全血檢樣的免疫測定方法和測定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供：在公知的目標(biāo)物質(zhì)的測定方法中，可以抑制對測定結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響的反應(yīng)的改良方法。該改良方法包括：準(zhǔn)備含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液、第一反應(yīng)液、和第二反應(yīng)液；使用具有分注裝置的測定裝置，將檢樣溶液和第一反應(yīng)液依次吸取到分注裝置中；然后通過由分注裝置中一并噴出，與第二反應(yīng)液接觸，使在第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液的至少一方中含有的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴與目標(biāo)物質(zhì)形成復(fù)合物；對形成的復(fù)合物進(jìn)行分析。上述改良方法中，檢樣溶液的比重與第一反應(yīng)液的比重不同，在檢樣溶液與第一反應(yīng)液疊層的狀態(tài)下被吸取到分注裝置中。
【專利說明】全血檢樣的免疫測定方法和測定試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以存在于檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)(微量成分等)為對象的測定方法和試劑盒。特別涉及以存在于全血檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)(微量成分等)為對象的免疫學(xué)分析方法和免疫學(xué)分析試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]作為存在于生物體試樣中的目標(biāo)物質(zhì)(微量成分等)的測定方法，大多采用利用抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)測定方法，已知有放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等。近年來，樣品大多采用血清、血漿，但由于前處理繁瑣，人們希望采用直接測定全血的方法。但是，全血檢樣中除了作為測定對象的微量成分等之外，還較多含有雜質(zhì)(目標(biāo)外物質(zhì))等，因此大多不能夠與使用血清檢樣或血漿檢樣的條件同樣地進(jìn)行。另外，為了提高反應(yīng)精度，如專利文獻(xiàn)I中的報(bào)道，通過在反應(yīng)中存在反應(yīng)抑制劑(可與固定于固相或標(biāo)記物上的抗體競爭的、游離的抗體或其抗體片段)，可以避免前帶等。這種情況下，在一個(gè)測定中混合存在多個(gè)反應(yīng)物質(zhì)，難以構(gòu)建測定系統(tǒng)。
[0003]另外，作為可簡便地試驗(yàn)多個(gè)檢樣的手段，已知有各種全自動(dòng)免疫測定裝置，例如可舉出如專利文獻(xiàn)2所示的可同時(shí)測定多個(gè)的全自動(dòng)測定裝置。記載了:該全自動(dòng)測定裝置是將含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣分注到盒(力一卜U 〃 ^ )中，該盒具有將規(guī)定量的檢樣稀釋為所需倍率的稀釋槽(希釈々工 >)、使檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)與可與其特異性反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)槽、以及含有反應(yīng)成分等的容納槽，在該盒上，將檢樣稀釋至所需倍數(shù)，使稀釋的檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)與可與其特異性反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，測定反應(yīng)產(chǎn)物的量，由此可以簡便地測定檢樣中所含的、稀釋倍率不同的多種目標(biāo)物質(zhì)。還記載了:該全自動(dòng)測定裝置具有吸取、噴出機(jī)構(gòu)，利用該機(jī)構(gòu)進(jìn)行分注操作，進(jìn)行測定。
[0004]另一方面，作為以`全血檢樣為對象的測定方法，如專利文獻(xiàn)3中公開了:為了避免全血檢樣中所含的成分的影響而使其含有表面活性劑的方法等。
[0005]但是，使用上述分注裝置如全自動(dòng)測定裝置那樣依次分注各反應(yīng)試劑等進(jìn)行反應(yīng)的測定方法中，同一檢樣的血漿和全血的值發(fā)生偏離，這種情況尚不被了解，人們對改善這樣問題的方法也未有解決方案。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:日本特開2004-191332號公報(bào)；
專利文獻(xiàn)2:W02001/084152號公開小冊子；
專利文獻(xiàn)3:W02002/073203號公開小冊子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明所要解決的問題
如在后述實(shí)施例中進(jìn)行的具體說明，本發(fā)明人在使用含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣或其處理液(以下稱為檢樣溶液)；在正式反應(yīng)中形成的、形成與目標(biāo)物質(zhì)的免疫復(fù)合物、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴[例如抗體(第一反應(yīng)液中含有用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，第二反應(yīng)液中含有固定于磁性顆粒上的抗體)];可抑制上述免疫復(fù)合物的形成、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的游離抗體(添加到第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液中)的目標(biāo)物質(zhì)的測定方法中，在以全血檢樣為對象用具有分注裝置的全自動(dòng)酶聯(lián)免疫測定裝置進(jìn)行測定時(shí)發(fā)現(xiàn):在使用該分注裝置吸取含目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液、接著吸取第一反應(yīng)液時(shí)，在正式反應(yīng)中作為抑制免疫復(fù)合物的形成的反應(yīng)抑制劑而發(fā)生反應(yīng)的抗體是在正式反應(yīng)之前與全血檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，因此，同一檢樣的血漿檢樣與全血檢樣的值發(fā)生偏離。
[0008]本發(fā)明針對該問題而設(shè)，其目的在于提供一種測定方法和試劑盒，它是使用具有分注裝置的測定裝置，含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣、和與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴實(shí)質(zhì)上在正式反應(yīng)時(shí)才開始反應(yīng)，從而抑制對測定結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響的反應(yīng)的測定方法和試劑盒。
[0009]用于解決問題的方法
