專利名稱：木豆葉藥材指紋圖譜的建立及其指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥藥材的質(zhì)量控制方法，具體涉及木豆葉藥材高效液相色譜法指紋圖譜的構(gòu)建方法和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù)：
木豆葉為豆科植物木豆iCajanus cajan (L. )MiIlsp)的干燥葉片及嫩枝。木豆英文常用名為Pigeonpea，別名黃豆樹、豆蓉樹、三葉豆、千年豆、樹豆、蓉豆、柳豆、花豆、米豆等，主要分布于長江以南的海南、云南、廣西、貴州、廣東以及福建、湖南、四川、江西、浙江、 臺灣等省區(qū)，資源較豐富?！蛾懘ū静荨酚涊d木豆葉“平、淡、有小毒”?！吨腥A藥海》對此作了進一步說明木豆葉“平、淡、有小毒、入心徑”主治小兒水痘、痛腫。民間常將木豆葉用于治療外傷、燒傷感染、褥瘡、止痛、消腫、止血等，取得了很好的療效。木豆葉中主要含有牡荊苷、 異牡荊苷等多種黃酮類成分，具有降血壓、止痙攣、抗感染、抗菌、輻射保護以及清除自由基的作用。以木豆葉為君藥組成的復(fù)方具有補腎健骨、活血祛瘀、消炎鎮(zhèn)痛及提高免疫功能等作用。此外木豆葉水提物還可以改善去勢大鼠血管內(nèi)皮功能、保護大鼠、小鼠由腦缺血、缺氧造成的損傷。
木豆葉水提物的臨床療效明顯，作用確切，是一味很有研究價值的中草藥，但其化學(xué)成分眾多，藥理作用廣泛。目前，木豆葉水提物的質(zhì)量控制多采用牡荊苷、異牡荊苷作為指標(biāo)。但是，僅僅依靠單一或幾個化學(xué)成分并不足以反映藥材的整體質(zhì)量。指紋圖譜現(xiàn)已成為當(dāng)前中藥支鏈研究的一個熱點，它是中藥生產(chǎn)質(zhì)量的一種新型標(biāo)準(zhǔn)，可以確保中藥的一致性、療效的安全性及可靠性，能夠全面反映中藥材所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，從整體上控制藥材的質(zhì)量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為木豆葉藥材的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供一個新的方法，通過建立木豆葉藥材指紋圖譜的方法，并由此方法得到木豆葉藥材共有模式的指紋圖譜。
為達到本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案用高效液相色譜法建立木豆葉藥材指紋圖譜的方法，具體包括如下步驟(a)對照品溶液的制備精密稱取牡荊苷對照品，用甲醇配制成每ImL含牡荊苷O.05 O.2mg的溶液，作為對照品溶液；(b)供試品溶液的制備精密稱取木豆葉藥材粗粉，加入蒸餾水回流提取，濾過，取續(xù)濾液適量濾膜濾過，即得供試品溶液；(c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為甲醇與冰醋酸組成的梯度洗脫液；紫外檢測波長為220 300nm ；(d)測定精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
進一步優(yōu)選的方法可以通過下述步驟實施(a)對照品溶液的制備精密稱取牡荊苷對照品，用甲醇配制成每ImL含牡荊苷O.05 O.2mg的溶液，作為對照品溶液；(b)供試品溶液的制備精密稱取木豆葉藥材粗粉(二號篩)1.O 5. Og,置于100 500mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水50 250mL，密塞，回流提取lh，放冷，濾過，濾液用蒸餾水定容至100 250mL，適量濾膜濾過，即得供試品溶液；(c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采·用梯度洗脫，流動相為甲醇與1. 0% 3. 0%冰醋酸組成的梯度洗脫液；柱溫20 40°C ;紫外檢測波長為220 300nm ;流速0. 5 1. 2mL · mirf1 ;時間IOOmin 140min ；(d)測定精密吸取供試品溶液10 20 μ L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
本發(fā)明最佳的檢測方法可以通過下述步驟實施(b)供試品溶液的制備精密稱取木豆葉藥材粗粉(二號篩)5.0g，置于250mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水IOOmL,密塞，回流提取lh，放冷，濾過，濾液用蒸餾水定容至IOOmL, 以0. 22 μ m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；(c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為甲醇與1.0%冰醋酸組成的梯度洗脫液，柱溫40°C ;檢測波長為268nm ;流速為1. OmL · mirT1 ;分析時間為 125min。
在步驟(c)中，所述的梯度洗脫，優(yōu)選梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行O分鐘時，流動相A為10%的甲醇溶液、流動相B為90%的1. 0%的冰醋酸水溶液；10分鐘時，流動相A為20%的甲醇溶液、流動相B為80%的1. 0%的冰醋酸水溶液 10分鐘時，流動相A為22%的甲醇溶液、流動相B為78%的1. 0%的冰醋酸水溶液 40分鐘時，流動相A為24%的甲醇溶液、流動相B為76%的1. 0%的冰醋酸水溶液 65分鐘時，流動相A為33%的甲醇溶液、流動相B為67%的1. 0%的冰醋酸水溶液 80分鐘時，流動相A為70%的甲醇溶液、流動相B為30%的1. 0%的冰醋酸水溶液 100分鐘時，流動相A為80%的甲醇溶液、流動相B為20%的1. 0%的冰醋酸水溶液； 115分鐘時，流動相A為93%的甲醇溶液、流動相B為17%125分鐘時，流動相A為100%的甲醇溶液、流動相B為0%
