專利名稱：血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測方法與磁性傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)今威脅人類健康和生命的主要疾病之一，且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。目前臨床主要的腫瘤檢測手段包括[I]實驗室檢查主要包括血、尿、大便的常規(guī)檢查、生化及免疫檢查、病理學(xué)檢查
坐寸ο[2]放射學(xué)檢查主要包括X光透視、X光攝片、X光造影檢查、CT掃描、核磁共振成像等。[3]放射性核素檢查即同位素檢查，包括功能測定檢查、掃描及伽瑪照射檢查、放射免疫分析等。[4]超聲波檢查包括A型、B型超聲波檢查。[5]內(nèi)窺鏡檢查包括各種硬性或光學(xué)纖維鏡。在腫瘤的研究和臨床實踐中，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是關(guān)鍵。目前常規(guī)的影像方法如X線、CT、核磁共振、B超等僅能發(fā)現(xiàn)O. 5cm以上的腫塊，這時部分腫瘤已經(jīng)處于中晚期，有的腫瘤已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，多數(shù)病人已經(jīng)喪失了最佳的治療時機。血清腫瘤標志物在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸、評價治療療效等方面都具有較大的實用價值。血清腫瘤標志物檢測已經(jīng)成為早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的方法之一，目前已經(jīng)發(fā)展了多種血清腫瘤標志物檢測技術(shù)并不斷地應(yīng)用于臨床如免疫放射分析法、酶標記免疫分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法、液體芯片檢測技術(shù)等，這些方法各有其優(yōu)點，如液體芯片一次能檢查出多種腫瘤標志物，和多次檢測相比降低了成本。但這些方法的不足之處在于缺乏靈活性，單項指標敏感性低、特異性較差。在檢測速度、準確率和檢測費用方面均存在缺陷，因此利用多學(xué)科交叉的優(yōu)勢研制新型腫瘤標志物檢測的生物傳感器技術(shù)顯得尤為重要。生物傳感器是利用生物活性材料(如酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等)與物理化學(xué)換能器(如電化學(xué)、光學(xué)、機械、電、磁等)有機結(jié)合構(gòu)成的一種生物信息檢測分析工具。由于生物傳感器在醫(yī)療保健、疾病診斷、食品安全檢測等具有廣泛的用途，受到了世界各國科學(xué)家的深入研究和大力研發(fā)；然而仍存在一些因素限制了生物傳感器的大規(guī)模應(yīng)用和推廣，如傳統(tǒng)生物傳感器的分析操作步驟太多、分析周期長、價格昂貴、體積大、昂貴的光學(xué)檢測設(shè)備及需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員才能完成等。近年來，由于免疫磁珠技術(shù)的不斷進展和傳感器技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們提出了將磁傳感器并結(jié)合磁性標簽研制用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、毒物學(xué)等生物信息探測的新一代生物傳感器。利用磁傳感器并結(jié)合磁性標簽用于探測生物分子的理念最早是由美國海軍實驗室的Baselt等[Baselt D. R. , LeeG. U.，Natesan M.，Metzger S. W.，Sheehan P. E.，Colton R.，A biosensor based onmagnetoresistance technology, Biosens. Bioelectr. 17 (1998) 731.]于 1998 年提出的，由此開啟了磁生物傳感器研究的熱潮。目前已報道的用于磁性納米粒子(磁珠)檢測的磁傳感器，主要有電磁感應(yīng)式傳感器、超導(dǎo)量子干涉器、磁通門傳感器、磁阻傳感器、霍爾傳感器、巨磁電阻傳感器和巨磁阻抗傳感器等。磁通門傳感器作為一種弱磁場檢測器件，近年來在衛(wèi)星發(fā)射、運載火箭、航天器等更是作為姿態(tài)敏感器而被廣泛使用，然而傳統(tǒng)的磁通門傳感器具有體積大、高重量、功耗大及長期穩(wěn)定性差等缺點。