專利名稱：基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，具體是指納米材料的生物功能化和應(yīng)用，表面增強(qiáng)拉曼共振(SERS)以及耦合增強(qiáng)效應(yīng)，蛋白質(zhì)定量和免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物的定量檢測(cè)對(duì)于蛋白組學(xué)研究具有重要的意義，它作為一種分析指標(biāo)，可以靈敏的反應(yīng)治療藥物在疾病模型中的藥效。目前的免疫分析技術(shù)都是利用了抗原抗體免疫夾心反應(yīng)原理，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法多以固相反應(yīng)為主，先固定捕獲抗體，再依次結(jié)合抗原和檢測(cè)抗體，洗脫步驟多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。另外，還建立了一些新的免疫分析技術(shù)，如磁分離分析技術(shù)，微流控免疫分析技術(shù)，基于場(chǎng)效應(yīng)晶體管的納米管技術(shù)等，這些分析方法靈敏、快速、特異，但是，需要借助于復(fù)雜的儀器，操作難度高，實(shí)驗(yàn)人員需要掌握一定的技術(shù)。·

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出了一種基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，檢測(cè)過(guò)程只需要一步操作，簡(jiǎn)單、快速，不需要洗脫，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)了樣品中含有多個(gè)組分的同步定量分析，靈敏度高，特異性好。當(dāng)貴金屬納米顆粒表面等離子體受到激發(fā)，在顆粒表面產(chǎn)生電磁場(chǎng)，顯著增強(qiáng)了表面吸附分子的拉曼信號(hào)；當(dāng)納米顆粒之間的距離足夠接近時(shí)，表面等離子體產(chǎn)生耦合作用，形成了更強(qiáng)的電磁場(chǎng)，對(duì)表面吸附分子的拉曼信號(hào)能達(dá)到 (Τιο15倍的增強(qiáng)作用。本發(fā)明所述的基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，包括制備表面修飾有拉曼活性染料和抗體的納米顆粒探針，抗原抗體結(jié)合拉近納米顆粒之間的距離，表面等離子體產(chǎn)生耦合，利用耦合增強(qiáng)效應(yīng)進(jìn)行SERS定量分析。其中，所述的納米顆粒表面功能化修飾是通過(guò)Au-S鍵共價(jià)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，拉曼活性染料自身帶有巰基且無(wú)熒光背景，抗體經(jīng)三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)還原處理。本發(fā)明所述的免疫分析方法，分別制備了表面修飾有拉曼活性染料和捕獲抗體的金納米球探針和表面修飾有拉曼活性染料和檢測(cè)抗體的金納米棒探針，待測(cè)物抗原與抗體發(fā)生免疫夾心反應(yīng)，生成免疫復(fù)合物，拉近納米顆粒之間的距離，產(chǎn)生表面等離子體耦合效應(yīng)，顯著增強(qiáng)了納米顆粒表面修飾染料的拉曼信號(hào)，利用這種耦合增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗原的SERS定量分析。本發(fā)明所述的多組分免疫分析方法包括如下步驟
(O制備修飾有拉曼活性染料和檢測(cè)抗體(多抗)的金納米棒探針；
(2)制備修飾有拉曼活性染料和捕獲抗體(單抗)的金納米球探針；
(3)將待測(cè)物樣品加入到含有步驟(I)和(2)所述的兩種金納米顆粒探針的緩沖溶液中，發(fā)生免疫夾心反應(yīng)；
(4)對(duì)反應(yīng)后的樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)。
其中，針對(duì)不同的待測(cè)物抗原，步驟(I)所述的金納米棒探針是表面修飾有不同的拉曼活性染料和不同的檢測(cè)抗體的納米顆粒探針。其中，針對(duì)不同的待測(cè)物抗原，步驟(2 )所述的金納米球探針是表面修飾有不同的拉曼活性染料和不同的捕獲抗體的納米顆粒探針。其中，針對(duì)一種待測(cè)物抗原，步驟(I)所述的金納米棒探針和步驟(2)所述的金納米球探針是表面修飾有同一種拉曼活性染料的納米顆粒探針。其中，步驟(4)所述的檢測(cè)手段是利用拉曼光譜儀對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行定量分析。其中，所述的檢測(cè)抗體和捕獲抗體均經(jīng)過(guò)三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)還原處理。
以下結(jié)合具體的操作步驟對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明(以樣品中含有三種待測(cè)抗原為例)