本發(fā)明人針對上述狀況反復(fù)進(jìn)行深入探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在使用具有分注裝置的測定裝置，使用含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液、第一反應(yīng)液、和第二反應(yīng)液的目標(biāo)物質(zhì)的測定方法中，使第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液的至少一方中含有在正式反應(yīng)中形成的、形成與目標(biāo)物質(zhì)的免疫復(fù)合物、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴，通過采用特征在于:在分注裝置內(nèi)的流路中，含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液、和第一反應(yīng)液以不同的比重存在的方法，可以抑制正式反應(yīng)前不需要的反應(yīng)的進(jìn)行，同一檢樣的血漿檢樣和全血檢樣的值不發(fā)生偏離。本發(fā)明基于該認(rèn)識而設(shè)，從而完成了使用任何檢樣均可簡便且準(zhǔn)確地測定檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)的方法。
[0010]即，本發(fā)明涉及以下的發(fā)明。
[0011][I]目標(biāo)物質(zhì)的測定方法，該測定方法是:
準(zhǔn)備可能含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣或其處理液、第一反應(yīng)液、和第二反應(yīng)液；
使用具有分注裝置的測定裝置，將上述檢樣或其處理液、和上述第一反應(yīng)液按照該順序或相反順序依次吸取到分注裝置中；
然后由分注裝置中一并噴出，與上述第二反應(yīng)液接觸，形成第一伙伴與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物，該第一伙伴含在第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液的至少一方中、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)；對形成的上述復(fù)合物或來自該復(fù)合物的信號進(jìn)行分析，
上述目標(biāo)物質(zhì)的測定方法的特征在于:上述檢樣或其處理液的比重與上述第一反應(yīng)液的比重不同；
在檢樣或其處理液與第一反應(yīng)液疊層的狀態(tài)下被吸取到分注裝置中。
[0012][2] [I]的方法，其中，檢樣為全血。
[0013][3] [I]或[2]的方法，其中，第一反應(yīng)液的比重比檢樣或其處理液的比重大，將檢樣或其處理液、和第一反應(yīng)液按照該順序吸取到分注裝置中。
[0014][4] [I]~[3]中任一項(xiàng)的方法，其中，第一反應(yīng)液含有選自多元醇類、糖醇類和糖類的至少一種物質(zhì)。
[0015][5] [4]的方法，其中，第一反應(yīng)液含有選自乙二醇、丙二醇、二甘醇、甘油、戊糖、己糖、丙糖、丁糖、庚糖、蔗糖、海藻糖、異海藻糖、曲二糖、槐糖、黑曲霉二糖、昆布二糖、麥芽糖、纖維二糖、異麥芽糖、龍膽二糖、乳糖、松二糖、麥芽酮糖、帕拉金糖(異麥芽酮糖)、異龍膽二糖(欠'>子才匕'々口一7)、甘露二糖、蜜二糖、異蜜二糖(^丨J匕' 々口一 ^ )、異乳糖、半乳鹿糖海蔥二糖蕓香糖、蕓香二糖木二糖、Primellose ( I) ^ π — 7 )、低聚糖類、棉子糖、松三糖和麥芽三糖的至少一種物質(zhì)。
[0016][6] [4]或[5]的方法，其中，[4]或[5]的物質(zhì)的總量是以10%以上且30%以下
含在第一反應(yīng)液中。
[0017][7] [I]~[6]中任一項(xiàng)的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴是抗體或抗原。
[0018][8] [I]~[7]中任一項(xiàng)的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴含在第一反應(yīng)液中，識別與第一伙伴不同的區(qū)域、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴含在第二反應(yīng)液中。 [0019][9] [8]的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴和第二伙伴是用標(biāo)記物標(biāo)記的伙伴或固定于固相載體上的伙伴。
[0020][10] [9]的方法，其中，第一反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴是用標(biāo)記物標(biāo)記的伙伴，第二反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴是固定在固相載體上的伙伴。
[0021][11] [I]~[10]中任一項(xiàng)的方法，其中，在第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液的至少一方中含有抑制與目標(biāo)物質(zhì)形成復(fù)合物、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴。
[0022][12] [11]的方法，其中，第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液中含有與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的上述第三伙伴。
[0023][13] [11]或[12]的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴是抗體或抗原。
[0024][14] [I]~[13]中任一項(xiàng)的方法，其中，分注裝置是吸頭。
[0025][15]目標(biāo)物質(zhì)的測定試劑盒，該目標(biāo)物質(zhì)的測定試劑盒含有第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液的至少一方中含有與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴，在具有分注裝置的測定裝置中使用，上述測定裝置是實(shí)施以下步驟的裝置:將檢樣或其處理液和上述第一反應(yīng)液按照該順序或相反順序依次吸取到分注裝置內(nèi)，上述檢樣或其處理液的比重與上述第一反應(yīng)液的比重不同。
[0026][16] [15]的測定試劑盒，其中，第一反應(yīng)液的比重比檢樣或其處理液的比重大。
[0027]以下，在本說明書中，“第一伙伴”和“第二伙伴”以在正式反應(yīng)中形成的、形成與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的物質(zhì)的含義使用，“第三伙伴”以在正式反應(yīng)中形成的、抑制與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物的形成、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的物質(zhì)的含義使用。
[0028]發(fā)明效果
通過使用本發(fā)明的方法，即使使用任何檢樣均可以簡便且準(zhǔn)確地測定檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)。特別是在使用具有與其它檢樣不同性質(zhì)的全血檢樣時(shí)，通常也不會與作為比較對象的血清檢樣或血漿檢樣的值發(fā)生偏離，可測定目標(biāo)物質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是模式表示將全血(檢樣溶液，92)和第一反應(yīng)液(標(biāo)記抗體溶液，93)吸取到作為分注裝置的吸頭(91)內(nèi)時(shí)，吸頭內(nèi)各溶液狀態(tài)的說明圖。(a)是第一反應(yīng)液不含有糖的情況，(b)是第一反應(yīng)液含有糖的情況； 圖2是模式表示實(shí)施例中使用的盒的平面圖；
