專利名稱：殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用。具體是基于納米多孔金膜和Au@Pd@Pt殼核納米材料，構(gòu)建的檢測多種腫瘤標(biāo)志物的夾心型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，用于檢測血清中的腫瘤標(biāo)志物。屬于新型納米功能材料與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤標(biāo)志物在癌癥的早期診斷中具有重要的實(shí)用價(jià)值。腫瘤標(biāo)志物是ー種在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生、或者由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)而產(chǎn)生的，反應(yīng)腫瘤存在和生長的ー類物質(zhì)。包括蛋白質(zhì)、激素、酶、多胺及癌基因產(chǎn)物等。腫瘤標(biāo)志物在臨床中應(yīng)用廣泛，在正常人群中的癌癥篩查、有癥狀者的癌癥輔助 診斷、癌癥的臨床階段的分期、癌癥疾病進(jìn)程的預(yù)后評估治療方案、判斷癌癥是否復(fù)發(fā)中起著極其重要的作用。目前已有的腫瘤標(biāo)志物的臨床檢測方法很多，有放射免疫測定法，酶聯(lián)免疫測定法，化學(xué)發(fā)光免疫測定法等。但這些檢測方法存在如下不足。(I)放射免疫測定法放射免疫分析自問世以來，在生物醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。其具有操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但該法放射性污染嚴(yán)重，且靈敏度低，檢測限高，因此限制了它的應(yīng)用。(2)酶免疫分析測定法酶免疫分析法因標(biāo)記物制備簡單，有效期長，對環(huán)境無污染等特點(diǎn)，得到了迅速的普及和發(fā)展。但酶免疫分析測定法中的酶容易失活，導(dǎo)致其信號時(shí)間短，降低了方法的靈敏度和重現(xiàn)性。(3)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定法這ー方法具有靈敏、快速、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作，方法靈活多樣的優(yōu)點(diǎn)。但是影響化學(xué)發(fā)光分析的檢測結(jié)果的因素較多，因此其穩(wěn)定性較差，而且在發(fā)生化學(xué)反應(yīng)之后，樣品的發(fā)光無法再現(xiàn)。由以上分析可以看出，發(fā)明ー種檢測限低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的腫瘤標(biāo)志物傳感器迫在眉睫。納米材料修飾的電化學(xué)免疫傳感器由于其簡單易行、成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏快速的優(yōu)點(diǎn)，近幾年備受人們關(guān)注，研究了一系列基于納米材料構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器參見(a) Lai G. S. ; Yan F. ; Wu J. ; Leng C. ; Ju H. X. Anal. Chem. , 2011，83，2726-2732. (b) Du D. ; Wang L. M. ; Shao Y. Y. ; Wang J. ; Engelhard M. H. ; Lin Y. H.Anal. Chem. , 2011, 83, 746-752.。本發(fā)明將殼核納米材料用于電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建中，賦予電化學(xué)免疫傳感器更為突出的特色。首先采用納米多孔金膜固定一杭，由于納米多孔金膜具有三維連續(xù)開孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積，有利于固定更多的一杭，而且納米多孔金膜良好的生物相容性，可以與ー抗直接結(jié)合，避免了交聯(lián)劑的使用；然后采用Au@Pd@Pt殼核納米材料標(biāo)記ニ抗，AuiPdiPt既保留了 Au、Pd、Pt三種貴金屬納米材料的優(yōu)勢，又體現(xiàn)出優(yōu)異的協(xié)同增敏效果，從而提高了其電極表面的電子傳遞效率，降低了檢測限、増加了傳感器的檢測靈敏度。在無酶情況下，直接采用Au@Pd@Pt殼核納米材料作為ニ抗標(biāo)記物，簡化了操作步驟，增強(qiáng)了傳感器的穩(wěn)定性，制備了ー種適用于檢測多種腫瘤標(biāo)志物的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。經(jīng)對現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物檢測專利技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前CN200910212772. 0公開了ー種用于檢測甲胎蛋白的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，該傳感器的檢測限達(dá)到0. 035 ng.mr1,線性范圍為0.01 20 ng.mじ1。CN201110199112.0公開了ー種檢測磷化蛋白的電化學(xué)免疫傳感器，其檢測限為0. 01 ng mじ1,線性范圍為0. 02 20 ng mLベ。CN03113053. 4公開了ー種檢測CA-125無試劑安培免疫傳感器。

