專利名稱：銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法及應(yīng)用。具體是基于Ag-Fe3O4納米復(fù)合材料構(gòu)建的檢測多種抗生素的無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗生素是抵抗致病微生物的藥物，是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其它生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。常用的抗生素有微生物培養(yǎng)液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物，·分為以下幾類盧-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、抗真菌抗生素等。抗生素可作為促進(jìn)畜禽生長的飼料添加劑，或作為預(yù)防和治療畜禽疾病的獸藥，在乳業(yè)中用于提高奶牛產(chǎn)奶量；在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)用于治療多種魚類疾??；在養(yǎng)蜂業(yè)用于預(yù)防蜜蜂的感染性疾病。但過量使用不可避免使母體、代謝產(chǎn)物等相關(guān)抗生素殘留于食源性動物的肌肉、奶、蛋、臟器組織中，通過食物鏈影響人類健康。鑒于抗生素的作用與危害并存，抗生素的殘留問題格外受到關(guān)注。目前對抗生素殘留量的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)及微生物法(MA)等，但是這些檢測方法存在如下不足。I.高效液相色譜法包括液-液分配色譜法、液-固色譜法以及離子交換色譜法等，此類檢測方法雖然分析效率高，靈敏度高，但液相色譜儀價格及日常維護(hù)費(fèi)用貴，分析時間長。2.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測限低，定性定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但是儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣，對檢驗人員的操作技能要求很高，且不適于現(xiàn)場檢測和快速檢測。3.微生物法手續(xù)繁多，分析速度慢且結(jié)果誤差較大。為了解決上述問題，本發(fā)明采用電化學(xué)免疫傳感器檢測抗生素，在傳感器的制備過程中材料的選擇極其重要。介孔材料作為一種功能材料，由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，使其在物理、化學(xué)等方面表現(xiàn)出特殊用途。其中四氧化三鐵作為介孔材料的一種，由于其制備工藝簡單、價格低、性能穩(wěn)定、比表面積大等，成為組裝電化學(xué)免疫傳感器的良好材料。銀納米粒子具有比表面積大、表面反應(yīng)活性高、催化效率高、吸附能力強(qiáng)以及良好的生物相容性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，可用于固載和標(biāo)記生物分子。將四氧化三鐵介孔材料和銀納米粒子合成得到Ag-Fe3O4復(fù)合材料，既保留了兩者的優(yōu)點(diǎn)，又體現(xiàn)出優(yōu)異的協(xié)同增敏效果，同時提高了其電極表面的電子傳遞效率，從而增強(qiáng)了電化學(xué)免疫傳感器的檢測靈敏度。經(jīng)對現(xiàn)有專利技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，CN201010210144. I公開了一種用于檢測食品中青霉素的電化學(xué)免疫傳感器，該發(fā)明線性范圍寬，檢測限為I ngiL—1 (即I ppb)。CN200410013741. X公開了一種用pH計檢測牛奶中青霉素的方法，該發(fā)明是依據(jù)溶液的酸度變化來檢測牛奶中是否含有抗生素，方法簡便快速，其檢測限為6 ppb。本發(fā)明對多種抗生素的檢測限在0.015 0.017 Wkg-1 (即0.015 0.017ppb)范圍。由此看出，將Ag-Fe3O4復(fù)合材料引入傳感器的制備中，顯著降低了傳感器的檢測限，對抗生素檢測的靈敏度均優(yōu)于以上兩種方法。CN200610130646. 7和CN200810052119. 8公開了兩種基于表面等離子體共振檢測
抗生素的方法，該方法具有測定時間短、精密度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但儀器設(shè)備昂貴。本發(fā)明采用Ag-Fe3O4復(fù)合材料制備了一種無標(biāo)記型免疫傳感器，是一種低成本、·高靈敏、特異性好、快速檢測多種抗生素的技術(shù)，且制備過程簡單，完成一個檢測過程需要2-3分鐘，有效克服了目前抗生素檢測方法的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是避免傳統(tǒng)檢測方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣及對檢驗人員的高技能要求的缺點(diǎn)，提供一種低成本的抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是將該抗生素電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于抗生素的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
I.本發(fā)明的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟
(1)硫堇-石墨烯混合溶液的制備；
(2)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備；
(3)電化學(xué)免疫傳感器的制備。( I)中所述的硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將硫堇加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg ml/1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將石墨烯加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液II和溶液I按體積比I: I 5混合并超聲30 min。(2)中所述的Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合3 5 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中加熱6 8 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數(shù)次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2)Ag-Fe304復(fù)合材料的制備介孔Fe3O4和AgNO3按質(zhì)量比I: 0. 5 I. 5加入到超純水中，震蕩20 30 h，然后加入新配制的50 mmol L—1 NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)pH小于2，震蕩20 40 min，用超純水洗至pH等于7，磁力分離得到Ag-Fe3O4復(fù)合材料；