圖3是表示第一試劑(標(biāo)記抗體試劑)中不含有糖(蔗糖)時(shí)得到的全血測定值和血漿測定值的相關(guān)性的圖表；
圖4是表示圖3所示的不含有糖時(shí)得到的全血測定值與血漿測定值之比的圖表；
圖5是表示第一試劑(標(biāo)記抗體試劑)中含有15%蔗糖時(shí)得到的全血測定值和血漿測定值的相關(guān)性的圖表；
圖6是表示圖5所示的含有15%蔗糖時(shí)得到的全血測定值和血漿測定值之比的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0030]1.自動(dòng)測定裝置和測定法
本發(fā)明的方法只要是具有分注機(jī)構(gòu)的自動(dòng)測定裝置以及測定法即可，均可使用。分注機(jī)構(gòu)可以是如日本特表平09-503060號那樣的按照隨機(jī)訪問進(jìn)行的方法，也可以是如W02001/084152號那樣的同一操作的方法。測定方法可以采用公知的免疫學(xué)測定方法，可舉出化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)或免疫比濁測定法等。化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)可以以酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)的形式使用。為了進(jìn)行高靈敏度的分析方法，常使用夾層ELISA法。
[0031]以下記載了可用于本發(fā)明的測定方法和試劑盒的公知的自動(dòng)測定裝置和測定法的一個(gè)方案，但并不限于此。
[0032]測定用的自動(dòng)測定裝置至少具備容納測定用盒的盒容納部、向容納于盒容納部中的盒中分注試劑和/或檢樣的分注部、以及測定容納于盒容納部中的盒上的反應(yīng)產(chǎn)物的測定部。盒容納部除了制成可容納測定用盒的結(jié)構(gòu)之外，可以與常規(guī)的盒容納部同樣。
[0033]上述分注部是根據(jù)試劑和/或檢樣的種類或性狀，由液體吸取、噴出機(jī)構(gòu)等常規(guī)的機(jī)構(gòu)構(gòu)成。這里，分注包含將試劑和/或檢樣從盒外轉(zhuǎn)移至盒的槽中、以及將試劑和/或檢樣從盒上的一個(gè)槽中轉(zhuǎn)移到另外的槽中兩種情況。
[0034]上述測定部根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的種類或性狀，由測光機(jī)構(gòu)等常規(guī)機(jī)構(gòu)構(gòu)成。
[0035]上述測定用的盒例如可以是將槽組并列設(shè)成兩排以上形成的盒，或者將槽組配置成I排的單數(shù)的盒，或者使用多個(gè)這些盒。使用多個(gè)盒進(jìn)行測定時(shí)，通過并列設(shè)置了多個(gè)進(jìn)行一系列免疫反應(yīng)的機(jī)構(gòu)的裝置，形成具有同時(shí)并行驅(qū)動(dòng)控制檢樣的分注、檢樣的稀釋、試劑的分注、B/F分離和測光等步驟的機(jī)構(gòu)。這樣，采用免疫測定法時(shí)，使用只進(jìn)行單一樣式的分析步驟的裝置，即使分析項(xiàng)目不同也不會使測定所需時(shí)間增加較多，可以同時(shí)測定多個(gè)項(xiàng)目。
[0036]另外，測定用盒具有:分注檢樣的分注槽；將規(guī)定量的檢樣稀釋為所需倍率的稀釋槽；使檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)和與其特異性反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)槽；與反應(yīng)槽對應(yīng)的、用于B/F分離的洗滌槽；用于容納檢樣中所含目標(biāo)物質(zhì)測定所必需的試劑的試劑容納槽；用于測定反應(yīng)產(chǎn)物的量的測定槽等。為了進(jìn)行光學(xué)測定，測定槽可使用測光槽。另外，無需在同一測定用盒上配置所有上述的槽，可結(jié)合所使用的裝置選擇。例如檢樣中所含的目標(biāo)物質(zhì)測定所必需的試劑可以容納于另外的試劑供給盒中。另外，各槽并不是只用于其目的，例如分注槽可兼做稀釋槽，試劑容納槽可兼做反應(yīng)槽。各槽的數(shù)目可適當(dāng)配置。
[0037]反應(yīng)槽中可以容納與反應(yīng)相關(guān)的試劑的一部分。試劑容納槽或反應(yīng)槽中容納的試劑可以是一種，只要容納的試劑之間不反應(yīng)，也可以是多種。所容納的試劑可以是液狀(例如溶液或懸浮液)，如果可溶解或懸浮于注入到槽中的液體，也可以是固體狀。
[0038]在填充了稀釋液、標(biāo)記物、洗滌液等試劑和/或溶液等時(shí)，為了避免雜質(zhì)的混入或試劑等的蒸發(fā)、劣化，測定用盒優(yōu)選將其上部用鋁箔、塑料薄膜等密封。特別是鋁箔的密封可以通過自動(dòng)測定裝置的穿孔機(jī)構(gòu)自動(dòng)且簡便地開封，因此優(yōu)選。另外，將試劑和或溶液等填充于另外的盒中，將其結(jié)合使用進(jìn)行測定時(shí)，優(yōu)選該盒也密封。
[0039]可在測定用盒上通過印刷、粘貼等附上與檢樣相關(guān)的信息、與分析項(xiàng)目相關(guān)的信息、以及記錄試劑管理信息等的條形碼。通過在盒上附上這樣的條形碼，如果使用可識別盒的條形碼、分析項(xiàng)目可自動(dòng)選擇的自動(dòng)測定裝置，則測定者通過只選擇盒，使用一臺測定裝置即可以簡便且高效率地測定任意的分析項(xiàng)目。另外，無需進(jìn)行如以往的常規(guī)自動(dòng)測定裝置所進(jìn)行的、成為分析項(xiàng)目的誤設(shè)定的很大的原因的工作表操作，沒有失敗，可以簡便地進(jìn)行多種分析項(xiàng)目的測定。并且試劑的保管等也簡便。
[0040]組裝測定用盒而使用的自動(dòng)測定裝置中，從一個(gè)槽中吸取規(guī)定量的液體并噴出到另外的槽中的裝置；將槽中內(nèi)容物進(jìn)行攪拌的裝置；進(jìn)行B/F分離的裝置；測定反應(yīng)產(chǎn)物或標(biāo)記物的量的裝置；由反應(yīng)產(chǎn)物或標(biāo)記物的量的測定結(jié)果計(jì)算目標(biāo)物質(zhì)的量的裝置；調(diào)節(jié)盒的溫度的裝置；識別條形碼的裝置；進(jìn)行多個(gè)盒同時(shí)測定的裝置等可以使用公知的裝置。
[0041]關(guān)于優(yōu)選方案的一個(gè)例子，以下以使用免疫測定法、更具體地說是使用化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)進(jìn)行測定的情形為例進(jìn)行說明。
[0042]優(yōu)選方案的盒是組裝到對存在于檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行自動(dòng)定量的自動(dòng)測定裝置中而使用的自動(dòng)測定用盒，具有:使目標(biāo)物質(zhì)、和與其免疫學(xué)特異性反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)槽、用于填充反應(yīng)中使用的試劑的多個(gè)試劑容納槽、分注檢樣的分注槽、進(jìn)行檢樣稀釋的稀釋槽、用于進(jìn)行B/F分離的洗滌槽和/或測光槽。如上所述，試劑容納槽可以兼做反應(yīng)槽。優(yōu)選在稀釋槽中填充可將規(guī)定量的檢樣稀釋為所需倍率的量的稀釋液，在多個(gè)試劑容納槽中分別填充用于進(jìn)行免疫學(xué)特異性反應(yīng)的固相載體、標(biāo)記的抗原或抗體、用于進(jìn)行標(biāo)記物量的測定的試劑等，在洗滌槽中填充用于洗滌免疫復(fù)合物的洗滌液來使用。在盒的試劑容納槽中例如加入結(jié)合抗原或抗體的固相載體(致敏固相)，可兼做反應(yīng)槽。
