f 4小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈；
在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5?1PL的濃度為1%牛血清白蛋白溶液，孵化f 4小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈；
在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5?10μ?的體積比為f 5:1的黃曲霉毒素、負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原混合溶液，孵化廣4小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器。
[0010]2.一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，用于黃曲霉毒素的檢測包括以下步驟:
(1)工作曲線的繪制
采用不同濃度的黃曲霉毒素按照I中所述的方法制備一系列絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器；
將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入50μ?的醋酸鹽緩沖溶液，再加入5?10μ?的1%的稀硫酸溶液，將負(fù)載銅離子的羥基磷灰石溶解，釋放出銅離子；
設(shè)定電位范圍為-0.6^0.4V，沉積電位為-0.8V，沉積時間為10(T300s，通過陽極溶出線性伏安法檢測修飾好的絲網(wǎng)印刷電極的電流響應(yīng)；
根據(jù)所得電流響應(yīng)與黃曲霉毒素濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；
(2)黃曲霉毒素的檢測
采用5?10μ?待測樣品取代步驟(I)中的黃曲霉毒素，其它與步驟(I)相同；
根據(jù)所測得的數(shù)值，對照黃曲霉毒素的工作曲線，計算出樣品中黃曲霉毒素的含量。
[0011]本發(fā)明具備以下優(yōu)勢:
(1)本發(fā)明采用的負(fù)載銅離子羥基磷灰石具有良好的生物相容性，同時其可溶于酸性溶液，原位釋放出銅離子，不需要轉(zhuǎn)移和稀釋，從而提高了檢測靈敏度，使黃曲霉毒素的檢測限可低至0.1 ng/kg，遠(yuǎn)低于檢測要求
(2)本發(fā)明不需前處理，快速、準(zhǔn)確，可用于復(fù)雜樣品中的黃曲霉毒素的檢測。

【具體實施方式】
[0012]實施例一本發(fā)明所述的負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗體的制備，步驟如下:
(1)將粒徑30nm的納米羥基磷灰石和硫酸銅以質(zhì)量比為1:3的比例混合，溶于5mL水中，震蕩12小時，離心分離；
(2)取5mg獲得的負(fù)載銅離子的納米羥基磷灰石，溶于5mL磷酸鹽緩沖溶液，加入0.1ml濃度為I Kg/mL的黃曲霉毒素抗體溶液，孵化震蕩4小時，離心分離；
(3)將獲得的負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗體重新加入5mL磷酸鹽緩沖溶液，并加入Img的牛血清白蛋白，孵化震蕩4小時，離心分離；
(4)將沉淀重新分散到5mL磷酸鹽緩沖溶液中，即獲得負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗體的儲備液。
[0013]實施例二
本發(fā)明所述的競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備，步驟如下Cl)在絲網(wǎng)印刷電極上加入50μ?含有0.05mmol/L硝酸銀、0.2mmol/L檸檬酸鈉和0.05mol/L硝酸鉀的水溶液，連接電化學(xué)工作站，以-0.2V進(jìn)行恒電位沉積，沉積時間為120s，晾干，制得銀納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷電極；
(2)在絲網(wǎng)印刷電極上滴加1PL濃度為lPg/mL的黃曲霉毒素抗體溶液，孵化I小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈；
(3)在絲網(wǎng)印刷電極上滴加1PL的濃度為1%牛血清白蛋白溶液，孵化I小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈；
(4)在絲網(wǎng)印刷電極上滴加1PL的體積比為2:1的黃曲霉毒素、負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原混合溶液，孵化I小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器。
[0014]實施例三
實施例廣2中任一所述的一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器，用于黃曲霉毒素的檢測，包括以下步驟:
(1)采用不同濃度的黃曲霉毒素按照實施例廣2中任一所所述的方法制備一系列絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器；
(2)將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入50μ?的醋酸鹽緩沖溶液，再加入5?10μ?的1%的稀硫酸溶液，將負(fù)載銅離子的羥基磷灰石溶解，釋放出銅離子；
(3)設(shè)定電位范圍為-0.6^0.4V，沉積電位為-0.8V，沉積時間為10(T300s，通過陽極溶出線性伏安法檢測修飾好的絲網(wǎng)印刷電極的電流響應(yīng)；
(4)根據(jù)所得電流響應(yīng)與黃曲霉毒素濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；
實施例四
采用1PL待測樣品取代實施例三中的黃曲霉毒素，其它與實施例三相同；
根據(jù)所測得的數(shù)值，對照黃曲霉毒素的工作曲線，計算出樣品中黃曲霉毒素的含量。
【權(quán)利要求】
1.一種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的制備 將粒徑2(T60nm的納米羥基磷灰石和硫酸銅以質(zhì)量比為1:1飛的比例混合，溶于5?15mL水中，震蕩12?24小時，離心分離； 取5?10 mg獲得的負(fù)載銅離子的納米羥基磷灰石，溶于5?15mL磷酸鹽緩沖溶液，加入0.Γ0.2ml濃度為lPg/mL的黃曲霉毒素抗原溶液，孵化震蕩4?8小時，離心分離； 將獲得的負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原重新加入5?15mL磷酸鹽緩沖溶液，并加入Img的牛血清白蛋白，孵化震蕩4?8小時，離心分離； 將沉淀重新分散到5?10mL磷酸鹽緩沖溶液中，即獲得負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原的儲備液； (2)競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備 在絲網(wǎng)印刷電極上加入50μ?含有0.05mmol/L硝酸銀、0.2mmol/L檸檬酸鈉和0.05mol/L硝酸鉀的水溶液，連接電化學(xué)工作站，以-0.2V進(jìn)行恒電位沉積，沉積時間為3(Tl80s，晾干，制得銀納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷電極； 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5?1PL濃度為lPg/mL的黃曲霉毒素抗體溶液，孵化廣4小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈； 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5?1PL的濃度為1%牛血清白蛋白溶液，孵化f 4小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈； 在絲網(wǎng)印刷電極上滴加5?10μ?的體積比為f 5:1的黃曲霉毒素、負(fù)載銅離子的羥基磷灰石標(biāo)記抗原混合溶液，孵化廣4小時，并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器。
2.—種競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，用于黃曲霉毒素的檢測，其特征在于，包括以下步驟: (1)工作曲線的繪制 采用不同濃度的黃曲霉毒素按照權(quán)利要求1中所述的方法制備一系列競爭型黃曲霉毒素免疫傳感器； 將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入50μ?的醋酸鹽緩沖溶液，再加入5?10μ?的1%的稀硫酸溶液，將負(fù)載銅離子的羥基磷灰石溶解，釋放出銅離子； 設(shè)定電位范圍為-0.6^0.4V，沉積電位為-0.8V，沉積時間為10(T300s，通過陽極溶出線性伏安法檢測修飾好的絲網(wǎng)印刷電極的電流響應(yīng)； 根據(jù)所得電流響應(yīng)與黃曲霉毒素濃度的關(guān)系，繪制工作曲線； (2)黃曲霉毒素的檢測 采用5?10μ?待測樣品取代步驟(I)中的黃曲霉毒素，其它與步驟(I)相同； 根據(jù)所測得的數(shù)值，對照黃曲霉毒素的工作曲線，計算出樣品中黃曲霉毒素的含量。
【文檔編號】G01N33/569GK104374913SQ201410622503
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月8日
【發(fā)明者】王歡, 魏琴, 張以河, 龐雪輝, 吳丹, 張勇, 馬洪敏, 范大偉 申請人:濟(jì)南大學(xué)