3)孵化溶液的配制將適量Ag-Fe3O4復(fù)合材料加入到超純水中，超聲20 40min，得到I 3 mg mL—1孵化溶液；
4)Ag-Fe304-抗生素抗體的制備在4V條件下,將I mL孵化溶液加入到400 y L體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛中，震蕩I 2 h，磁力分離去除上清液，加入10 UL 10 u g mr1抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩20 30 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)中所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處 理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在
—0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將6 8ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥；
3)滴涂6ML體積分?jǐn)?shù)為2. 5%的戊二醛溶液，4 °C冰箱中濕潤條件下保存2 h，超純水清洗，晾干成膜；
4)滴涂6ML Ag-Fe3O4-抗生素抗體，4 V冰箱中保存至干燥；
5)滴涂3UL 100牛血清白蛋白，4 °C冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，制得抗生素電化學(xué)免疫傳感器。2.本發(fā)明所述的制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，用于抗生素檢測，其特征是包括以下步驟
(1)工作曲線的繪制；
(2)抗生素的檢測。(I)中所述的工作曲線的繪制，步驟如下
1)將制備好的抗生素電化學(xué)免疫傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統(tǒng)，結(jié)合電化學(xué)工作站，在PH為6. 5 8. 5磷酸緩沖液中，用方波伏安法(SWV)在一 0.6 0.6 V電壓范圍內(nèi)測定，記錄響應(yīng)電流Z0 ;
2)用水沖洗步驟I)中的工作電極，將配制好的不同濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到不同工作電極表面，4 V冰箱中保存至干燥；
3)分別將步驟2)修飾的工作電極執(zhí)行步驟I)所述的測定過程，此時的響應(yīng)電流記為
Ii ;
4)根據(jù)步驟I)和步驟3)所得的電流差值A(chǔ)J=I0-Ii與抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。3.本發(fā)明所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，其特征是所述的抗生素是內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類或大環(huán)內(nèi)酯類；
所述的內(nèi)酰胺類選自下列之一青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、氨芐西林、雙氯青
霉素；
所述的氨基糖苷類選自下列之一鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、壯觀霉素、丁胺卡那霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素；
所述的四環(huán)素類選自下列之一四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺四環(huán)素、甲烯土霉素；
所述的大環(huán)內(nèi)酯類選自下列之一紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、克林霉素、竹桃霉素、吉它霉素、泰樂霉素。本發(fā)明的有益成果
(1)電化學(xué)免疫傳感器制備方法，利用納米材料的增效作用和兩種納米材料的協(xié)同增敏作用，使制得的傳感器具有更高的靈敏度；
(2)介孔Fe3O4制備工藝簡單，價格低，導(dǎo)電性好，高的磁飽和度可以放大信號，使制得的傳感器易于推廣；
(3)將表面層層修飾技術(shù)應(yīng)用到電化學(xué)免疫傳感器的制備中，使納米介孔材料增效的抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備具有可控性，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性；·
(4)電化學(xué)免疫傳感器檢測抗生素的方法，可以實(shí)現(xiàn)特異性、高靈敏和快速檢測。


圖I為銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備過程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，包括以下步驟。( I)硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將0.15 g殼聚糖加入到50 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 3%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將12 mg硫堇加入到4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 mg mL—1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將12mg石墨烯加入到4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.3%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液I和溶液II按體積比2:1混合并超聲30 min。(2) Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
I)介孔Fe3O4的制備將I g FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合3 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中加熱6 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數(shù)次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2Mg-Fe3O4復(fù)合材料的制備20 mg介孔Fe3O4和10 mg AgNO3加入到20 mL超純水中，震蕩20 h，然后加入新配制的50 mmol ^r1NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)pH小于2，震蕩20 min，用超純水洗至pH為7，磁力分離得到Ag-Fe3O4復(fù)合材料；