[0043]固相載體可舉出以往在免疫測定中使用的聚苯乙烯珠、磁性顆粒、膠乳等。并且可以不將固相載體加入到槽中，而在槽內(nèi)壁使抗體或抗原形成固相使用。
[0044]作為本方案中使用的免疫測定法，從靈敏度方面考慮，優(yōu)選有利的化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)，固相載體優(yōu)選磁性顆粒，該磁性顆粒使得化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)中必須進(jìn)行的B/F分離可通過磁鐵簡便地進(jìn)行。該B/F分離可用永久磁鐵、電磁鐵等，由盒外部施加磁場來進(jìn)行，還可以如日本特開平11-262678號公報(bào)中所示，通過排列于分注系統(tǒng)的移液管吸頭等的吸取、噴出系統(tǒng)一側(cè)的磁鐵進(jìn)行。
[0045]另外，在其它的試劑容納槽中加入標(biāo)記的抗原或抗體，可兼做反應(yīng)槽。標(biāo)記物例如可舉出:酶、放射性同位素、顯色物質(zhì)、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、各種著色顆粒，在化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)中，優(yōu)選使用酶。上述標(biāo)記酶的例子可舉出:堿性磷酸酶、過氧化物酶、半乳糖苷酶、葡糖氧化酶等。標(biāo)記酶的底物可以使用與各酶對應(yīng)的底物，例如堿性磷酸酶可使用金剛烷基甲氧基苯基磷?；蹼s環(huán)丁烷(AMPPD)或⑶P-Star (注冊商標(biāo))，過氧化物酶可使用魯米諾/過氧化物，半乳糖苷酶可使用金剛烷基甲氧基苯基β -D-半乳糖基二氧雜環(huán)丁烷(AMP⑶)。
[0046]標(biāo)記物的測定例如在化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法中，可將免疫復(fù)合物與標(biāo)記酶的底物混合，然后由測光槽直接或通過光電倍增管等進(jìn)行。采用酶聯(lián)免疫法時(shí)，在與酶底物液混合后，可由測光槽的底部或側(cè)部照射測定波長的測定光，通過測定透過測光槽的透射光來進(jìn)行。
[0047]作為分注部，優(yōu)選分注裝置內(nèi)的流路即與試劑和/或檢樣接觸的部分可更換。分注裝置可舉出可容易地吸取、噴出試劑或檢樣的先端變細(xì)的形態(tài)，具體可舉出吸頭等。通過每次測定時(shí)更換該部分，可以容易地防止對后面測定所使用的盒的污染，因此優(yōu)選。
[0048]2.本發(fā)明的測定法
本發(fā)明的測定法可參照公知的自動(dòng)分析裝置或測定法進(jìn)行。以下對于本發(fā)明的主要特征進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0049]本發(fā)明的測定法基于以下思想:在使用具有分注裝置的測定裝置時(shí)，使含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液、和與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴實(shí)質(zhì)上在正式反應(yīng)時(shí)才可以開始反應(yīng)，來抑制對測定結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響的反應(yīng)。
[0050]具體來說，在使用具有分注裝置的測定裝置，使用含目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液、第一反應(yīng)液、和第二反應(yīng)液的目標(biāo)物質(zhì)的測定方法中，在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液的至少一方中含有在正式反應(yīng)中形成的、形成與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴，在分注裝置的流路中，使含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液和第一反應(yīng)液以不同的比重存在。
[0051]采用常規(guī)自動(dòng)分析裝置時(shí)，首先大多是吸取檢樣。即，進(jìn)行通過分注裝置(例如，吸頭)吸取含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液的第一步驟，接著進(jìn)行用該分注裝置吸取第一反應(yīng)液的第二步驟。這種情況下，如圖1(a)所示，如果檢樣溶液(92)比第一反應(yīng)液(93)的比重重，例如檢樣溶液轉(zhuǎn)至吸頭(91)的壁部，下沉，檢樣溶液與第一反應(yīng)液的接觸面增大，不希望的反應(yīng)在正式反應(yīng)之前即進(jìn)行。調(diào)節(jié)檢樣和第一反應(yīng)液哪一個(gè)的比重，這可以適當(dāng)選擇，不過使比重增加較為容易，因此，優(yōu)選使第一反應(yīng)液的比重增加。通過使第一反應(yīng)液的比重比檢樣溶液重，在分注裝置的流路中，可使第一反應(yīng)液以實(shí)質(zhì)上不混合的狀態(tài)疊層于檢樣溶液的下層，不希望進(jìn)行的反應(yīng)可以在正式反應(yīng)之前進(jìn)行，因此優(yōu)選。
[0052]本發(fā)明的檢樣只要是含有目標(biāo)物質(zhì)或有含有目標(biāo)物質(zhì)可能性的檢樣即可，例如可舉出全血、血清、血漿、尿等。
[0053]特別是檢樣為全血時(shí)，檢樣溶液的比重通常比常規(guī)反應(yīng)液的大，因此大多引發(fā)對測定有影響的、不希望出現(xiàn)的反應(yīng)。因此，增加第一反應(yīng)液的比重，這在全血檢樣時(shí)特別優(yōu)選。另外，血清檢樣或血漿檢樣等通常與常規(guī)的稀釋液是同等程度的比重，因此有些場合對測定沒有影響，但實(shí)施高靈敏度、高精度的測定時(shí)可能出現(xiàn)問題，因此對于全血檢樣以外的檢樣，優(yōu)選使第一反應(yīng)液的比重比檢樣溶液重。還有很多情況是同時(shí)測定各種種類的檢樣，因此優(yōu)選使第一反應(yīng)液的比重比檢樣溶液重。
[0054]例如，相對于全血檢樣溶液的比重，第一反應(yīng)液的比重可以有0.05%?10%的不同，優(yōu)選有0.1%?7.5%、更優(yōu)選0.1%?3%的不同。比重的測定可以通過公知的比重計(jì)等容易地測定。
[0055]只要可制成檢樣溶液與第一反應(yīng)液不同的比重即可，可以使用任何物質(zhì)，但必須是檢樣與第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液中所含的成分在正式反應(yīng)時(shí)同時(shí)混合，且選擇對測定沒有負(fù)面影響的物質(zhì)。例如優(yōu)選不破壞血細(xì)胞成分的物質(zhì)。具體來說可舉出:多元醇類、糖醇類、糖類。多元醇類可舉出:乙二醇、丙二醇、二甘醇，糖醇類可舉出甘油。糖類不會對各種檢樣或反應(yīng)液的成分有影響，還可提高比重，因此特別優(yōu)選。糖類可舉出單糖類、二糖類、三糖類。單糖類的例子有:戊糖、己糖、丙糖、丁糖、庚糖，二糖類的例子有:蔗糖、海藻糖、異海藻糖、曲二糖、槐糖、黑曲霉二糖、昆布二糖、麥芽糖、纖維二糖、異麥芽糖、龍膽二糖、乳糖、松二糖、麥芽酮糖、帕拉金糖(異麥芽酮糖)、異龍膽二糖(y > +才Ii々口一 7 )、甘露二糖、蜜二糖、異蜜二糖(^ U Ii々口一 7 )、異乳糖、半乳蔗糖海蔥二糖蕓香糖、蕓香二糖木二糖、Primellose ( I) ^ π — ；),三糖類的例子有:低聚糖類、棉子糖、松三糖、麥芽三糖。其中優(yōu)選二糖類、三糖類，可特別優(yōu)選使用蔗糖。另外，適合的使用濃度可以結(jié)合各種物質(zhì)的性質(zhì)適當(dāng)設(shè)定，例如第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液中它們的總量為10%以上~30%以下，優(yōu)選10%以上~20%以下，更優(yōu)選10%以上~15%以下。或者，在另一方案中，優(yōu)選15%以上且30%以下。
