專利名稱：抗ctnnb1單克隆抗體12h7及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,特別涉及一種抗β-Catenin的單克隆抗體,產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及該抗體的免疫檢測用途。
背景技術(shù)：
β -Catenin是環(huán)連蛋白家族中的一員，分子量約90kd,為一種多功能蛋白質(zhì)； β -Catenin是新原癌基因的產(chǎn)物，可與二十多種蛋白質(zhì)結(jié)合，也是一種具有介導(dǎo)細(xì)胞粘附及信號傳導(dǎo)雙重活性的多功能蛋白。β -Catenin蛋白有兩個重要功能，一方面它是重要的細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架成分，另一方面它又是fct信號通路中的一個重要成員，在發(fā)育過程中指導(dǎo)機(jī)體的正常發(fā)育，在腫瘤細(xì)胞中，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。編碼β-Catenin的基因稱為CTNNBl，定位于染色體3p21，全長23. 2kb，有16個外顯子；Van Nhieu等的研究顯示，CTNNBl突變所導(dǎo)致的Wnt信號傳導(dǎo)途徑異常激活，是惡性腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。β-Catenin蛋白在細(xì)胞中異常表達(dá)可見于人類多種惡性腫瘤。細(xì)胞中的β -Catenin以兩種形式存在游離β -Catenin以及與E_cadherin、APC蛋白等結(jié)合形成復(fù)合體的β-Catenin，二者共同組成一個“胞內(nèi)β-Catenin庫”，并可互相轉(zhuǎn)換；正常情況下，兩者達(dá)成一種平衡，一旦這種平衡被打破，則可能造成惡性腫瘤的發(fā)生。Dong KyumWo等以及近年來的其他研究均顯示，β -Catenin異常的亞細(xì)胞定位、聚集與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖密切相關(guān)，并在胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤中均得到類似結(jié)論。β-Catenin作為腫瘤預(yù)后的影響因素，在不同的組織器官具有不同的意義。β -Catenin的免疫組化(IHC)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌中胞質(zhì)和核染色增加可能是預(yù)后較差的獨立因素，而表達(dá)水平的降低或缺失是胃癌和胰腺癌的不良預(yù)后因素。β-Catenin核內(nèi)高表達(dá)或細(xì)胞膜表達(dá)缺失的惡性黑色素瘤、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的患者生存期短，預(yù)后差。目前臨床上通常通過免疫組織化學(xué)病理實驗檢測腫瘤細(xì)胞中β-Catenin的表達(dá)狀況。而IHC實驗的核心為一抗，即可特異性結(jié)合β-Catenin的單克隆抗體,其性能的優(yōu)劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性高的抗β -Catenin的單克隆抗體具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為提供一種結(jié)合特異性高的抗β-Catenin的單克隆抗體12Η7，及其在制備用于檢測β -Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏日期為2012年5月16日，保藏編號為 CGMCC No. 6135。本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合β-Catenin蛋白的單克隆抗體12Η7,由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下(I)重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)β-Catenin基因的ORF全序列(如SEQ ID No. I所示)設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點SgfI和Mlul，并在其C末端引入Myc-DDK標(biāo)簽序列(標(biāo)簽序列如SEQ ID No. 2所示),插入表達(dá)載體pCMV6_Entry,構(gòu)建β -Catenin重組表達(dá)質(zhì)粒(簡稱為pCMV6_CTNNBl)；(2) β -Catenin重組蛋白的表達(dá)與純化以pCMV6_CTNNBl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，裂解離心取上清，DDK親和層析柱純化,獲得純化的β-Catenin重組蛋白；(3)單抗的篩選與制備采用上述β-Catenin重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗β-Catenin特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為12Η7，亞型鑒定為IgGl ;制備小鼠腹水，通過親和層析柱純化β-Catenin單抗12Η7。分別通過Western Blot (結(jié)果見圖3)、免疫組化實驗(結(jié)果見圖4-6)驗證該單抗的靈敏度和特異性。發(fā)明人還通過OriGene高密度蛋白芯片驗證了上述單克隆抗體的特異性O(shè)riGene高密度蛋白芯片上包含10400種HEK293T細(xì)胞蛋白過表達(dá)裂解物，每種蛋 白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣,每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽性信號的方向。將本發(fā)明單克隆抗體12H7與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結(jié)果顯示本發(fā)明單克隆抗體12H7特異性結(jié)合β-Catenin蛋白，與其他蛋白無交叉反應(yīng)。