3)孵化溶液的配制將4 mg Ag-Fe3O4復(fù)合材料加入到4 mL超純水中,超聲20 min,得到I mg mL-1孵化溶液；4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備:在4 V條件下，將I mLl mg mL-1孵化溶液加入到400 UL體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛中，震蕩I h，磁力分離去除上清液，加入10 UL 10U g mL—1抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩20 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)根據(jù)圖I進(jìn)行抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備，步驟如下 I)將直徑4 mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將6 ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯；
3)將6UL體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯上，4 0C冰箱中濕潤狀態(tài)下保存2 h之后再在室溫下干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛；
4)將6UL Ag-Fe3O4-抗生素抗體滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛上，4 V冰箱中保存至干燥得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體；
5)將3u L 100 Mg mL—1牛血清白蛋白滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戍二醒/Ag-Fe3O4-抗生素抗體上，4 V冰箱中保存至干燥，用超純水清洗，晾干成膜得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體/牛血清白蛋白，制得抗生素電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)施例2
銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，包括以下步驟。( I)硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將0.25 g殼聚糖加入到50 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將8 mg硫堇加入到2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到4 mg mL—1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將8mg石墨烯加入到2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到4 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液I和溶液II按體積比3: I混合并超聲30 min。(2) Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合4 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中加熱7 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數(shù)次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2)Ag-Fe3O4復(fù)合材料的制備30 mg Fe3O4和30 mg AgNO3加入到30 mL超純水中，震蕩24 h，然后加入新配制的50 mmol -L^1 NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)pH小于2,震蕩30 min,用超純水洗至pH等于7,磁力分離得到Ag-Fe3O4復(fù)合材料；
3)孵化溶液的配制將4mg Ag-Fe3O4復(fù)合材料加入到2 mL超純水中,超聲30 min,得到2 mg mL-1孵化溶液；
4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備在4 V條件下，將I mL2 mg mL4孵化溶液加入到400 UL體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛中，震蕩1.5 h，磁力分離去除上清液，加入10 UL10 ygmr1抗生素抗體，再加入I mL pH=7. 4磷酸緩沖液，震蕩24 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH=7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)根據(jù)圖I進(jìn)行抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；
2)將7ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯；· 3)將6UL體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯上，4 0C冰箱中濕潤狀態(tài)下保存2 h之后再在室溫下干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛；
4)將6UL Ag-Fe3O4-抗生素抗體滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛上，4 V冰箱中保存至干燥得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體；
5)將3u L 100 Mg mL—1牛血清白蛋白滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戍二醒/Ag-Fe3O4-抗生素抗體上，4 V冰箱中保存至干燥，用超純水清洗，晾干成膜得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體/牛血清白蛋白，制得抗生素電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)施例3
銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，包括以下步驟。( I)硫堇-石墨烯混合溶液的制備，步驟如下
1)殼聚糖溶液的配制將0.35 g殼聚糖加入到50 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 7%的殼聚糖溶液；