[0056]測定的順序包含:通過分注裝置吸取含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液的第一步驟；進(jìn)一步通過分注裝置吸取第一反應(yīng)液的第二步驟；將上述檢樣溶液和上述第一反應(yīng)液噴出到反應(yīng)槽中，使其與第二反應(yīng)液反應(yīng)的第三步驟；以及測定反應(yīng)產(chǎn)物的量的第四步驟。第一步驟之前也可以包含:將含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣分注到分注槽中的步驟、或?qū)z樣用稀釋槽進(jìn)行稀釋的步驟等。在第三步驟和第四步驟之間還可以進(jìn)一步包含:將結(jié)合有與目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的復(fù)合物進(jìn)行B/F分離的步驟等。
[0057]檢樣的稀釋倍率和填充于稀釋槽中的稀釋液可根據(jù)檢樣、目標(biāo)物質(zhì)、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的物質(zhì)等的種類適當(dāng)選擇。稀釋液可以含有檢樣前處理所需的試劑，這種情況下，稀釋槽中，稀釋和前處理同時(shí)進(jìn)行。
[0058]檢樣的前處理所需的試劑可舉出:酸、堿、有機(jī)溶劑、蛋白質(zhì)改性劑、表面活性劑等。通過添加這些試劑，也可以在檢樣稀釋步驟中進(jìn)行檢樣的前處理。使用全血作為檢樣時(shí)，全血中大量含有夾雜物等，因此優(yōu)選通過添加任意的表面活性劑等進(jìn)行前處理。這樣，通過同時(shí)進(jìn)行檢樣的稀釋和前處理，在使用全血等作為檢樣時(shí)也可以進(jìn)行簡便且精度高的測定，例如可適用于緊急檢查或由醫(yī)生、護(hù)士進(jìn)行的即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)等。
[0059]本發(fā)明的檢樣溶液是指采集自患者的檢樣其本身、或者采集自患者的檢樣用上述稀釋液進(jìn)行稀釋和/或前處理的、經(jīng)制備的檢樣溶液。
[0060]本發(fā)明的目標(biāo)物質(zhì)沒有特別限定，只要是存在與該目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴即可。例如，目標(biāo)物質(zhì)和與其特異性反應(yīng)的伙伴的組合可舉出:抗原和抗體、抗體和抗原、糖鏈和凝集素等。這樣，本發(fā)明中的“特異性反應(yīng)”是指生化學(xué)特異性結(jié)合，如底物那樣，目標(biāo)物質(zhì)以及特異性反應(yīng)的伙伴在其結(jié)合前后，物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)可以發(fā)生變化。
[0061]使目標(biāo)物質(zhì)和與其特異性反應(yīng)的伙伴進(jìn)行反應(yīng)的步驟、以及測定反應(yīng)產(chǎn)物的量的步驟的條件等可以根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)和與其特異性反應(yīng)的伙伴的組合來適當(dāng)選擇。例如，酶與底物的反應(yīng)以及反應(yīng)產(chǎn)物的量的測定可以通過將酶與底物混合，使酶與底物作用，測定反應(yīng)產(chǎn)物(底物的分解物)的量來進(jìn)行。另外，抗體與抗原的反應(yīng)以及反應(yīng)產(chǎn)物的量的測定可以是將抗體或抗原和與其對應(yīng)的結(jié)合有抗體或抗原的固相載體和標(biāo)記物混合，形成反應(yīng)產(chǎn)物(免疫復(fù)合物)，通過洗滌，從免疫復(fù)合物中除去未反應(yīng)的抗體或抗原以及標(biāo)記物(B/F分離)，通過免疫復(fù)合物的形成來測定與固相結(jié)合的標(biāo)記物的量。這樣，本發(fā)明中，“測定反應(yīng)產(chǎn)物的量”不僅是直接測定反應(yīng)產(chǎn)物本身的量，也包含測定與反應(yīng)產(chǎn)物的量的定量相關(guān)的物質(zhì)的量或信號。可由這樣測定的反應(yīng)產(chǎn)物的量計(jì)算檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)的量。
[0062]需要說明的是，復(fù)合物通常是指目標(biāo)物質(zhì)與特異性反應(yīng)的伙伴的結(jié)合而得到的產(chǎn)物。
[0063]本發(fā)明中，優(yōu)選目標(biāo)物質(zhì)與特異性反應(yīng)的伙伴的反應(yīng)為免疫學(xué)反應(yīng)。即，優(yōu)選與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性反應(yīng)的伙伴是抗體或抗原。免疫學(xué)反應(yīng)優(yōu)選為以下的反應(yīng):使檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)與免疫學(xué)特異性反應(yīng)的第一伙伴反應(yīng)，形成第一免疫復(fù)合物，使第一免疫復(fù)合物和與其免疫學(xué)特異性反應(yīng)的標(biāo)記的第二伙伴進(jìn)行反應(yīng)，形成第二免疫復(fù)合物。進(jìn)一步優(yōu)選目標(biāo)物質(zhì)為抗原，特異性反應(yīng)的伙伴為抗體。
[0064]S卩，本發(fā)明的與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴(優(yōu)選第一伙伴和第二伙伴的組合)是指構(gòu)成復(fù)合物的物質(zhì)，該復(fù)合物產(chǎn)生作為上述目標(biāo)物質(zhì)的量測定的信號。
[0065]本發(fā)明中的正式反應(yīng)是指目標(biāo)物質(zhì)、和與該目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物的反應(yīng)。即，是指目標(biāo)物質(zhì)和構(gòu)成復(fù)合物的物質(zhì)的反應(yīng)，該復(fù)合物產(chǎn)生作為目標(biāo)物質(zhì)的量測定的信號。
[0066]實(shí)質(zhì)上在正式反應(yīng)時(shí)才開始反應(yīng)是指在對測定結(jié)果沒有負(fù)面影響的程度下，在正式反應(yīng)前，與該正式反應(yīng)相關(guān)的物質(zhì)存在于測定系統(tǒng)中，在正式反應(yīng)開始時(shí)，與該正式反應(yīng)相關(guān)的物質(zhì)相遇，由此開始正式反應(yīng)。
[0067]本發(fā)明的反應(yīng)液是與目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的溶液，反應(yīng)液中可以含有正式反應(yīng)所需的物質(zhì)。本發(fā)明的反應(yīng)液至少使用2種以上。
[0068]與本發(fā)明的目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴只要包含在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液的至少一方中即可。在使用一種伙伴的情況下特別優(yōu)選。例如可舉出使用I種抗體的膠乳聚集法的情形等。