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種單克隆抗體12Η7在制備用于檢測β -Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于診斷β -Catenin相關(guān)性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應(yīng)用。由于β-Catenin蛋白的異常表達(dá)、異常亞細(xì)胞定位及聚集均與人類多種惡性腫瘤有關(guān)，因此使用本發(fā)明單克隆抗體檢測細(xì)胞中β-Catenin蛋白的表達(dá)狀況或亞細(xì)胞定位,可用于輔助診斷β -Catenin相關(guān)性腫瘤。所述β -Catenin相關(guān)性腫瘤為胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌或非小細(xì)胞肺癌。本發(fā)明還提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體12Η7 ;可用于檢測組織細(xì)胞中β -Catenin蛋白的表達(dá)狀況。本發(fā)明所述針對β-Catenin蛋白的特異性單抗12Η7,可與β-Catenin特異結(jié)合，提高了實驗的特異性和可靠性，并建立了基于單抗12Η7的免疫組織化學(xué)技術(shù)，主要用于大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的輔助診斷。保藏信息用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株的科學(xué)描述為抗人CTNNBl單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株12Η7 ；保藏單位全稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏單位簡稱CGMCC ；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏編號CGMCCNo. 6135。


圖I為Western blot驗證β -Catenin重組質(zhì)粒在ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中的表達(dá)；左邊泳道的上樣樣品為轉(zhuǎn)染PCMV6空載體的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞裂解液，右邊泳道的上樣樣品為轉(zhuǎn)染PCMV6-CTNNB1重組質(zhì)粒的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞裂解液，雜交所用一抗為抗DDK標(biāo)簽抗體；圖2為β -Catenin重組蛋白的SDS-PAGE鑒定圖；圖3為單克隆抗體12Η7在9種不同細(xì)胞系中的Western blot結(jié)果；圖4為以單克隆抗體12H7為一抗，免疫組化法檢測胰腺組織中β -Catenin蛋白的表達(dá)；圖5為以單克隆抗體12Η7為一抗，免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜組織中β -Catenin蛋白的表達(dá)；圖6為以單克隆抗體12Η7為一抗，免疫組化法檢測前列腺組織中β -Catenin蛋白的表達(dá)。
具體實施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例I抗β -Catenin單克隆抗體的制備一、β-Catenin重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以從ATCC獲得的質(zhì)粒BC058926 (含SEQ ID No. I所示β -CateninORF序列)為模板，設(shè)計兩條引物并分別引入酶切位點SgfI、MluI,以及C末端Myc-DDK標(biāo)簽(標(biāo)簽序列如SEQ ID No. 2所示),并克隆入表達(dá)載體pCMV6_Entry,構(gòu)建β -Catenin重組表達(dá)質(zhì)粒(簡稱為 pCMV6-CTNNBl)。二、β-Catenin重組蛋白的表達(dá)與純化I、轉(zhuǎn)染 ΗΕΚ293Τ 細(xì)胞ΗΕΚ293Τ細(xì)胞以1:3傳至直徑IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；取7. 5ml DMEM (無血清及抗生素)培養(yǎng)基至50ml管中，加入300 μ IPEI MegaTranl. O混勻，然后加入75 μ g上述β -Catenin重組質(zhì)粒(pCMV6_CTNNBl) DNA混勻并靜置30分鐘；分別取515 μ I上述混合液至各細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24小時后，每培養(yǎng)皿細(xì)胞添加25 μ 12Μ 丁酸鈉至終濃度5mM。2、裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后，進(jìn)行細(xì)胞裂解。吸去培養(yǎng)基，加入Iml PBS進(jìn)行漂洗，吸去PBS。加入Iml裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑PI和PMSF。置于冰盒中在搖床上振蕩，收集所有培養(yǎng)皿中得裂解液，4 °C離心，收集上清。3、DDK親和層析柱純化