(I)分別制備了三種能與待測(cè)抗原(I，II，III)特異性結(jié)合的金納米棒探針I(yè)，金納米棒探針I(yè)I，金納米棒探針I(yè)II。金納米棒探針I(yè)是表面修飾有拉曼染料(I)，檢測(cè)抗體(I)和BSA的納米顆粒探針，金納米棒探針I(yè)I是表面修飾有拉曼染料(2)，檢測(cè)抗體(2)和BSA的納米顆粒探針，金納米棒探針I(yè)II是表面修飾有拉曼染料(3)，檢測(cè)抗體(3)和BSA的納米顆粒探針。(2)分別制備了三種能與待測(cè)抗原(I，II，ΠΙ)特異性結(jié)合的金納米球探針I(yè)，金納米球探針I(yè)I，金納米球探針I(yè)II。金納米球探針I(yè)是表面修飾有拉曼染料(I)，捕獲抗體(I)和BSA的納米顆粒探針，金納米球探針I(yè)I是表面修飾有拉曼染料(2)，捕獲抗體(2)和BSA的納米顆粒探針，金納米球探針I(yè)II是表面修飾有拉曼染料(3)，捕獲抗體(3)和BSA的納米顆粒探針。(3)將步驟(I)和(2)所述的兩種金納米顆粒探針加入到含有三種待測(cè)抗原的樣品溶液中，抗原與抗體發(fā)生免疫夾心反應(yīng)。(4)對(duì)反應(yīng)后的樣品溶液進(jìn)行拉曼光譜掃描。對(duì)于樣品中含有三種待測(cè)抗原的定量分析，檢測(cè)過(guò)程是取金納米棒探針I(yè)，II，III和金納米球探針I(yè)，II，111的儲(chǔ)備液以及緩沖溶液于微量管中，加入含有三種待測(cè)抗原的樣品溶液，于37°c恒溫水浴中培育15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，取一定體積的樣品進(jìn)行拉曼光譜掃描。本發(fā)明中，制備金納米棒探針的具體步驟是(I)取I mL 50 mM TCEP溶液加入到檢測(cè)抗體溶液(O. I mg/mL, 150 mL)中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘；(2)取金納米棒(長(zhǎng)徑比 2. 7)溶液4 mL,8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒分散在5 mL滅菌水中，取280 mL 15 mM Brij 56溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，于37°C搖床中培育30分鐘后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒分散在2 mL滅菌水中；(3)取檢測(cè)抗體溶液(O. I mg/mL, 180 mL)加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入30°C搖床中培育2小時(shí)；(4)取拉曼染料溶液(50 mM,6 mL)加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入30°C搖床中培育2小時(shí)；(5)取90 mL 5% BSA溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，于30°C搖床中繼續(xù)培育2小時(shí)后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒分散在10 mM PB溶液中，反復(fù)離心洗滌三次后，用0.6 mL 10 mM PB溶液定容，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 制備金納米球探針的具體步驟是(1)取I mL 50 mM TCEP溶液加入到捕獲抗體溶液(O. I mg/mL, 150 mL)中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘；(2)取金納米球溶液I mL，10000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米球分散在300 mL滅菌水中，取拉曼染料溶液(50 mM, 6 mL)加入到金納米球溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育15分鐘；(3)取捕獲抗體溶液(0.1 mg/mL, 112 mL)加入到金納米球溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育I小時(shí)；(4)取17 mL 5% BSA溶液加入到金納米球溶液中，充分混勻，于37°C搖床中繼續(xù)培育I小時(shí)后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米球分散在10 mM PB溶液中，反復(fù)離心洗滌三次后，用300 mL 10 mM PB溶液定容，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?duì)于樣品中含有三種待測(cè)抗原的定量分析，具體的操作步驟是分別取三種金納米棒探針I(yè)，II，III C2 nM，I. 25 mL)和三種金納米球探針I(yè)，II，III Γ50 pM，2 mL)力口入到17.25 mL PBS緩沖溶液(10 mM PB, 200 mM NaCl)中，取3 mL含有待測(cè)抗原的樣品溶液加入到該溶液中，充分混勻后，放入37°C恒溫水浴中反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,使用拉曼光譜儀對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行拉曼光譜掃描。
注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改變比例或試劑加入順序可使信號(hào)的變化程度在1% 100%內(nèi)變化。本發(fā)明提出了一種基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，分別制備了表面修飾有拉曼活性染料和捕獲抗體的金納米球探針和表面修飾有拉曼活性染料和檢測(cè)抗體的金納米棒探針，拉曼活性染料自身帶有巰基且無(wú)熒光背景，抗體經(jīng)TCEP還原處理。待測(cè)物抗原與抗體發(fā)生免疫夾心反應(yīng)，生成免疫復(fù)合物，拉近納米顆粒之間的距離，產(chǎn)生表面等離子體耦合效應(yīng)，顯著增強(qiáng)了納米顆粒表面修飾染料的拉曼信號(hào)，利用這種耦合增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗原的SERS定量分析。該方法簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)過(guò)程只需要一步操作，不需要反復(fù)洗脫，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)了樣品中含有多個(gè)組分的同步定量分析，靈敏度高，特異性好，有望成為蛋白組學(xué)研究和藥物療效評(píng)估的一種新方法。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :人干擾素-Y檢測(cè) 具體的操作步驟是