90年代以來，微機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)的飛速發(fā)展，為微型化磁通門傳感器的研制提供了一條有效可靠的途徑。采用MEMS技術(shù)研制微型化、集成化的磁通門傳感器成為國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點。與傳統(tǒng)的磁通門傳感器相比較，MEMS磁通門傳感器結(jié)構(gòu)緊湊，體積小、質(zhì)量輕，安裝調(diào)試簡單，不怕震動撞擊，受環(huán)境溫度變化影響小，在磁場檢測與生物醫(yī)學(xué)檢測方面展示出廣闊的應(yīng)用前景。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Dieckhoff等(Diechhoff J. , SchillingM. , Ludwig F.)在《Appl.Phys.Lett.》(美國應(yīng)用物理快報)《Vol. 99, pp. 112501, 2011》提出使用磁通門傳感器來探測磁性納米粒子，證明了磁通門傳感器在生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的可行性，但該研究工作只是得到了磁通門傳感器對Fe304磁性納米粒子的響應(yīng)，沒有實現(xiàn)對生物標志物的檢測。隨著微機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)的發(fā)展,利用MEMS技術(shù)制備的微流控芯片已應(yīng)用于生物與醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，而MEMS技術(shù)同樣可用來制造微型化、集成化的磁通門傳感器。將生物信息的固定與微型化磁通門傳感器相結(jié)合構(gòu)建新型血清腫瘤標志物檢測系統(tǒng)，利用磁性納米粒子標簽對血清腫瘤標志物進行檢測，具有重要的研究意義和臨床價值。通過文獻和專利檢索，沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于將微型化磁通門傳感器用于血清腫瘤標志物檢測的相關(guān)研究成果O

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有血清腫瘤標志物檢測技術(shù)的不足以及臨床的實際需求，提供一種血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法。為實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，包括如下步驟( I)采用MEMS工藝制作微型化磁通門傳感器；優(yōu)選地，所述微型化磁通門傳感器位于玻璃基片上，可以采用現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)，比如專利申請?zhí)枮?00910046099. 8的中國專利中記載的傳感器，當(dāng)然也可以采用其他能實現(xiàn)本發(fā)明功能的微型化磁通門傳感器。磁芯可以為NiFe薄膜、非晶和納米晶軟磁帶材材料，并采用MEMS工藝進行加工。(2)在玻璃基片上濺射Cr/Au薄膜，然后甩光刻膠、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠，使Au膜暴露在外面。優(yōu)選地，所述Cr/Au薄膜，其厚度為100_500nm。(3) Au膜上生物敏感膜的制備生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜，自組裝膜為11-巰基i^一烷酸，然后經(jīng)EDC+NHS活化形成的。優(yōu)選地，所述Au膜上生物敏感膜的制備，具體如下 · Au清洗，用1M/L NaOH水溶液清洗10分鐘，1M/L HCI水溶液清洗10分鐘，水、
無水乙醇清洗2次，干燥，臭氧紫外殺菌。