以孔徑為O. 45 μ m,直徑為33mm的PVDF膜濾器過濾離心后的裂解液上清并轉(zhuǎn)入15ml管中，加入混合好的Sepharose Beadslml,封口后放入360度混勻器中，于4°C結(jié)合2小時；取出15ml管，將裂解液倒入BIO-RAD層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣WB檢測，見圖I (圖I顯示β-Catenin重組質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中正常表達(dá))；以裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用TBST沖洗Beads3次，滴盡后用O. IM Glycine (ρΗ3· 5)洗脫，第一次200 μ 1，滴盡不收集，第二、三次各500 μ 1，第四次250 μ 1，收集至一個1.5mlTube中，并迅速加入NaH2PO4 CpH=Il. O)中和至pH7. O左右，每管加入甘油至終濃度為10%，Tween-80至終濃度為O. 1%。純化后的β -Catenin重組蛋白用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見圖2。三、單抗的篩選與制備I、動物免疫上述純化的β -Catenin重組蛋白以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或 腹腔注射方法免疫6-8周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為50 μ g/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50 μ g/只。免疫兩次后取尾血以ELISA法梯度稀釋測定血清效價；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞采用BALB/c小鼠來源的sp2/0，融合時處于對數(shù)生長期；取上述免疫的小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37°C的50%PEG (PH8. 0)lml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入HAT培養(yǎng)基懸浮混勻，MC定容到50ml，分裝到3. 5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3、篩選和克隆融合7-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆,使用上述純化的β-Catenin重組蛋白進(jìn)行ELISA測試，標(biāo)記細(xì)胞株號。對陽性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定ELISA值，挑取0D280陽性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至ELISA測定96孔板全板結(jié)果為陽性；挑取陽性值高的單克隆定株，其對應(yīng)融合板細(xì)胞株為12H7。4、腹水單抗的制備與純化10-12周齡的雄性BALB/c小鼠腹腔注射O. 5ml降植烷，一周后每只小鼠用Iml注射器腹腔注射經(jīng)PBS洗滌重懸的單克隆細(xì)胞懸液，細(xì)胞用量為
5X IO6/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進(jìn)行腹水純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，單抗12H7亞型為IgGl，采用protein A進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y定、分裝、凍存在_20°C。以單抗 12H7 為一抗，對 H印G2、HeLa、SVT2、A549、C0S7、Jurkat、MDCK、PC12、MCF7九種細(xì)胞系的蛋白裂解液進(jìn)行雜交、顯色，其結(jié)果如圖3所示，由圖3可見β -Catenin蛋白在上述九種細(xì)胞系中均有表達(dá)。實施例2以單抗12Η7為一抗對多種癌組織進(jìn)行免疫組化檢測I、取胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌分別進(jìn)行石蠟包埋，使用Finesse組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為6μπι;2、脫臘與水化分析純二甲苯3次X IOmin,無水乙醇3次X IOmin, 95 %乙醇5min, 85%乙醇5min, 75%乙醇5min,去離子水浸泡3minX 3次；3、加入抗原修復(fù)液(O. 01M, pH6. O枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)2min，待高壓鍋溫度降至約90°C時，打開高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3minX 3 次。4、使用3%過氧化氫滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶,室溫靜置lOmin。去離子水浸泡5minX 3 次。5、加上封閉液(PBS+5%脫脂奶粉+5%正常山羊血清)，37°C孵育60min。6、去除封閉液，勿沖洗，加入1:150比例稀釋的本發(fā)明單抗12H7 ;置于濕盒中，
370C 孵育 60min。PBST(含 O. l%Tween-20 )洗滌 2 次，每次洗滌 5min。PBST(含 O. 02%Tween-20 )洗漆I次，每次洗漆5min。7、滴加 Polink-試劑盒 2 (Catlog No. D37-15)中的試劑 1，37°C孵育 10-20 分鐘。使用PBS洗滌3次，每次5min。滴加Pol ink-2試劑盒(Catlog No. D37-15)中的試劑2，37°C孵育10-20分鐘，使用PBS洗滌3次，每次5min。8、應(yīng)用DAB溶液(中杉金橋ZLI-9019)顯色，顯色3 lOmin。蒸餾水洗滌。9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1%鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置·Imin010、脫水和透明75%乙醇5min，100%乙醇5minX3次，85%乙醇5min，95%乙醇5min，100%乙醇3 X 5min ;二甲苯3 X 5min，中性樹膠封片。11、鏡檢，其結(jié)果分別見圖4-6。由圖4-6可見胰腺癌組織、子宮內(nèi)膜癌組織以及前列腺癌組織可見大量棕黃色顆粒，為β-Catenin蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞；并且，β-Catenin陽性著色定位準(zhǔn)確，染色信號強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)非特異染色。