(I) 制備金納米棒探針和金納米球探針
金納米棒探針的制備方法(I)取I mL 50 mM TCEP溶液加入到人干擾素-Y抗體溶液(多抗，O. I mg/mL, 150 mL)中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘；(2)取金納米棒(長(zhǎng)徑比 2. 7)溶液4 mL,8000 rpm離心lOmin,去除多余的十六燒基三甲基溴化銨(CTAB)溶液，將金納米棒重新分散在5 mL滅菌水中；取280 mL 15 mM Brij 56溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘，置換掉金納米棒表面的CTAB ;取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒重新分散在2 mL滅菌水中；
(3)取經(jīng)TCEP還原處理后的人干擾素-Y抗體溶液(多抗，O. I mg/mL, 180 mL)加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入30°C搖床中培育2小時(shí)；(4)取DTNB (5，5’-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid))溶液(50 mM,6 mL)加入到金納米棒溶液中，充分混勻,放入30°C搖床中培育2小時(shí)；(5)取90 mL 5% BSA溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，于30°C搖床中繼續(xù)培育2小時(shí)后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒分散在10 mM PB溶液中，反復(fù)離心洗滌三次后，用0.6 mL 10 mM PB溶液定容，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。金納米球探針的制備方法(I)取I mL 50 mM TCEP溶液加入到人干擾素-Y抗體溶液(單抗，O. I mg/mL, 150 mL)中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘；(2)取金納米球溶液I mL，10000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米球分散在300 mL滅菌水中，取拉曼染料溶液(50 mM, 6 mL)加入到金納米球溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育15分鐘；(3)取經(jīng)TCEP還原處理后的人干擾素-Y抗體溶液(單抗，O. I mg/mL, 112mL)加入到金納米球溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育I小時(shí)；(4)取17 mL 5% BSA溶液加入到金納米球溶液中，充分混勻，于37°C搖床中繼續(xù)培育I小時(shí)后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米球分散在10 mM PB溶液中，反復(fù)離心洗滌三次后，用300 mL 10 mM PB溶液定容，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2) 人干擾素-Y檢測(cè)
分別取3. 75 mL金納米棒探針和6 mL金納米球探針加入到17. 25 mL PBS緩沖溶液 (含10 mM PB, 200 mM NaCl)中，取3 mL含有人干擾素-Y的樣品溶液加入到緩沖溶液中，充分混勻，放入37°C恒溫水浴中反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物溶液10 L滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光譜儀對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行拉曼光譜掃描。選用He-Ne激發(fā)器(激發(fā)波長(zhǎng)632 nm)，曝光時(shí)間10秒，掃描圈數(shù)I圈，掃描范圍600 nm-2000 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
待測(cè)物人干擾素-Y的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是I. 2 nM ^1.2 pM，能達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限是I. O pM。實(shí)施例2 :細(xì)胞因子多組分檢測(cè)
選取含有三種細(xì)胞因子(干擾素-Y，白介素_2，腫瘤壞死因子-α)的待測(cè)樣品作為模型體系。對(duì)于三種待測(cè)細(xì)胞因子，分別制備了三種金納米棒探針I(yè)，II，III和三種金納米球探針I(yè)，II，III，金納米棒探針I(yè)與金納米球探針I(yè)能特異性結(jié)合人干擾素-Y，金納米棒探針I(yè)I與金納米球探針I(yè)I能特異性結(jié)合人白介素-2，金納米棒探針I(yè)II與金納米球探針I(yè)II能特異性結(jié)合腫瘤壞死因子-α。具體的操作步驟是