[0069]與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴也可以包含在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液中。在使用2種以上的伙伴、S卩，使用第一伙伴和第二伙伴的組合時(shí)特別優(yōu)選。并且，第一反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴和第二反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴可以是與目標(biāo)物質(zhì)的不同區(qū)域反應(yīng)的物質(zhì)。例如，可以舉出使用2種以上抗體的夾層ELISA法的情形等。
[0070]與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的伙伴可以是用標(biāo)記物標(biāo)記的伙伴或固定于固相載體上的伙伴。例如可舉出:將I種抗體固定在膠乳上使用的膠乳聚集法的情形等。
[0071]第一反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴可以是用標(biāo)記物標(biāo)記的伙伴，第二反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴可以是固定于固相載體上的伙伴。例如可舉出:將一方的抗體固定于磁性顆粒上、將另一方的抗體用標(biāo)記物標(biāo)記的夾層ELISA法的情形等。
[0072]本發(fā)明的與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴是指抑制復(fù)合物形成的物質(zhì)，該復(fù)合物產(chǎn)生作為上述目標(biāo)物質(zhì)的量測定的信號。只要是抑制該復(fù)合物的形成、但并不是構(gòu)成該復(fù)合物的物質(zhì)即可，可以是任何物質(zhì)。例如目標(biāo)物質(zhì)為抗原、第一和/或第二伙伴為抗體時(shí)，可舉出:競爭性抑制該抗原與該抗體結(jié)合的物質(zhì)。競爭性抑制該抗原與該抗體結(jié)合的物質(zhì)可舉出:與該抗體實(shí)質(zhì)上具有相同表位的抗體。[0073]具體來說，準(zhǔn)備與某種抗原具有同一表位的抗體，其中一方固定于磁性顆粒(與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴)上，另一方為游離的抗體(與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴)的形式，進(jìn)一步準(zhǔn)備進(jìn)行了檢測用標(biāo)記的、與上述表位不同的抗體(與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴)，將它們與某種抗原一起供給正式反應(yīng)時(shí)，被固定的抗體和游離抗體發(fā)生競爭反應(yīng)，在最佳測定條件下，固定的抗體與該抗原結(jié)合，標(biāo)記抗體也進(jìn)一步結(jié)合，形成了適合反映目標(biāo)物質(zhì)的量的該被固定的抗體與該抗原和該標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物。
[0074]使用抑制上述復(fù)合物形成的第三伙伴的測定法中，正式反應(yīng)時(shí)，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一和/或第二伙伴以及與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴可以同時(shí)與目標(biāo)物質(zhì)開始反應(yīng)，由此目標(biāo)物質(zhì)的測定精度提高，因此特別優(yōu)選。
[0075]具體來說,第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液的至少一方中可以含有第三伙伴，該第三伙伴抑制在正式反應(yīng)中形成的、與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物的形成，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)。另外，第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液中也可以含有第三伙伴，該第三伙伴抑制在正式反應(yīng)中形成的、與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物的形成，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)。
[0076]使用密封的盒等時(shí)，由于裝置的運(yùn)動(dòng)或者吸頭可破壞密封的沖擊等，有發(fā)生內(nèi)容物飛散或吸取不良，而無法準(zhǔn)確吸取反應(yīng)液的情形。因此，在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液兩方中含有抑制正式反應(yīng)中形成的、與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物的形成、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴，這可以使正式反應(yīng)時(shí)不會發(fā)生大的組成變化，因此優(yōu)選。
[0077]3.本發(fā)明的試劑盒
本發(fā)明的試劑盒可以用于本發(fā)明的測定方法。具體來說，含有與含目標(biāo)物質(zhì)的檢樣溶液的比重不同的第一反應(yīng)液、和第二反應(yīng)液，在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液的至少一方中含有與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴。優(yōu)選上述第一反應(yīng)液比上述檢樣溶液的比重重。
[0078]4.本發(fā)明的方案舉例
本發(fā)明的第一方案可舉出抗原的免疫學(xué)比濁測定方法，該方法是使用具有分注裝置的測定裝置，使用含目標(biāo)物質(zhì)(抗原)的全血檢樣溶液；第一反應(yīng)液；含有固定于膠乳上的、與抗原特異性反應(yīng)的抗體的第二反應(yīng)液。具體來說，可進(jìn)行將該檢樣溶液用分注裝置吸取的第一步驟，接著進(jìn)行將該第一反應(yīng)液用該分注裝置吸取的第二步驟，使該第一反應(yīng)液疊層于該檢樣溶液的下層，然后，將用該分注裝置吸取的該檢樣溶液和該第一反應(yīng)液噴出到該第二反應(yīng)液中，進(jìn)行正式反應(yīng)，然后光學(xué)測定膠乳的聚集，從而測定抗原量。
[0079]本發(fā)明的第二方案可舉出抗原的免疫學(xué)比濁測定法，該方法是使用具有分注裝置的測定裝置，使用含目標(biāo)物質(zhì)(抗原)的全血檢樣溶液；含有抑制在正式反應(yīng)的免疫復(fù)合物的生成、與抗原特異性反應(yīng)的游離的抗體的第一反應(yīng)液；和含有固定于膠乳上的、與抗原特異性反應(yīng)的抗體的第二反應(yīng)液。具體來說，可進(jìn)行將該檢樣溶液用分注裝置吸取的第一步驟，接著進(jìn)行將該第一反應(yīng)液用該分注裝置吸取的第二步驟，使該第一反應(yīng)液疊加于該檢樣溶液的下層，然后，將用該分注裝置吸取的該檢樣溶液和該第一反應(yīng)液噴出到該第二反應(yīng)液中，進(jìn)行正式反應(yīng)，然后光學(xué)測定膠乳的聚集，從而測定抗原的量。正式反應(yīng)中，固定抗體和游離抗體與抗原發(fā)生競爭反應(yīng)。
