專利名稱：乳香藥材指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材指紋圖譜的建立方法，尤其是乳香藥材HPLC-ELSD指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的乳香藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中藥指紋圖譜特指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。指紋圖譜技術(shù)是評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的重要手段，有利于實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化。美國(guó)食品藥品管理局在1996年制定的《FDA關(guān)于植物制品的指南》中，要求對(duì)植物原料、植物藥中間品和植物藥產(chǎn)品提供相應(yīng)的指紋圖譜。世界衛(wèi)生組織(WHO)在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中也規(guī)定，如果草藥的活性成分不明確，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)瞀管理部門于2000年發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，明確要求對(duì)新申報(bào)的中藥注射劑和已上市的中 藥注射劑實(shí)行指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描法(TLCS)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)等色譜法以及紫外光譜法(UV)、紅外光譜法(IR)、質(zhì)譜法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射線衍射法等光譜法。其中色譜法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認(rèn)的三種常規(guī)分析手段。中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。乳香為橄欖科植物卡氏乳香樹(shù)的膠樹(shù)脂，具有調(diào)氣活血、定痛、消腫、生肌之功效，臨床主要用于治氣血瘀滯,心腹疼痛,癰瘡腫毒,跌打損傷,風(fēng)濕痹痛,痛經(jīng),產(chǎn)后瘀血刺痛等。乳香所含成分復(fù)雜，主要成分含樹(shù)脂60% 70%，樹(shù)膠27% 35%，揮發(fā)油3% 8%，樹(shù)脂的主要成分為游離α -乳香酸、β -乳香酸、結(jié)合乳香脂酸、乳香樹(shù)脂烴，樹(shù)膠為阿糖酸的鈣鹽和鎂鹽、西黃芪膠黏素和苦味質(zhì)，揮發(fā)油含菔烯、莰烯、香檜烯、欖香烯、消旋-檸檬烯等。由于受氣候、產(chǎn)地等因素的影響，不同乳香藥材所含成分也存在一定差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種乳香藥材指紋圖譜的建立方法，以及由此方法得到的乳香藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明通過(guò)對(duì)乳香藥材高效液相色譜指紋圖譜的研究，提出了ー種較好的乳香藥材質(zhì)量控制方法，使乳香藥材的質(zhì)量控制更加完善和科學(xué)。本發(fā)明乳香藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟
(I)供試品溶液的制備精密稱取藥材粉末10g，置具塞容器中，加入80% 100%的甲醇IOOml 800ml，超聲震蕩20min 45min，冷卻后取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。(2)高效液相色譜分析色譜柱填料5 μ m Fortis-C18, 520X4. 6mm ;流動(dòng)相1%冰醋酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式Omin — lOmin —20min —35min —45min —70min —80min—IOOmin — IIOmin — 125min,甲醇 60% — 60% — 75% — 85% — 85% — 88% — 90% — 95% — 100% — 100% ;流速0. 8 ml/min I. 2ml/min ;柱溫25°C 40°C;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,漂移管溫度80°C 100°C，氣體流速2. O L/min 3. O L/min ;進(jìn)樣量為5 μ I 50 μ I ;記錄140分鐘的色譜圖，得到乳香藥材的指紋圖譜。(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定按照本發(fā)明提供的方法，對(duì)不同來(lái)源的12批乳香藥材建立了 HPLC-ELSD指紋圖譜，通過(guò)分析比較，確定了 15個(gè)共有特征峰，以參照物3號(hào)峰即11-羰基-β -こ酰乳香酸峰為R峰，計(jì)算各共有特征峰與R峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%內(nèi)，規(guī)定值為0. 801 (峰1)、0.813 (峰2)、1.000 (峰R)、1.039 (峰4),1. 096 (峰 5)、I. 188 (峰 6)、I. 225 (峰 7)、I. 297 (峰 8)、I. 354 (峰 9)、I. 468 (峰 10)、I. 538 (峰 11),1. 690 (峰 12),1. 715 (峰 13),1. 856 (峰 14),1. 919 (峰 15)，這些共有特征峰構(gòu)成了乳香藥材的指紋特征，可作為乳香藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明具有如下顯著的優(yōu)點(diǎn)和用途
(1)將乳香藥材作為ー個(gè)整體對(duì)待，注重各個(gè)構(gòu)成指紋特征峰的前后順序和相互關(guān)系， 注重整體面貌特征，避免了因只測(cè)定其中ー個(gè)或兩個(gè)化學(xué)成分而判斷乳香藥材整體質(zhì)量的片面性，減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而人為處理的可能性。通過(guò)比較其共有峰可以找出不同藥材之間的細(xì)微差別，為完整、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)乳香藥材的質(zhì)量提供了新的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，從而能更好的控制乳香藥材的質(zhì)量；
(2)本發(fā)明具有測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、精密度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點(diǎn)；
(3)流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單，色譜條件容易實(shí)現(xiàn)；
(4)適用于對(duì)乳香藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地和質(zhì)量的鑒別和控制。


圖I是本發(fā)明提供的乳香藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，圖中從左到右分別標(biāo)出了其共有特征峰I至15號(hào)；
圖2是不同來(lái)源的12批乳香藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它實(shí)施方案，本發(fā)明實(shí)施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主g及范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，但只要使用本發(fā)明所述的質(zhì)量控制方法，均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例一檢測(cè)乳香藥材的指紋圖譜 (I)儀器與試劑