(I)制備金納米棒探針和金納米球探針
修飾有拉曼染料DTNB和人干擾素-Y抗體的金納米棒探針I(yè)的制備方法(I)取I mL50 mM TCEP溶液加入到人干擾素-Y抗體溶液(多抗，O. I mg/mL, 150 mL)中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘；取金納米棒(長(zhǎng)徑比 2. 7)溶液4 mL,8000 rpm離心lOmin，去除多余的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液，將金納米棒重新分散在5 mL滅菌水中；取280 mL 15 mM Brij 56溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘，置換掉金納米棒表面的CTAB ;取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒重新分散在2 mL滅菌水中；(3)取經(jīng)TCEP還原處理后的人干擾素-Y抗體溶液(多抗，O. Img/mL, 180 mL)加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入30°C搖床中培育2小時(shí)；(4)取DTNB溶液(50 mM,6 mL)加入到金納米棒溶液中，充分混勻，放入30°C搖床中培育2小時(shí)；
(5)取90 mL 5% BSA溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，于30°C搖床中繼續(xù)培育2小時(shí)后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米棒分散在10 mM PB溶液中，反復(fù)離心洗滌三次后，用O. 6 mL 10 mM PB溶液定容，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 修飾有拉曼染料DTNB和人干擾素-Y抗體的金納米球探針I(yè)的制備方法(1)取I mL 50 mM TCEP溶液加入到人干擾素-Y抗體溶液(單抗，O. I mg/mL, 150 mL)中，充分混勻，放入37°C搖床中培育30分鐘；(2)取金納米球溶液I mL，10000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米球分散在300 mL滅菌水中，取拉曼染料溶液(50 mM, 6 mL)加入到金納米球溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育15分鐘；(3)取經(jīng)TCEP還原處理后的人干擾素-Y抗體溶液(單抗，O. I mg/mL, 112 mL)加入到金納米球溶液中，充分混勻，放入37°C搖床中培育I小時(shí)；(4)取17 mL 5% BSA溶液加入到金納米球溶液中，充分混勻，于37°C搖床中繼續(xù)培育I小時(shí)后，取出，8000 rpm離心lOmin，去除上層溶液，將金納米球分散在10 mM PB溶液中，反復(fù)離心洗滌三次后，用300 mL 10 mM PB溶液定容，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。修飾有拉曼染?-thiouracil和人白介素_2抗體的金納米棒探針I(yè)I和金納米球探針I(yè)I，以及修飾有拉曼染料4-acetamidothiophenol和人腫瘤壞死因子_ α抗體的金納米棒探針I(yè)II和金納米球探針I(yè)II與上述步驟完全一致。(2)細(xì)胞因子多組分檢測(cè)· 分別取三種金納米棒探針I(yè)，II，III C2 ηΜ, I. 25 mL)和三種金納米球探針I(yè)，II，III Γ50 pM, 2 mL)加入到 17. 25 mL PBS 緩沖溶液(10 mM PB, 200 mM NaCl)中，取 3 mL樣品溶液加入到緩沖溶液中，充分混勻，放入37°C恒溫水浴中反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物溶液10 L滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光譜儀對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行拉曼光譜掃描。選用He-Ne激發(fā)器(激發(fā)波長(zhǎng)632 nm)，曝光時(shí)間10秒，掃描圈數(shù)I圈，掃描范圍600 nm-2000nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
選擇的三種拉曼染料(DTNB, 2-thiouracil, 4-acetamidothiophenol),每種染料都各自有一個(gè)特征峰不受其它兩種染料拉曼峰的干擾，以此特征峰的強(qiáng)度值作為待測(cè)物的定量分析依據(jù)。待測(cè)物人干擾素-Y的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是I. 2 nM ^l. 2PM，能達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限是I. O pM ;待測(cè)物人白介素-2的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是I. 3 ηΜ 3. 25 ρΜ，接近3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限是2. 75 pM ;待測(cè)物人腫瘤壞死因子-α的濃度與響應(yīng)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍是I. 14 ηΜ O. 57 ρΜ，能達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限是O. 45 ρΜ。