本發(fā)明分別采用納米多孔金膜和Au@Pd@Pt殼核納米材料作為電極修飾和ニ抗標(biāo)記材料，降低了傳感器的檢出限，對多種腫瘤標(biāo)記物的檢出限在0.91 I. 5 pg*mじ1之間。由此可以看出，其方法的靈敏度得到顯著提高，靈敏度均優(yōu)于以上三種方法，可以準(zhǔn)確定量檢測多種腫瘤標(biāo)志物。本發(fā)明利用免疫反應(yīng)的高特異性，結(jié)合納米多孔金膜和Au@Pd@Pt殼核納米材料制備了ー種夾心型電化學(xué)免疫傳感器并用來檢測多種腫瘤標(biāo)志物。本發(fā)明具有靈敏度高、特異性好、檢測成本低、能快速檢測多種腫瘤標(biāo)志物等優(yōu)勢，且本發(fā)明制備過程簡單，操作過程簡便，有效克服了目前腫瘤標(biāo)志物檢測方法的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー在于避免傳統(tǒng)檢測方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣、檢測人員要求高等缺點(diǎn)，提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡便的快速檢測多種腫瘤標(biāo)記物的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之ニ是將該腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于多種腫瘤標(biāo)志物的檢測。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的。I.殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用，其特征在干，包括以下步驟
(1)納米多孔金膜的制備；
(2)Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物ニ抗復(fù)合物的制備；
(3)電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建。(I)中所述的納米多孔金膜的制備，具體包括以下步驟
1)將銀金合金薄膜漂浮在14 16mol じ1硝酸液面上0.5 5 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜；
2)將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7.O。(2)中所述的Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物ニ抗復(fù)合物的制備，具體包括以下步驟
I)將Au@Pd@Pt殼核納米材料和腫瘤標(biāo)記物ニ抗混合加入到pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，使Au@Pd@Pt殼核納米材料與腫瘤標(biāo)記物ニ抗的質(zhì)量濃度比例為500 1000:1，配制成混合液A ；
2)將上述混合液A室溫下震蕩孵化12 24 h, 10000^12000 rpm下離心，用pH = 7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后重新分散于pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成混合液B并儲存在4 °(下備用。(3)中所述的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建，具體包括以下步驟
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol · Γ1鐵氰化鉀溶液中，在一O. 2 O. 6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ；
2)將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將腫瘤標(biāo)志物一抗滴涂到步驟2)納米多孔金膜修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干；
4)將濃度為100μ g · ι Γ1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)腫瘤標(biāo)志物一抗修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
5)將腫瘤標(biāo)志物抗原滴涂在步驟4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干；
6)將溶液B滴涂在步驟5)腫瘤標(biāo)志物抗原修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干，電化學(xué)免疫傳感器制備完成。2.本發(fā)明所述的制備的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，用于腫瘤標(biāo)志物的檢測，步驟如下
(1)工作曲線的繪制；
(2)腫瘤標(biāo)志物的檢測。(I)中所述的工作曲線的繪制，步驟如下
1)將參比電極一飽和甘汞電極、對電極一鉬絲電極和工作電極正確連接在電化學(xué)工作站上；
2)在pH=7 8磷酸緩沖液中，通過計(jì)時(shí)電流法檢測修飾好的工作電極對過氧化氫的響
應(yīng)；
3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。3.本發(fā)明所述的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，所述的腫瘤標(biāo)記物，選自下列目前發(fā)病率高的腫瘤標(biāo)志物之一癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，α-L-巖藻糖苷酶(AFU)，前列腺特異性抗原(PSA)，CA-125，CA-199，CA-724，CA-242，人絨毛膜促性腺激素(HCG)。本發(fā)明的有益成果
(I)腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，將納米多孔金膜引入到腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中，利用納米多孔金膜良好的電子傳遞能力以及其優(yōu)異的生物相容性，顯著改善了電極的性能。(2)將Au@Pd@Pt殼核納米材料與腫瘤標(biāo)志物二抗直接孵化，利用貴金屬優(yōu)異的生物相容性和高的催化性能，在二抗的標(biāo)記物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的檢測誤差，簡化了二抗標(biāo)記物的制作步驟，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。、