2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制取15 mg硫堇加入到3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到5 mg mL—1的溶液I ;
3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制取15mg石墨烯加入到3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到5 mg mL—1的溶液II ；
4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液III)的配制將溶液I和溶液II按體積比5: I混合并超聲30 min。(2) Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，步驟如下
1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合5 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中加熱8 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數(shù)次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ；
2)Ag-Fe3O4復(fù)合材料的制備20 mg Fe3O4和30 mg AgNO3加入到30 mL超純水中，震蕩30 h，然后加入新配制的50 mmol ^r1NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)pH小于2,震蕩40 min,用超純水洗至pH等于7,磁力分離得到Ag-Fe3O4復(fù)合材料；3)孵化溶液的配制將6mg Ag-Fe3O4復(fù)合材料加入到2 mL超純水中,超聲40 min,得到3 mg mL-1孵化溶液；
4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備在4 V條件下，將I mL3 mg mL4孵化溶液加入 到400 UL體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛中，震蕩2 h，磁力分離去除上清液，加入10 u L
10 Ug 抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩30 h。然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。(3)根據(jù)圖I進(jìn)行抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Um的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ；· 2)將8ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯；
3)將6UL體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯上，4 0C冰箱中濕潤狀態(tài)下保存2 h之后再在室溫下干燥，得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛；
4)將6UL Ag-Fe3O4-抗生素抗體滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛上，4 V冰箱中保存至干燥得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體；
5)將3u L 100 Mg mL—1牛血清白蛋白滴在玻碳電極/硫堇-石墨烯/戍二醒/Ag-Fe3O4-抗生素抗體上，4 V冰箱中保存至干燥，用超純水清洗，晾干成膜得到玻碳電極/硫堇-石墨烯/戊二醛/Ag-Fe3O4-抗生素抗體/牛血清白蛋白，制得抗生素電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)施例4
實(shí)施例I 3制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，分別用于抗生素檢測，步驟如下。I)將制備好的抗生素電化學(xué)免疫傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統(tǒng)，結(jié)合電化學(xué)工作站，在PH為6.5 8.5磷酸緩沖液中，用方波伏安法(SWV)在一 0.6 0.6 V電壓范圍內(nèi)測定，記錄響應(yīng)電流To。2)用水沖洗步驟I)中的工作電極，將配制好的不同濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到不同工作電極表面，4 V冰箱中保存至干燥。3)分別將步驟2)修飾的工作電極執(zhí)行步驟I)所述的測定過程，此時的響應(yīng)電流記為I1O4)根據(jù)步驟I)和步驟3)所得的電流差值A(chǔ)J= I0-Ii與抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。5)將步驟2)中的標(biāo)準(zhǔn)溶液更換為被檢測的樣品溶液，重復(fù)步驟2)和步驟3)，根據(jù)滴涂樣品溶液前后響應(yīng)電流的變化值△/和工作曲線，得到樣品溶液中某種抗生素的含量。實(shí)施例5(盧-內(nèi)酰胺類青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、氨芐西林或雙氯青霉素) 一種內(nèi)酰胺類抗生素電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，包括以下步驟。( I)選擇能特異性識別3 -內(nèi)酰胺類抗生素的抗體，按照實(shí)施例I所述的步驟制備電化學(xué)免疫傳感器。
(2)按照實(shí)施例4所述的步驟進(jìn)行檢測。3 -內(nèi)酰胺類抗生素的檢測技術(shù)指標(biāo)對比結(jié)果見表I。表I盧-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測技術(shù)指標(biāo)對比結(jié)果
權(quán)利要求