權(quán)利要求
1.一種基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，包括制備表面修飾有拉曼活性染料和抗體的金納米顆粒探針，抗原與抗體免疫夾心反應(yīng)使納米顆粒之間的距離拉近，產(chǎn)生表面等離子體耦合效應(yīng)，顯著增強(qiáng)納米顆粒表面修飾染料的拉曼信號(hào)，利用耦合增強(qiáng)效應(yīng)和拉曼光譜自身性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了多組分SERS定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，包括如下步驟 (O制備表面修飾有拉曼活性染料和抗體的金納米顆粒探針； (2)將待測(cè)物樣品加入到含有步驟(I)所述的金納米顆粒探針的PBS緩沖溶液中，進(jìn)行免疫夾心反應(yīng)； (3)對(duì)反應(yīng)后的樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求2所述的分析方法，其特征在于，步驟(I)所述的金納米顆粒探針包括修飾有拉曼活性染料和抗體的金納米棒探針，修飾有拉曼活性染料和抗體的金納米球探針。
4.如權(quán)利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述抗體均經(jīng)過(guò)三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽還原處理。
5.如權(quán)利要求2所述的分析方法，其特征在于，步驟(3)所述的檢測(cè)是對(duì)反應(yīng)后的樣品溶液進(jìn)行拉曼光譜掃描。
6.如權(quán)利要求2至5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下 (O制備表面修飾有拉曼活性染料和抗體的金納米棒探針 Ca)取三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到抗體溶液中，充分混勻，37°C培育； (b)取金納米棒溶液，離心去除多余的CTAB保護(hù)劑，將金納米棒重新分散在滅菌水中，取中性表面活性劑Brij 56溶液加入到金納米棒溶液中，充分混勻，37°C培育，置換掉金納米棒表面的CTAB保護(hù)劑，再次離心去除多余的Brij 56，將金納米棒重新分散在滅菌水中； (c)向步驟(b)所得的金納米棒溶液中加入經(jīng)步驟(a)還原處理后的抗體溶液，30°C培育；取拉曼染料溶液加入到該溶液中，充分混勻，30°C培育；再加入BSA溶液，充分混勻，30°C培育；標(biāo)記過(guò)程結(jié)束后，反復(fù)離心三次去除多余的抗體和拉曼染料，將離心得到的金納米棒重新分散在PB溶液中，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫? (2)制備表面修飾有拉曼活性染料和抗體的金納米球探針 Ca)取三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液加入到抗體溶液中，充分混勻，37°C培育； (b)取金納米球溶液，離心去除上層溶液，將金納米球重新分散在滅菌水中，取拉曼染料溶液加入到該溶液中，充分混勻，37°C培育；加入經(jīng)步驟(a)還原處理后的抗體溶液，充分混勻，37°C培育；再加入BSA溶液，充分混勻，37°C培育；標(biāo)記過(guò)程結(jié)束后，反復(fù)離心三次去除多余的抗體和拉曼染料，將離心得到的金納米球重新分散在PB溶液中，4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫? (3)對(duì)反應(yīng)后的樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)分別取步驟(I)制備的金納米棒探針，步驟(2)制備的金納米球探針和含有待測(cè)物抗原的樣品溶液加入到PBS緩沖溶液中，充分混勻，37°C培育，反應(yīng)結(jié)束后，使用拉曼光譜儀對(duì)產(chǎn)物溶液進(jìn)行拉曼光譜掃描。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于表面等離子體耦合效應(yīng)的均相多組分免疫分析方法，分別制備了表面修飾有拉曼活性染料和捕獲抗體的金納米球探針和表面修飾有拉曼活性染料和檢測(cè)抗體的金納米棒探針，拉曼活性染料自身帶有巰基且無(wú)熒光背景，抗體經(jīng)TCEP還原處理。待測(cè)物抗原與抗體發(fā)生免疫夾心反應(yīng)，生成免疫復(fù)合物，拉近納米顆粒之間的距離，產(chǎn)生表面等離子體耦合效應(yīng)，顯著增強(qiáng)了納米顆粒表面修飾染料的拉曼信號(hào)，利用耦合增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗原的SERS定量分析。該方法簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)過(guò)程只需要一步操作，不需要反復(fù)洗脫，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)了樣品中含有多個(gè)組分的同步定量分析，靈敏度高，特異性好，有望成為蛋白組學(xué)研究和藥物療效評(píng)估的一種新方法。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102914646SQ20121046393
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者王玉, 蔣健暉, 楚霞, 唐麗娟, 俞汝勤 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)