[0080]本發(fā)明的第三方案可舉出抗原的夾層ELISA法，該方法是使用具有分注裝置的測定裝置，使用含目標(biāo)物質(zhì)(抗原)的全血檢樣溶液；含有用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體的第一反應(yīng)液；和含固定于磁性顆粒上、與抗原特異性反應(yīng)的抗體的第二反應(yīng)液。具體來說，可進(jìn)行將該檢樣溶液用分注裝置吸取的第一工序，接著進(jìn)行將該第一反應(yīng)液用該分注裝置吸取的第二工序，使該第一反應(yīng)液疊層于該檢樣溶液的下層，然后，將用該分注裝置吸取的該檢樣溶液和該第一反應(yīng)液噴出到該第二反應(yīng)液中，進(jìn)行正式反應(yīng)，然后添加含有底物溶液的第三反應(yīng)液，測定發(fā)光量，從而測定抗原的量。
[0081]本發(fā)明的第四方案可舉出抗原的夾層ELISA法，該方法是使用具有分注裝置的測定裝置，使用含目標(biāo)物質(zhì)(抗原)的全血檢樣溶液；含有用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體、和抑制正式反應(yīng)中的免疫復(fù)合物的生成、與抗原特異性反應(yīng)的游離的抗體的第一反應(yīng)液；和含固定于磁性顆粒上、與抗原特異性反應(yīng)的抗體的第二反應(yīng)液。具體來說，可進(jìn)行將該檢樣溶液用分注裝置吸取的第一工序，接著進(jìn)行將該第一反應(yīng)液用該分注裝置吸取的第二工序，使該第一反應(yīng)液疊層于該檢樣溶液的下層，然后，將用該分注裝置吸取的該檢樣溶液和該第一反應(yīng)液噴出到該第二反應(yīng)液中，進(jìn)行正式反應(yīng)，然后添加含有底物溶液的第三反應(yīng)液，測定發(fā)光量，從而測定抗原的量。正式反應(yīng)中，固定抗體或標(biāo)記抗體和游離抗體與抗原發(fā)生競爭反應(yīng)。
實(shí)施例
[0082]以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但下述實(shí)施例只不過是例舉本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不受下述實(shí)施例的任何限定。只要不偏離本發(fā)明的精神，可以進(jìn)行任何變更、改良或改變，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的。
[0083]實(shí)施例1
C反應(yīng)蛋白(CRP)測定試劑的制備
(I)檢樣的制備
準(zhǔn)備全血檢樣和血衆(zhòng)檢樣作為檢樣。血衆(zhòng)檢樣是將全血檢樣在3000rpm、8°C下離心分離15分鐘，由得到的同一檢樣制備。
[0084](2)磁性顆粒溶液的制備
抗CRP單克隆抗體:將CRP-1 (ImmunoProbe公司制造)在磁性顆粒(2.4 μ m)上、在500mmol/L MES緩沖液(pH6.0)中致敏，然后用含有0.02%表面活性劑的Tris緩沖液(0.0lmol/L pH8.0)固定,制備結(jié)合了抗CRP抗體的磁性顆粒。所制備的磁性顆粒懸浮于含有0.3mg/mL抗CRP單克隆抗體(CRP-1)的50mmol/L MOPS緩沖液(ρΗ6.5)中使用，其中。
[0085](3)標(biāo)記抗體溶液的制備
抗CRP單克隆抗體:通過馬來酰亞胺法使CRP-4 (ImmunoProbe公司制造)與來自牛的堿性磷酸酶(ALP)結(jié)合，制備ALP標(biāo)記的抗CRP抗體。制備的標(biāo)記抗體溶解于含有15%蔗糖和0.3mg/mL抗CRP單克隆抗體(CRP-1)的20mmol/L MES緩沖液(pH6.0)中使用。同樣地制備不含有蔗糖的溶液作為比較用標(biāo)記抗體溶液。
[0086](4)洗滌液的制備
制備含有 0.05%TritonX-100 和 0.9%NaCl 的 IOmmoI/L MES 緩沖液(pH6.5)。
[0087](5)稀釋液的制備
制備含有1%牛血清白蛋白(BSA)和0.3mol/L NaCl的0.lmol/L MOPS緩沖液(ρΗ7.5)。
[0088](6)發(fā)光底物
發(fā)光底物使用 0.4mmol/L CDP-Star 溶液(Applied Biosystems 公司)。[0089]上述制備的試劑類封于圖2所示的由聚丙烯（PP)制造的盒中，使用自動(dòng)化學(xué)發(fā) 光酶免疫測定裝置PATHFAST (三菱化學(xué)Medience公司制造）進(jìn)行測定。向該盒的樣品槽
(1)、標(biāo)記抗體容納槽(2)、洗滌槽1 (3)、洗滌槽2 (4)、洗滌槽3 (5)、磁性顆粒容納槽(7)、稀 釋液槽（11)、底物槽（13)中填充上述制備例（1廣(6)中制備的各試劑和溶液，然后將該試 劑容納槽上部用鋁箔密封。填充位置和填充量如下。如無特別記載的槽則為空槽。
[0090]樣品槽（1)100 U L標(biāo)記抗體容納槽(2)85 u L洗滌槽1 (3)400 u L洗滌槽2 (4)400 u L洗滌槽3 (5)400 u L磁性顆粒容納槽(7)50 u L稀釋液槽（11)100 u L底物槽(13)140 u L實(shí)施例2自動(dòng)測定裝置的測定順序在后述的比較例1和實(shí)施例3中，是使用具備6個(gè)連續(xù)的吸取、噴出機(jī)構(gòu)和6個(gè)連續(xù)的
磁性顆粒分離機(jī)構(gòu)的自動(dòng)測定裝置（PATHFAST)，按照本實(shí)施例所述的以下步驟，使用實(shí)施 例1中制備的試劑盒，測定檢樣中的CRP。
[0091](1)將檢樣以100 iiL分注到實(shí)施例1中制備的盒的樣品槽⑴中；
(2)將分注了檢樣的試劑盒安裝于自動(dòng)測定裝置中；
(3)啟動(dòng)自動(dòng)測定裝置；
(4)自動(dòng)測定裝置讀取粘附于試劑盒上的條形碼，識別CRP為測定對象；
(5)將試劑盒上部的密封鋁箔用尖銳物穿孔；
(6)從樣品槽（1)中吸取50yL樣品，接著由稀釋槽（11)中吸取50yL稀釋液，全量 噴出到空槽（14)中。再在空槽（14)中反復(fù)進(jìn)行吸取、噴出操作，由此進(jìn)行第一階段稀釋步 驟；
(7)接著，從槽（14)中吸取50ii L樣品與稀釋液的混合液，從標(biāo)記抗體容納槽（2)中 吸取50 y L標(biāo)記物，然后在磁性顆粒容納槽（7)中噴出，與磁性顆粒混合，在37°C下反應(yīng)5 分鐘；
(8)在磁性顆粒容納槽（7)中，通過磁鐵分離磁性顆粒；
(9)將磁性顆粒在洗滌槽（3)中洗滌，然后用永久磁鐵分離磁性顆粒；
(10)上述（9)的操作也在洗滌槽⑷、（5)中進(jìn)行；
(11)接著，在底物槽（13)中噴出，與CDP-Star溶液混合，在37°C下進(jìn)行1分鐘酶促反 應(yīng)，然后用光電子倍增管（PMT)，由測光槽上部測定發(fā)光量。
[0092]比較例1
由同一檢樣形成的全血檢樣和血漿檢樣的測定-1
使用實(shí)施例1中制備的不含有蔗糖的試劑，按照實(shí)施例2的方法測定全血檢樣和血漿 檢樣。血漿檢樣是將全血檢樣在3000rpm、8°C下離心分離15分鐘，由所得的同一檢樣制備。
[0093]其結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3可知，未向測定系統(tǒng)中添加蔗糖時(shí)，關(guān)于血漿檢樣測定值與全血檢樣測定值的相關(guān)性，其斜率為0.8117，可見約20%的偏離。圖4表示血漿檢樣測定值與全血檢樣測定值之比(血漿檢樣測定值+全血檢樣測定值)的結(jié)果。由圖4可知，原本求出的比應(yīng)該在100%附近，但隨著濃度的升高，可見其比增大。
[0094]這里，在探討其原因時(shí)，對于全血檢樣，如圖1之(a)所示，可知標(biāo)記抗體溶液在全血檢樣間升高，反應(yīng)開始。在進(jìn)一步確認(rèn)比重時(shí)，血漿檢樣和標(biāo)記抗體溶液的比重幾乎沒有變化,但全血檢樣的比重為1.053g/cm3，標(biāo)記抗體溶液的比重為1.014g/cm3。標(biāo)記抗體溶液比全血檢樣的比重低約3.7%，可知有對反應(yīng)產(chǎn)生較大影響的差異。
[0095]實(shí)施例3
由同一檢樣形成的全血檢樣和血漿檢樣的測定-2
由比較例I的結(jié)果可知:比重不同是原因，因此用蔗糖使標(biāo)記抗體溶液的比重增加，研究在不會與全血檢樣混合的條件下是否可以改善。除使用實(shí)施例1中制備的含蔗糖試劑之夕卜，與比較例I同樣地進(jìn)行測定。