儀器島津LC-20A高效液相色譜儀，包括LC-20AT四元梯度泵、D⑶_20A5在線脫氣機(jī)、CT0-10AS柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LCsolution工作站；Alltech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；HT-300型超聲振蕩器(濟(jì)寧海騰超聲電子設(shè)備有限公司);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。試劑甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)，冰醋酸(分析純，天津市巴斯夫化工有限公司)，娃哈哈純凈水。
(2)供試品溶液的制備精密稱取藥材粉末5g，置具塞容器中，加入90%的甲醇200ml，超聲震蕩45min，取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。(3)高效液相色譜分析色譜柱填料5 μ m Fortis-C18, 520X4. 6mm ;流動(dòng)相1%冰醋酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脫方式Omin— lOmin —20min —35min —45min —70min —80min— lOOmin— llOmin— 125min，甲醇60% —60%—75% —85% —85% —88% —90% —95%— 100% —100% ;流速I. Oml/min ;柱溫30°C;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度85°C，氣體流速
2.3 L/min ;進(jìn)樣量為 20 μ I。(4)測(cè)定精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20 μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測(cè)定，記錄140分鐘的色譜圖，即得乳香藥材的指紋圖譜，如圖I所示。實(shí)施例ニ 檢測(cè)不同來(lái)源的12批乳香藥材的指紋圖譜
(I)取不同來(lái)源的12批乳香藥材，按實(shí)施例一的條件進(jìn)行檢測(cè)，得到12批樣品的 HPLC-ELSD指紋圖譜，如圖2所示。通過(guò)12批乳香藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜的比較，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，共確定了 15個(gè)共有特征峰，以參照物3號(hào)峰即11-羰基-β-こ酰乳香酸峰為R峰，計(jì)算各共有特征峰與R峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%內(nèi)，規(guī)定值為:0.801 (峰 1)、0.813 (峰 2)、1.000 (峰 R)、1.039 (峰 4)、1·096 (峰 5)、1·188 (峰6),1. 225 (峰 7),1. 297 (峰 8)、1· 354 (峰 9)、1· 468 (峰 10),1. 538 (峰 11),1. 690 (峰 12)、
I.715 (峰13)、I. 856 (峰14)、I. 919 (峰15)，這些共有特征峰構(gòu)成了乳香藥材的指紋特征，可作為乳香藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。(2)相似度評(píng)價(jià)采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件(2004A版)對(duì)圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表I。表I HPLC-ELSD指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種乳香藥材高效液相色譜法指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟 (1)供試品溶液的制備精密稱取藥材粉末10g，置具塞容器中，加入80% 100%的甲醇IOOml 800ml，超聲震蕩20min 45min，冷卻后取上清液用O. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液； (2)指紋圖譜的制作色譜分離柱填料為5μ m FortiS-C18, 250X4. 6mm ;流動(dòng)相為1%冰醋酸水溶液-甲醇；采用梯度洗脫方式Omin — lOmin —20min —35min —45min —70min —8Omin— lOOmin— llOmin— 125min，甲醇60% —60%— 75% —85% —85% —88% —90% —95%— 100%—100% ;流速0. 8 ml/min I. 2ml/min ;柱溫25°C 40°C;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,漂移管溫度80°C 100°C，氣體流速I. O L/min 3. O L/min ;進(jìn)樣量為5μ I 50 μ I ;記錄140分鐘的色譜圖，得到乳香藥材的指紋圖譜； (3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定確定了15個(gè)共有特征峰，以參照物3號(hào)峰即11-羰基-β-乙酰乳香酸峰為R峰，計(jì)算各共有特征峰與R峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的 ±5% 內(nèi)，規(guī)定值為:0.801 (峰 1)、0.813 (峰 2)、1.000 (峰 R)、1.039 (峰 4)、1·096 (峰5),1. 188 (峰 6),1. 225 (峰 7),1. 297 (峰 8),1. 354 (峰 9),1. 468 (峰 10),1. 538 (峰 11)、I.690 (峰12)、1.715 (峰13)、1.856 (峰14)、1.919 (峰15)，這些共有特征峰構(gòu)成了乳香藥材的指紋特征，作為乳香藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乳香藥材高效液相色譜法指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。首先，取乳香藥材粉末，加入95%甲醇水溶液，超聲提取，并將上清液用微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。然后，進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜柱為Fortis-C18(5μm，250×4.6mm)，流動(dòng)相為1%冰醋酸水溶液-甲醇；采用梯度洗脫方式；柱溫30℃；檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度81℃；氣體流速2.1L/min。吸取供試品溶液進(jìn)樣，得到乳香藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜。通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的12批乳香藥材HPLC-ELSD指紋圖譜的比對(duì)，確定其共有指紋特征，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。利用標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以有效監(jiān)控乳香藥材的質(zhì)量。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102809616SQ20121029744
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者李潔, 路杰, 許飛, 崔美蘭, 劉杰, 高希波 申請(qǐng)人:山東齊都藥業(yè)有限公司