用10-30mMll-巰基i^一烷酸無水乙醇溶液浸泡，室溫3小時。無水乙醇清洗2次，N2氣干燥?！?EDC+NHS 活化用PH=7. 4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其濃度分別為O. 2M/L和50mM/L，然后取等體積的EDC和NHS溶液混合，室溫下活化40分鐘。 用PBS溶液(PH=7. 4)清洗樣品2_5次，室溫干燥。(4)腫瘤標志物單克隆抗體的固定將腫瘤標志物單克隆抗體溶液滴入Au膜上面，進行培育；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封閉，最后用PBS溶液清洗、室溫干燥。優(yōu)選地，所述腫瘤標志物單克隆抗體的固定，具體如下 腫瘤標志物單克隆抗體溶于PBS (PH=7.4)溶液中，濃度在O. 5-lmg/ml，用量為一次5-10ul。滴入Au膜上面，然后放入冰箱4°C過夜；或在蒸汽浴37°C下培育30分鐘，然后用PBS (PH=7. 4，含重量為1%的BSA)清洗2-5次。 封閉，用IOOul BSA溶液(含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的tween 20BSA溶液)封閉，冰箱4 °C放置2小時。 用PBS溶液清洗(PH=7. 4) 2-5次，室溫干燥。(5)抗原點樣將抗原溶液滴入Au膜上面，培育，然后用PBS溶液清洗，室溫下干燥。優(yōu)選地，所述抗原點樣，具體如下抗原用PBS溶液稀釋(PH=7. 4)，濃度為l-1000ng/ml，用量每次5_10ul，然后滴入Au膜上面，室溫下22°C培育I小時，或在蒸汽浴37°C下培育40分鐘，然后用PBS (含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室溫下干燥。(6)生物素化抗體固定將生物素化抗體溶液滴入Au膜上面，室溫培育，然后用PBS溶液清洗，室溫下干燥。優(yōu)選地，所述生物素化抗體固定，具體如下生物素化抗體濃度為O. 5-lmg/ml的PBS溶液，每次取5-lOul，然后滴入Au膜上面，室溫22°C下培育I小時，然后用PBS清洗5次，室溫下干燥。(7)磁性標簽固定將磁性標簽滴入Au膜上面，室溫下培育，然后用PBS溶液清洗，
室溫干燥。優(yōu)選地，所述磁性標簽固定，具體如下磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠。取濃度為lOug/ml磁性納米粒子標簽20-40ul，滴入Au膜上面，室溫下培育20-40分鐘，然后用PBS溶液清洗，室溫干燥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果(I)磁傳感器的制備技術(shù)可與半導(dǎo)體的CMOS技術(shù)兼容，從而可實現(xiàn)集成磁傳感器陣列，成本低、價格便宜，易于批量生產(chǎn)；(2)信號可通過集成的CMOS電路得到處理，直接將生物信息轉(zhuǎn)換為電信號，可實現(xiàn)即時分析，并具有很高的檢測靈敏度；(3)生物樣品本身不帶磁性，能提供一個很低噪聲的磁測量環(huán)境，相對于突光分子、放射性同位元素、酶等標簽，磁性標簽非常穩(wěn)定；
(4)在單一化驗中，陣列傳感器可實現(xiàn)對多目標分析物的同時檢測，具有快速、高靈敏探測的優(yōu)勢。( 5 )本發(fā)明制備得到的血清腫瘤標志物檢測系統(tǒng)具有檢測速度快、可重復(fù)使用、無特殊環(huán)境和存放要求、體積小、靈敏度高等優(yōu)點；不需要依賴于操作人員的生物學(xué)醫(yī)學(xué)經(jīng)驗以及龐雜、昂貴的熒光檢測設(shè)備，就可實現(xiàn)特定的生化分析或疾病診斷，這將有利于實現(xiàn)便攜式、成本低廉、快速診斷的生物醫(yī)學(xué)疾病檢測系統(tǒng)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例I :整個制備過程分如下幾步(I)微型化磁通門傳感器具體制作可以采用現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)，如專利號為200910046101. I中的記載方法，在此不再贅述。本實施例中，微型化磁通門感器包括玻璃基片、激勵線圈、接收線圈、磁芯、引腳、聚酰亞胺絕緣材料，閉合的矩形磁芯上對稱繞制兩組相連的三維螺線管激勵線圈，與激勵線圈垂直繞制一組三維螺線管接收線圈；激勵線圈位于玻璃基片上，由底層線圈、頂層線圈通過連接導(dǎo)體連接形成，激勵線圈的兩端連接引腳；接收線圈位于玻璃基片上，由底層線圈、頂層線圈通過連接導(dǎo)體連接形成，接收線圈的兩端連接引腳，激勵線圈和接收線圈均通過聚酰亞胺絕緣材料與磁芯絕緣隔離。磁芯、激勵線圈和接收線圈均由聚酰亞胺絕緣、支撐并完全包覆固定為一個整體，與空氣隔離，傳感器表面僅露出引腳。(2)在玻璃基片上濺射Cr/Au薄膜，其厚度為300nm。甩光刻膠、烘干、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠，使Au膜暴露在外面。(3) Au膜上生物敏感膜的制備。