(3)使用完全相同的納米材料和修飾方法，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，只需改變腫瘤標(biāo)志物種類即可實(shí)現(xiàn)多種腫瘤標(biāo)志物的高靈敏、特異性檢測，此方法簡單、經(jīng)濟(jì)，有利于腫瘤標(biāo)志物傳感器的商品化。(4)本發(fā)明所制備的電化學(xué)免疫傳感器，操作簡單，檢測速度快，30 s即可完成樣品測定，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量樣品的測定。(5)本發(fā)明檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，檢測結(jié)果均有儀器自動完成和記錄，避免了主觀因素的影響，并有很好的重現(xiàn)性，便于現(xiàn)場檢測。


下面結(jié)合

和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。圖I為Au@Pd@Pt殼核納米材料的透射電鏡圖。
圖2為一種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，包括以下步驟。(I)將銀金合金薄膜漂浮在15 mo I · L—1硝酸液面上O. 5 min,利用濃硝酸將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜。將納米多孔金膜用超純水洗滌至其PH=7. O。(2)在燒瓶內(nèi)加入20 mmol · L4氯金酸2. 5 mL ；20 mmol · L4四氯鈕!酸鈉4.0mL ；20 mmol · L—1四氯鉬酸鉀4. O mL ;嵌段式聚醚F-127 O. I g，混合均勻后立即加入O. 4mo I · L—1抗壞血酸I. O mL。室溫下攪拌I h。離心水洗3次,干燥后即制成AuOPdOPt殼核納米材料，其納米材料的形貌見圖1，由圖I透射電鏡圖可以看出，Au@Pd@Pt為殼核結(jié)構(gòu)，其粒徑為20 nm，材料分散性好、顆粒均勻，適合作為電化學(xué)免疫傳感器的制作材料。(3)將Au@Pd@Pt殼核納米材料和腫瘤標(biāo)記物二抗混合加入到pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中制成混合液，使Au@Pd@Pt殼核納米材料與腫瘤標(biāo)記物二抗的質(zhì)量濃度比例為5001，將上述混合液室溫下震蕩孵化12 h。10000 rpm下離心，用pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后重新分散于pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中，獲得Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物二抗復(fù)合物溶液。(4)將直徑4 mm的玻碳電極依次用I. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol · Γ1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV。(5)根據(jù)圖2 —種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程進(jìn)行制備。將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥。將10 μ g -mL-1腫瘤標(biāo)志物一抗6 μ L滴涂到納米多孔金膜修飾的電極表面，置于4 °C濕潤條件下晾干。將濃度為100μ g ι Γ1牛血清白蛋白3 μ L滴涂到腫瘤標(biāo)志物一抗修飾的電極表面，4 ° C下濕潤條件下晾干。將腫瘤標(biāo)志物抗原6 μ L滴涂在牛血清白蛋白修飾的電極表面，4 °C下濕潤條件下晾干。將步驟(2)制備的Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物二抗復(fù)合物溶液6 μ L滴涂于腫瘤標(biāo)志物抗原修飾的電極表面，4 °C下濕潤條件下晾干。實(shí)施例2一種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，包括以下步驟。(I)將銀金合金薄膜漂浮在15 mo I · Γ1硝酸液面上3 min，利用濃硝酸將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜。將納米多孔金膜用超純水洗滌至其PH=7. O。(2)在燒瓶內(nèi)加入20 mmol · L4氯金酸2. 5 mL ；20 mmol · L4四氯鈕!酸鈉4.0mL ；20 mmol · L—1四氯鉬酸鉀4.0 mL ;嵌段式聚醚F-127 O. lg，混合均勻后立即加入O. 4mo I · L—1抗壞血酸I. O mL。室溫下攪拌I h。離心水洗3次,干燥后即制成AuOPdOPt殼核納米材料，其透射電鏡形貌見圖I。(3)將Au@Pd@Pt殼核納米材料和腫瘤標(biāo)記物二抗混合加入到pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中制成混合液，使Au@Pd@Pt殼核納米材料與腫瘤標(biāo)記物二抗的質(zhì)量濃度比例為7501，將上述混合液室溫下震蕩孵化12 h。10000 rpm下離心，用pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后重新分散于PH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中。
(4)將直徑4 mm的玻碳電極依次用I. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol · Γ1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV。(5)根據(jù)圖2 —種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程進(jìn)行制備。將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥。將10 Ug^mL-1腫瘤標(biāo)志物一抗6 μ L滴涂到納米多孔金膜修飾的電極表面，置于4 ° C濕潤條件下晾干。將濃度為100μ g ι Γ1牛血清白蛋白3 μ L滴涂到腫瘤標(biāo)志物一抗修飾的電極表面，4 ° C下濕潤條件下晾干。將腫瘤標(biāo)志物抗原6 μ L滴涂在牛血清白蛋白修飾的電極表面，4 °C下濕潤條件下晾干。將步驟(2)制備的Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物二抗復(fù)合物溶液6 μ L滴涂于腫瘤標(biāo)志物抗原修飾的電極表面，4 °C下濕潤條件下晾干。實(shí)施例3