1.銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟 (1)硫堇-石墨烯混合溶液的制備； (2)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備； (3)電化學(xué)免疫傳感器的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是所述的硫堇-石墨烯混合溶液的制備，包括以下步驟 (1)殼聚糖溶液的配制將殼聚糖加入到體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸中攪拌2h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液； (2)硫堇-殼聚糖溶液(溶液I)的配制將硫堇加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg ml/1的溶液I ; (3)石墨烯-殼聚糖溶液(溶液II)的配制將石墨烯加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3 0. 7%的殼聚糖溶液中，超聲30 min得到3 5 mg mL—1的溶液II ； (4)硫堇-石墨烯混合溶液(溶液HI)的配制將溶液II和溶液I按體積比I: I 5混合并超聲30 min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是所述的Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備，包括以下步驟 (1)介孔Fe3O4的制備將Ig FeCl3 *6H20溶解在18 mL乙二醇溶液中形成透明溶液，然后加入3 g NaAc和10 mL 丁二胺,超聲混合3 5 min,然后190 V條件下在聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中加熱6 8 h，冷卻到室溫，黑色的固體用超純水洗滌數(shù)次直到上清液澄清，得到介孔Fe3O4 ； (2)Ag-Fe3O4復(fù)合材料的制備介孔Fe3O4和AgNO3按質(zhì)量比I : 0. 5 I. 5加入到超純水中，震蕩20 30 h，然后加入新配制的50 mmol ^IZ1NaBH4溶液，磁力分離去除上清液，用超純水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)pH小于2，震蕩20 40 min，用超純水洗至pH等于7，磁力分離得到Ag-Fe3O4復(fù)合材料； (3)孵化溶液的配制將適量Ag-Fe3O4復(fù)合材料加入到超純水中，超聲20 40min，得到I 3 mg mL—1孵化溶液； (4)Ag-Fe3O4-抗生素抗體的制備在4 V條件下,將I mL孵化溶液加入到400 u L體積分?jǐn)?shù)2. 5%的戊二醛中，震蕩I 2 h，磁力分離去除上清液，加入10 UL 10 u g -mr1抗生素抗體，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，震蕩20 30 h，然后磁力分離去除上清液，再加入I mL pH為7. 4磷酸緩沖液，最后得到Ag-Fe3O4-抗生素抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法，其特征是 所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備，包括以下步驟 (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol L—1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V掃描，峰電位差小于110 mV ； (2)將6 8ML硫堇-石墨烯混合溶液滴到玻碳電極表面，室溫干燥； (3)滴涂6ML體積分?jǐn)?shù)為2. 5%的戊二醛溶液，4 °C冰箱中潤濕條件下保存2 h，超純水清洗，晾干成膜；(4)滴涂6ML Ag-Fe3O4-抗生素抗體，4 V冰箱中保存至干燥； (5)滴涂3UL 100牛血清白蛋白，4 V冰箱中保存至干燥，超純水清洗，晾干成膜，制得抗生素電化學(xué)免疫傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4所述的制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，其特征是用于抗生素的檢測，包括以下步驟 (1)工作曲線的繪制； (2)抗生素的檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，用于抗生 素的檢測，其特征是所述工作曲線的繪制，包括以下步驟 (1)將制備好的抗生素電化學(xué)免疫傳感器作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉬絲電極作為輔助電極，組成三電極系統(tǒng)，結(jié)合電化學(xué)工作站，在PH為6. 5 8. 5磷酸緩沖液中，用方波伏安法(SWV)在一 0.6 0.6 V電壓范圍內(nèi)測定，記錄響應(yīng)電流Z0 ; (2)用水沖洗步驟(I)中的工作電極，將配制好的不同濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到不同工作電極表面，4 V冰箱中保存至干燥； (3)分別將步驟(2)修飾的工作電極執(zhí)行步驟(I)所述的測定過程，此時的響應(yīng)電流記為Ij ； (4)根據(jù)步驟(I)和步驟(3)所得的電流差值A(chǔ)J=A-Ji與抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6所述的銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器，其特征是所述的抗生素是內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類或大環(huán)內(nèi)酯類； 所述的內(nèi)酰胺類選自下列之一青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素、氨芐西林、雙氯青霉素； 所述的氨基糖苷類選自下列之一鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、壯觀霉素、丁胺卡那霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素； 所述的四環(huán)素類選自下列之一四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺四環(huán)素、甲烯土霉素； 所述的大環(huán)內(nèi)酯類選自下列之一紅霉素、螺旋霉素、林可霉素、克林霉素、竹桃霉素、吉它霉素、泰樂霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了銀雜化介孔四氧化三鐵抗生素免疫傳感器制備方法及應(yīng)用。電化學(xué)免疫傳感器制備方法是在玻碳電極表面修飾硫堇-石墨烯混合溶液，通過戊二醛交聯(lián)Ag-Fe3O4介孔納米粒子孵化的抗生素抗體，并以牛血清白蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)，制備成一種抗生素電化學(xué)免疫傳感器。抗生素的檢測方法是將參比電極—飽和甘汞電極、對電極—鉑絲電極及工作電極正確連接在電化學(xué)工作站上，通過方波伏安法進(jìn)行免疫檢測。本發(fā)明的抗生素電化學(xué)免疫傳感器具有較高的靈敏度和專一性，檢測方法簡單，完成一個檢測過程需要2-3分鐘，具有快速高效、特異性好、成本低、操作簡便等特點(diǎn)。
文檔編號G01N33/53GK102749442SQ201210261179
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者于海琴, 于淑君, 吳丹, 孫蒙, 張勇, 曹偉, 朱寶存, 李玉陽, 李賀, 杜斌, 王志玲, 羅川南, 閆良國, 馬洪敏, 魏琴 申請人:濟(jì)南大學(xué)