實施例3、單克隆抗體12Η7的特異性檢測OriGene高密度蛋白芯片上包含10400種ΗΕΚ293Τ細(xì)胞蛋白過表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣,每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片對12H7單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定的具體步驟I、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘；棄掉去離子水，使用IOmlPBST平衡芯片，室溫處理10分鐘。2、向50ml離心管中加入40ml5%脫脂牛奶(用PBST進(jìn)行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。3、使用封閉液(5%脫脂牛奶)稀釋一抗12H7 (稀釋比例I :200)。4、將潔凈的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300 μ I上述稀釋一抗在封口膜上。5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片NC膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤芯片NC膜，直至整張NC膜浸潤在一抗溶液中。整個操作過程避免產(chǎn)生氣泡。將芯片移到4度環(huán)境下，靜置，一抗孵育過夜。在芯片上加蓋培養(yǎng)皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長時間孵育導(dǎo)致抗體蒸發(fā)。6、第二天將芯片移至50ml離心管中，使用PBST漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40ml PBST (含O. l%Tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。7、使用封閉液(5% 脫脂牛奶)稀釋二抗 DyLight649_conjugated AffiniPureFragment Goat-anti-Mouse IgG,稀釋比例為 I :400。8、按照上述步驟4，步驟5進(jìn)行二抗孵育操作。室溫孵育I小時。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發(fā)生信號漂白。9、按照上述步驟6，使用PBST洗滌芯片。10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號。13、根據(jù)BSA_Cy3以及BSA_Cy5確定芯片方向以及陽性信號的位點。14、根據(jù)陽性信號位點找出對應(yīng)蛋白裂解液ID，根據(jù)裂解液數(shù)據(jù)庫信息，查找到對應(yīng)蛋白名稱，NCBI錄入號(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。芯片雜交結(jié)果顯示實驗組芯片上僅出現(xiàn)一個陽性信號點，對應(yīng)蛋白為β -Catenin ;結(jié)論本發(fā)明單克隆抗體12Η7僅特異性結(jié)合β -Catenin蛋白，而與其他蛋白無交叉反應(yīng)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合β-Catenin蛋白的單克隆抗體12H7，由保藏編號為CGMCC No. 6135的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
2.一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為CGMCC No. 6135。
3.如權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備用于檢測β-Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。
5.如權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備用于診斷β-Catenin相關(guān)性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述β-Catenin相關(guān)性腫瘤為胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌或非小細(xì)胞肺癌。
7.一種免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求I所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為CGMCCNo.6135，以及由此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體12H7。本發(fā)明還涉及單克隆抗體12H7在制備用于檢測β-Catenin蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用，含單克隆抗體12H7的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體12H7在制備用于檢測β-Catenin相關(guān)性腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所述單克隆抗體可與β-Catenin蛋白特異性結(jié)合，而與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白無交叉反應(yīng)，顯著提高了β-Catenin蛋白免疫檢測的特異性和可靠性。
文檔編號G01N33/577GK102911271SQ20121044549
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者何為無, 馬東輝, 袁克湖, 陳堅, 王超, 陳思, 王宜, 周春 申請人:無錫傲銳東源生物科技有限公司