生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜，自組裝膜為11-巰基十一烷酸，然后經(jīng)EDC和NHS混合液活化形成的。具體如下· Au膜清洗，用1M/L NaOH水溶液清洗10分鐘，然后用1M/L HCI水溶液清洗10分鐘，最后用水、無水乙醇各清洗2次，室溫干燥，臭氧紫外殺菌。 用30mM 11_巰基^^一燒酸無水乙醇溶液浸泡室溫3小時,然后用無水乙醇清洗2次，N2氣干燥?！?EDC+NHS 活化用PH=7. 4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其濃度分別為O. 2M/L和50mM/L，然后取等體積的EDC和NHS溶液混合，室溫下活化40分鐘。 用PBS溶液(ΡΗ=7· 4)清洗樣品5次，室溫干燥。(4)腫瘤標志物單克隆抗體的固定，具體如下 腫瘤標志物單克隆抗體溶于PBS (ΡΗ=7.4)溶液中，濃度在O. 5mg/ml，用量為一次IOul。滴入Au膜上面，然后放入冰箱4°C過夜，然后用PBS(PH=7. 4，含重量為1%的BSA)溶液清洗5次。
封閉，用IOOul BSA溶液(含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的Tween20BSA溶液)封閉，冰箱4°C放置2小時。 用PBS溶液清洗(PH=7. 4) 5次，室溫干燥。(5)抗原點樣抗原用PBS溶液稀釋(ΡΗ=7·4)，濃度為1000ng/ml，用量每次5ul，然后滴入Au膜上面，室溫下22°C培育I小時，然后用PBS(含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的Tween20BSA溶液)溶液清洗2次，室溫下干燥。( 6 )生物素化抗體的固定取濃度為O. 5mg/ml生物素化抗體溶液,每次取IOul,然后滴入Au膜上面，室溫22°C下培育I小時，然后用PBS溶液清洗5次，室溫下干燥。(7)磁性標簽固定磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠。取濃度為10ug/ml磁性納米粒子標簽20ul，滴入Au膜上面，室溫下培育20分鐘，然后用PBS溶液清洗，室溫干燥。實施例2 (I)本發(fā)明的微型化磁通門傳感器具體制作可以采用現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)，如專利號為200910046101. I中的記載方法，在此不再贅述。(2)在玻璃基片上濺射Cr/Au薄膜，其厚度為500nm。甩光刻膠、烘干、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠，使Au膜暴露在外面。(3) Au膜上生物敏感膜的制備。生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜，自組裝膜為11-巰基十一烷酸，然后經(jīng)EDC和NHS混合液活化形成的。具體如下 · Au膜清洗，用1M/L NaOH水溶液清洗10分鐘，然后用1M/L HCI水溶液清洗10分鐘，最后用水、無水乙醇各清洗2次，室溫干燥，臭氧紫外殺菌。 用20mMll-巰基^^一燒酸無水乙醇溶液浸泡室溫3小時,然后用無水乙醇清洗2次，N2氣干燥?！?EDC+NHS 活化用PH=7. 4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其濃度分別為O. 2M/L和50mM/L，然后取等體積的EDC和NHS溶液混合，室溫下活化40分鐘。 用PBS溶液清洗樣品(PH=7. 4) 4次，室溫干燥。(4)腫瘤標志物單克隆抗體的固定，具體如下 腫瘤標志物單克隆抗體溶于PBS (PH=7. 4)溶液中，濃度在lmg/ml，用量為一次5ul。滴入Au膜上面，然在蒸汽浴37°C下培育30分鐘，然后用PBS (PH=7. 4，含重量為1%的BSA)溶液清洗5次。 封閉，用IOOul BSA溶液(含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的Tween20BSA溶液)封閉，冰箱4°C放置2小時。 用PBS溶液清洗(PH=7. 4) 5次，室溫干燥。(5)抗原點樣抗原用PBS溶液稀釋(PH=7. 4)，濃度為10ng/ml，用量每次IOuL,然后滴入Au膜上面，室溫下22°C培育I小時，然后用PBS (含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的TWeen20BSA溶液)溶液清洗2次，室溫下干燥。