一種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，包括以下步驟。(I)將銀金合金薄膜漂浮在15 mo I · Γ1硝酸液面上5 min，利用濃硝酸將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜。將納米多孔金膜用超純水洗滌至其PH=7. O。(2)在燒瓶內(nèi)加入20 mmol · L4氯金酸2. 5 mL ；20 mmol · L4四氯鈕!酸鈉4.0mL ；20 mmol · L—1四氯鉬酸鉀4. O mL ;嵌段式聚醚F-127 0. I g，混合均勻后立即加入0. 4mo I · L—1抗壞血酸I. O mL。室溫下攪拌I h。離心水洗3次,干燥后即制成AuOPdOPt殼核納米材料，其透射電鏡形貌見圖I。(3)將Au@Pd@Pt殼核納米材料和腫瘤標(biāo)記物二抗混合加入到pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中制成混合液，使Au@Pd@Pt殼核納米材料與腫瘤標(biāo)記物二抗的質(zhì)量濃度比例為1000 : 1，將上述混合液室溫下震蕩孵化12 h，10000 rpm下離心，用pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后重新分散于PH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中。(4)將直徑4 mm的玻碳電極依次用I. 0,0. 3和0. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol · Γ1鐵氰化鉀溶液中，在一0.2 0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV。(5)根據(jù)圖2 —種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過程進(jìn)行制備。將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥。將10 μ g. mL—1腫瘤標(biāo)志物一抗6μ L滴涂到納米多孔金膜修飾的電極表面，置于4 °C濕潤條件下晾干。將濃度為100μ g Π Γ1牛血清白蛋白3 μ L滴涂到腫瘤標(biāo)志物一抗修飾的電極表面，4 ° C下濕潤條件下晾干。將腫瘤標(biāo)志物抗原6 μ L滴涂在牛血清白蛋白修飾的電極表面，4 °C下濕潤條件下晾干。將步驟(2)制備的Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物二抗復(fù)合物溶液6 μ L滴涂于腫瘤標(biāo)志物抗原修飾的電極表面，4 °C下濕潤條件下晾干。實(shí)施例4
實(shí)施例I 3制備的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器，分別用于腫瘤標(biāo)志物檢測，包括以下步驟。(I)工作曲線的繪制，步驟如下
1)將參比電極一飽和甘汞電極、對電極一鉬絲電極和工作電極正確連接在CHI760D電 化學(xué)工作站上；
2)在pH=7.4磷酸緩沖液中，通過計(jì)時(shí)電流法檢測修飾好的工作電極對過氧化氫的響
應(yīng)；
3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度關(guān)系，繪制工作曲線。(2)腫瘤標(biāo)志物的檢測。實(shí)施例5乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA_125、CEA或HCG
一種乳腺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用，包括以下步驟
(1)選擇乳腺癌腫瘤標(biāo)志物，按照實(shí)施例I所述的步驟構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器；
(2)按照實(shí)施例4所述的步驟進(jìn)行檢測，乳腺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測技術(shù)指標(biāo)見表I。表I 乳腺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測技術(shù)指標(biāo)_
腫瘤標(biāo)志物線性范圍，ng· ml·/1_檢測限，Pg · ml·/1
CA-125 ~0.004 ^20I. 3
CEA~0.004 ^301.2
HCG|θ· 005~20| · 5—
由表I檢測技術(shù)指標(biāo)結(jié)果表明，該電化學(xué)免疫傳感器用于乳腺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測，
其線性范圍寬，檢測限低，方法靈敏度高。實(shí)施例6肝癌腫瘤標(biāo)志物AFP或AFU
一種肝癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用，包括以下步驟
(1)選擇肝癌腫瘤標(biāo)志物，按照實(shí)施例2所述的步驟構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器；
(2)按照實(shí)施例4所述的步驟進(jìn)行檢測，肝癌腫瘤標(biāo)志物的檢測技術(shù)指標(biāo)見表2。表2 肝癌腫瘤標(biāo)志物的檢測技術(shù)指標(biāo) _
腫瘤標(biāo)志物線性范圍，ng· ml·/1_檢測限，Pg · ml·/1
AFP~0.003^ 201.3
AFU|θ· 003~20|θ· 91—
由表2檢測技術(shù)指標(biāo)結(jié)果表明，該電化學(xué)免疫傳感器用于肝癌腫瘤標(biāo)志物的檢測，其