[0096]其結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5可知，向測定系統(tǒng)中添加蔗糖時(shí)，關(guān)于血漿檢樣測定值與全血檢樣測定值的相關(guān)性，其斜率為0.9528，與不添加蔗糖的情形相比得到大幅改善。圖6表示血漿檢樣測定值與全血檢樣測定值之比(血漿檢樣測定值+全血檢樣測定值)的結(jié)果。由圖6可知，可確認(rèn)所求出的比在100%附近變化。
[0097]由以上可知，通過在測定系統(tǒng)中添加蔗糖來調(diào)節(jié)比重，全血檢樣和血漿檢樣的測定值不發(fā)生偏離，可以準(zhǔn)確且精度良好地測定。
[0098]因此，在標(biāo)記抗體溶液中添加蔗糖、調(diào)節(jié)比重時(shí)，探討了與全血檢樣溶液的比重差異有多大的程度為好。
[0099]其結(jié)果，全血檢樣溶液的比重約為1.053g/cm3時(shí)，如果在檢樣溶液中添加終濃度為5%的蔗糖，則添加后的檢樣溶液相對于全血檢樣溶液的比重變化約低2.18%，如果添加終濃度為10%的蔗糖，則約高0.96%，如果添加終濃度為15%的蔗糖，則約高1.5?2.56%，如果添加終濃度為20%的蔗糖，則約高7.5%。于是，進(jìn)一步探討可知，如果添加終濃度為10%以上的鹿糖，則與上述同樣，不會與全血檢樣混合，可得到血衆(zhòng)檢樣測定值與全血檢樣測定值的相關(guān)性。
[0100]產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明，可以同時(shí)開始正式反應(yīng)中的反應(yīng)，因此可以準(zhǔn)確且高精度地測定檢樣中的目標(biāo)物質(zhì)。并且與檢樣的種類無關(guān)，均可進(jìn)行精度高的測定，因此可進(jìn)行簡便且沒有誤使用的測定，可以說是利用性高的測定方法。
[0101]以上是根據(jù)特定的方案說明本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的變形或改良包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.目標(biāo)物質(zhì)的測定方法，該測定方法是: 準(zhǔn)備可能含有目標(biāo)物質(zhì)的檢樣或其處理液、第一反應(yīng)液、和第二反應(yīng)液； 使用具有分注裝置的測定裝置，將上述檢樣或其處理液、和上述第一反應(yīng)液按照該順序或相反順序依次吸取到分注裝置中； 然后由分注裝置中一并噴出，與上述第二反應(yīng)液接觸，形成第一伙伴與目標(biāo)物質(zhì)的復(fù)合物，該第一伙伴含在第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液的至少一方中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)； 對形成的上述復(fù)合物或來自該復(fù)合物的信號進(jìn)行分析， 上述目標(biāo)物質(zhì)的測定方法的特征在于:上述檢樣或其處理液的比重與上述第一反應(yīng)液的比重不同； 在檢樣或其處理液與第一反 應(yīng)液疊層的狀態(tài)下被吸取到分注裝置中。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，檢樣為全血。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，第一反應(yīng)液的比重比檢樣或其處理液的比重大，將檢樣或其處理液、和第一反應(yīng)液按照該順序吸取到分注裝置中。
4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，第一反應(yīng)液含有選自多元醇類、糖醇類和糖類的至少一種物質(zhì)。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中，第一反應(yīng)液含有選自乙二醇、丙二醇、二甘醇、甘油、戊糖、己糖、丙糖、丁糖、庚糖、蔗糖、海藻糖、異海藻糖、曲二糖、槐糖、黑曲霉二糖、昆布二糖、麥芽糖、纖維二糖、異麥芽糖、龍膽二糖、乳糖、松二糖、麥芽酮糖、帕拉金糖、異龍膽二糖、甘露二糖、蜜二糖、異蜜二糖、異乳糖、半乳蔗糖海蔥二糖蕓香糖、蕓香二糖木二糖、Primel lose、低聚糖類、棉子糖、松三糖和麥芽三糖的至少一種物質(zhì)。
6.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，權(quán)利要求4或5所述的物質(zhì)的總量是以10%以上且30%以下含在第一反應(yīng)液中。
7.權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴是抗體或抗原。
8.權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴含在第一反應(yīng)液中，識別與第一伙伴不同的區(qū)域、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴含在第二反應(yīng)液中。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴和第二伙伴是用標(biāo)記物標(biāo)記的伙伴或固定于固相載體上的伙伴。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中，第一反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴是用標(biāo)記物標(biāo)記的伙伴，第二反應(yīng)液中所含的、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第二伙伴是固定在固相載體上的伙伴。
11.權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在第一反應(yīng)液或第二反應(yīng)液的至少一方中含有抑制與目標(biāo)物質(zhì)形成復(fù)合物、與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中，第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液中含有與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的上述第三伙伴。
13.權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第三伙伴是抗體或抗原。
14.權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，分注裝置是吸頭。
15.目標(biāo)物質(zhì)的測定試劑盒，該目標(biāo)物質(zhì)的測定試劑盒含有第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，在第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液的至少一方中含有與目標(biāo)物質(zhì)特異性反應(yīng)的第一伙伴，在具有分注裝置的測定裝置中使用，上述測定裝置是實(shí)施以下步驟的裝置:將檢樣或其處理液和上述第一反應(yīng)液按照該順序或相反順序依次吸取到分注裝置內(nèi)，上述檢樣或其處理液的比重與上述第一反應(yīng)液的比重不同。
16.權(quán)利要求15所述的測定試劑盒，其中，第一反應(yīng)液的比重比檢樣或其處理液的比重大。`
【文檔編號】G01N33/543GK103562720SQ201280015693
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月28日
【發(fā)明者】莊司慶一, 橫井宏行 申請人:三菱化學(xué)美迪恩斯株式會社