( 6 )生物素化抗體的固定取濃度為lmg/ml生物素化抗體溶液,每次取IOul,然后滴入Au膜上面,室溫22°C下培育I小時，然后用PBS溶液清洗5次,室溫下干燥。(7)磁性標簽固定磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠。取濃度為10ug/ml磁性納米粒子標簽30ul，滴入Au膜上面，室溫下培育40分鐘，然后用PBS溶液清洗，室溫干燥。實施例3 (I)微型化磁通門傳感器具體制作可以采用現(xiàn)有技術(shù)實現(xiàn)，如專利號為200910046101. I中的記載方法，在此不再贅述。(2)在玻璃基片上濺射Cr/Au薄膜，其厚度為lOOnm。甩光刻膠、烘干、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠，使Au膜暴露在外面。(3) Au膜上生物敏感膜的制備。生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜，自組裝膜為11-巰基十一烷酸，然后經(jīng)EDC和NHS混合液活化形成的。具體如下 · Au膜清洗，用1M/L NaOH水溶液清洗10分鐘，然后用1M/L HCI水溶液清洗10分鐘，最后用水、無水乙醇各清洗2次，室溫干燥，臭氧紫外殺菌。 用25mM/Lll_巰基i^一烷酸無水乙醇溶液室溫修飾3小時，然后用無水乙醇清洗2次，N2氣干燥?！?EDC+NHS 活化用PH=7. 4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其濃度分別為O. 2M/L和50mM/L，然后取等體積的EDC和NHS溶液混合，室溫下活化40分鐘。 用PBS溶液清洗樣品(ΡΗ=7· 4) 5次，室溫干燥。(4)腫瘤標志物單克隆抗體的固定，具體如下 腫瘤標志物單克隆抗體溶于PBS (ΡΗ=7. 4)溶液中，濃度lmg/ml，用量為一次IOul。滴入Au膜上面，在蒸汽浴37°C下培育30分鐘，然后用PBS (PH=7. 4，含重量為1%的BSA)溶液清洗5次。 封閉，用IOOul BSA溶液(含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的Tween20BSA溶液)封閉，冰箱4°C放置2小時。 用PBS溶液清洗(PH=7. 4) 5次，室溫干燥。(5)抗原點樣抗原用PBS溶液稀釋(PH=7. 4)，濃度為lng/ml，用量每次IOuL,然后滴入Au膜上面，室溫下22°C培育I小時，然后用PBS (含重量為1%的BSA，體積為O. 2%的TWeen20BSA溶液)溶液清洗2次，室溫下干燥。(6)生物素化抗體的固定取濃度為lmg/ml生物素化抗體溶液,每次取IOul,然后滴入Au膜上面,室溫22°C下培育I小時，然后用PBS溶液清洗5次,室溫下干燥。(7)磁性標簽固定磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠。取濃度為10ug/ml磁性納米粒子標簽30ul，滴入Au膜上面，室溫下培育30分鐘，然后用PBS溶
液清洗，室溫干燥。以上實施例制備得到的一種血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，該生物傳感器包括位于玻璃基片上的微型化磁通門傳感器、生物芯片，其中所述生物芯片位于微型化磁通門傳感器的敏感軸上，由位于玻璃基片上的Au膜、Au膜上的生物敏感膜、生物敏感膜上的磁性標簽組成。這些部件配合施加軸向磁場的螺線管線圈以及與微型化磁通門傳感器連接的信號采集系統(tǒng)，實現(xiàn)生物檢測。該生物傳感器檢測抗原的原理是采用雙抗夾心法。采用自組裝膜技術(shù)固定單克隆抗體，單克隆抗體與抗原結(jié)合，帶有鏈酶親和素的磁性標簽與生物素化的多克隆抗體結(jié)合，由于抗原-抗體的免疫反應(yīng)，磁性標簽被標記到Au膜的表面上。一旦有極微量的被檢測生物分子(抗原)存在時，在外磁場作用下， 磁性標簽產(chǎn)生的彌散磁場將導(dǎo)致傳感器的電壓信號變化，從而實現(xiàn)對相應(yīng)生物分子的高靈敏度檢測。