線性范圍寬，檢測限低，方法靈敏度高。實(shí)施例7胃癌腫瘤標(biāo)志物CA-724、CA_199或CA-242 一種胃癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用，包括以下步驟
(1)選擇胃癌腫瘤標(biāo)志物，按照實(shí)施例3所述的步驟構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器；
(2)按照實(shí)施例4所述的步驟進(jìn)行檢測，胃癌腫瘤標(biāo)志物的檢測技術(shù)指標(biāo)見表3。表3胃癌腫瘤標(biāo)志物的檢測技術(shù)指標(biāo)
權(quán)利要求
1.殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，包括以下步驟 (1)納米多孔金膜的制備； (2)AuiPdiPt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物ニ抗復(fù)合物的制備； (3)電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建。
2.如權(quán)利要求I中所述的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述的納米多孔金膜的制備，步驟如下 (1)將銀金合金薄膜漂浮在14 16mol じ1硝酸液面上0. 5 5 min，將銀腐蝕掉，制成納米多孔金膜； (2)將納米多孔金膜用超純水洗滌至其pH=7.O。
3.如權(quán)利要求I中所述的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述的Au@Pd@Pt殼核納米材料一腫瘤標(biāo)記物ニ抗復(fù)合物的制備，步驟如下 (1)將Au@Pd@Pt殼核納米材料和腫瘤標(biāo)記物ニ抗混合加入到pH= 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中，使Au@Pd@Pt殼核納米材料與腫瘤標(biāo)記物ニ抗的質(zhì)量濃度比例為500 1000:1，配制成混合液A ； (2)將上述混合液A室溫下震蕩孵化12 24h, 10000^12000 rpm下離心，用pH = 7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后重新分散于pH = 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中配制成混合液B并儲存在4°C下備用。
4.如權(quán)利要求I中所述的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建，步驟如下 (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0、0. 3和0.05 mm的三氧化ニ鋁拋光粉拋光處理，こ醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol じ1鐵氰化鉀溶液中，在一0. 2 0. 6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ； (2)將納米多孔金膜修飾于玻碳電極表面，室溫干燥； (3)將腫瘤標(biāo)志物一抗滴涂到步驟(2)納米多孔金膜修飾的電極表面，置于4°C濕潤條件下晾干； (4)將濃度為100u g 牛血清白蛋白滴涂到步驟(3)腫瘤標(biāo)志物一抗修飾的電極表面，4° C下濕潤條件下晾干； (5)將腫瘤標(biāo)志物抗原滴涂在步驟(4)牛血清白蛋白修飾的電極表面，4°C下濕潤條件下晾干； (6 )將溶液B滴涂在步驟(5 )腫瘤標(biāo)志物抗原修飾的電極表面，4° C下濕潤條件下晾干，電化學(xué)免疫傳感器制備完成。
5.如權(quán)利要求廣4所述的制備的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，用于腫瘤標(biāo)志物的檢測，方法如下 (1)工作曲線的繪制； (2)腫瘤標(biāo)志物的檢測。
6.如權(quán)利要求5中所述的制備的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，用于腫瘤標(biāo)志物的檢測，其特征在于，所述的工作曲線的繪制，步驟如下 (I)將參比電極ー飽和甘汞電極、對電極ー鉬絲電極和工作電極正確連接在電化學(xué)エ作站上；(2)在pH=7 8的磷酸緩沖液中，通過計(jì)時(shí)電流法檢測修飾好的工作電極對過氧化氫的響應(yīng)； (3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。
7.如權(quán)利要求I 6所述的殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，所述的腫瘤標(biāo)記物，選自下列目前發(fā)病率高的腫瘤標(biāo)志物之一癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，a -L-巖藻糖苷酶(AFU)，前列腺特異性抗原(PSA)，CA-125，CA-199, CA-724，CA-242，人絨毛膜促性腺激素(HCG)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼核納米材料構(gòu)建的腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備及應(yīng)用，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于(1)納米多孔金膜的制備；(2)Au@Pd@Pt殼核納米材料—腫瘤標(biāo)記物二抗復(fù)合物的制備；(3)電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、特異性好、易于操作、檢測限低，能實(shí)現(xiàn)多種腫瘤標(biāo)記物的高靈敏、特異性、快速準(zhǔn)確檢測。
文檔編號G01N27/327GK102778561SQ20121026110
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者于海琴, 吳丹, 孫蒙, 張勇, 張瀟月, 曹偉, 朱寶存, 李燕, 李玉陽, 李賀, 杜斌, 羅川南, 閆良國, 馬洪敏, 魏琴 申請人:濟(jì)南大學(xué)