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，包括如下步驟(1)采用MEMS工藝在玻璃基片上制作微型化磁通門傳感器；(2)在玻璃基片上濺射Cr/Au薄膜，然后甩光刻膠、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠，使Au膜暴露在外面；(3)Au膜上生物敏感膜的制備生物敏感膜為一層納米級厚度的自組裝膜，自組裝膜為11-巰基i^一烷酸，然后經(jīng)EDC+NHS活化形成的；(4)腫瘤標志物單克隆抗體的固定將腫瘤標志物單克隆抗體溶液滴入Au膜上面，放入冰箱過夜；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封閉，最后用PBS溶液清洗、室溫干燥；(5)抗原點樣將抗原溶液滴入Au膜上面，培育，然后用PBS溶液清洗，室溫下干燥；(6)生物素化抗體固定將生物素化抗體溶液滴入Au膜上面，室溫培育，然后用PBS溶液清洗，室溫下干燥；(7)磁性標簽固定將磁性標簽滴入Au膜上面，室溫下培育，然后用PBS溶液清洗，室溫干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(I)中，所述微型化磁通門傳感器的磁芯為NiFe薄膜、非晶或納米晶軟磁帶材材料，并采用MEMS工藝進行加工。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(2)中，所述Cr/Au薄膜，其厚度為100-500nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(3)中，所述Au膜上生物敏感膜的制備，具體如下 Au清洗，用1M/L NaOH水溶液清洗10分鐘，1M/L HCI水溶液清洗10分鐘，水、無水乙醇清洗2次，干燥，臭氧紫外殺菌； 用10-30mMll-巰基i^一烷酸無水乙醇溶液浸泡，室溫3小時，無水乙醇清洗2次，N2氣干燥； EDC+NHS活化，用PH=7. 4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其濃度分別為O. 2M/L和50mM/L,然后取等體積的EDC和NHS溶液混合，室溫下活化40分鐘； 用PH=7. 4的PBS溶液清洗樣品2-5次，室溫干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(4)，所述腫瘤標志物單克隆抗體的固定，具體如下 腫瘤標志物單克隆抗體溶于PH=7. 4的PBS溶液中，濃度在O. 5-lmg/ml，用量為一次5-10ul，滴入Au膜上面，然后放入冰箱4°C過夜；或在蒸汽浴37°C下修飾30分鐘，然后用PBS溶液清洗2-5次，此處PBS溶液的PH=7. 4且含重量為1%的BSA ； 封閉，用IOOul BSA溶液封閉，冰箱4°C放置2小時，所述BSA溶液含重量為1%的BSA、體積為 O. 2% 的 tween20 ； 用PH=7. 4的PBS溶液清洗2-5次，室溫干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(5)中，所述抗原點樣，具體如下抗原用PH=7. 4的PBS溶液稀釋，濃度為l-1000ng/ml，用量每次5-lOul，然后滴入Au膜上面，室溫下22°C培育I小時，或在蒸汽浴37°C下培育40分鐘，然后用含有重量為1%的BSA、體積為O. 2%的tween20的PBS溶液清洗2次，室溫下干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(6)中，所述生物素化抗體固定，具體如下生物素化抗體濃度為O. 5-lmg/ml的PBS溶液，每次取5-lOul，然后滴入Au膜上面，室溫22°C下培育I小時，然后用PBS溶液清洗5次，室溫下干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，其特征在于，步驟(7)中，所述磁性標簽固定，具體如下磁性標簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由磁性納米粒子構(gòu)成的磁珠，取濃度為10ug/ml磁性納米粒子標簽20-40ul，滴入Au膜上面，室溫下培育20-40分鐘，然后用PBS溶液清洗，室溫干燥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種血清腫瘤標志物檢測的微型化磁通門生物傳感器制作方法，步驟為(1)采用MEMS工藝在玻璃基片上制作微型化磁通門傳感器；(2)在玻璃基片上濺射Cr/Au薄膜，然后甩光刻膠、曝光、顯影、刻蝕Cr/Au膜、去膠，使Au膜暴露在外面；(3)Au膜上生物敏感膜的制備；(4)腫瘤標志物單克隆抗體的固定；(5)抗原點樣；(6)生物素化抗體固定；(7)磁性標簽固定。本發(fā)明將微型化磁通門傳感器用于血清腫瘤標志物檢測，檢測速度快，易于批量生產(chǎn)，可以滿足現(xiàn)有臨床應(yīng)用的需求。
文檔編號G01N27/72GK102935996SQ201210397950
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者周勇, 雷沖, 雷劍 申請人:上海交通大學(xué)