具體見下表的1.0%的1.0%的1.0%的冰醋酸水溶液； 的冰醋酸水溶液。
權(quán)利要求
1.一種木豆葉藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于采用高效液相色譜法，具體包括如下步驟 (a)對照品溶液的制備精密稱取牡荊苷對照品，用甲醇配制成每ImL含牡荊苷0.05 0. 2mg的溶液，作為對照品溶液； (b)供試品溶液的制備精密稱取木豆葉藥材粗粉，加入蒸餾水回流提取，濾過，取續(xù)濾液適量濾膜濾過，即得供試品溶液； (c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為甲醇與冰醋酸組成的梯度洗脫液；紫外檢測波長為220 300nm ； (d)測定精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
2.如權(quán)利要求I所述的木豆葉藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于 所述步驟 (a)對照品溶液的制備精密稱取牡荊苷對照品，用甲醇配制成每ImL含牡荊苷0.05 0. 2mg的溶液，作為對照品溶液； (b)供試品溶液的制備精密稱取木豆葉藥材粗粉(二號篩)I.0 5. Og,置于100 500mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水50 250mL，密塞，于100°C水浴中回流lh，放冷，濾過，濾液用蒸餾水定容至100 250mL，適量濾膜濾過，即得供試品溶液； (c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為甲醇與I. 0% 3. 0%冰醋酸組成的梯度洗脫液；柱溫20 40°C ;紫外檢測波長為220 300nm ;流速0. 5 I. 2mL mirf1 ;時間IOOmin 140min ； (d)測定精密吸取供試品溶液10 20 ii L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
3.如權(quán)利要求I所述的木豆葉藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于 所述步驟 (b)供試品溶液的制備精密稱取木豆葉藥材粗粉(二號篩)5.0g，置于250mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水IOOmL,密塞，回流提取lh，放冷，濾過，濾液用蒸餾水定容至IOOmL,以0. 22 y m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液； (c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為甲醇與I.0%冰醋酸組成的梯度洗脫液，柱溫40°C ;檢測波長為268nm ;流速為I. OmL mirT1 ;分析時間為125min0
4.如權(quán)利要求3所述的木豆葉藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于 步驟(C)色譜條件中所述的梯度洗脫，梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行 ·0分鐘時，流動相A為10%的甲醇溶液、流動相B為90%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·10分鐘時，流動相A為20%的甲醇溶液、流動相B為80%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·10分鐘時，流動相A為22%的甲醇溶液、流動相B為78%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·40分鐘時，流動相A為24%的甲醇溶液、流動相B為76%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·65分鐘時，流動相A為33%的甲醇溶液、流動相B為67%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·80分鐘時，流動相A為70%的甲醇溶液、流動相B為30%的I. 0%的冰醋酸水溶液； ·100分鐘時，流動相A為80%的甲醇溶液、流動相B為20%的I. 0%的冰醋酸水溶液；115分鐘時，流動相A為93%的甲醇溶液、流動相B為17%的I. 0%的冰醋酸水溶液； 125分鐘時，流動相A為100%的甲醇溶液、流動相B為0%的I. 0%的冰醋酸水溶液。
5.一種如權(quán)利要求I所述的指紋圖譜的建立方法所得木豆葉藥材的指紋圖譜，其特征在于指紋圖譜中有12個特征共有峰，其中S號色譜峰為牡荊苷參照峰，最強峰為6號色譜峰，圖譜總長度為125min，具體如下 I號峰，平均相對保留時間RRT為O. 5832，RSD為O. 14%，平均相對峰面積RPA為I. 9761，RSD 為 42. 34% ； 2號峰，平均相對保留時間RRT為O. 6455，RSD為O. 11%，平均相對峰面積RPA為I. 8675，RSD 為 47. 96% ； 3號峰，平均相對保留時間RRT為O. 6632，RSD為O. 11%，平均相對峰面積RPA為2. 8239，RSD 為 46. 81% ； 4號峰，平均相對保留時間RRT為O. 7834，RSD為O. 07%，平均相對峰面積RPA為2. 6873，RSD 為 49. 52% ； 5號峰，平均相對保留時間RRT為O. 8132，RSD為O. 08%，平均相對峰面積RPA為2. 9968，RSD 為 34. 89% ； 6號峰，平均相對保留時間RRT為O. 8720，RSD為O. 51%，平均相對峰面積RPA為3. 2290，RSD 為 39. 56% ； 7號峰，平均相對保留時間RRT為I. 0587，RSD為O. 00%,平均相對峰面積RPA為I. 2261，RSD 為 55. 55% ； 8號峰，平均相對保留時間RRT為I. 1262，RSD為O. 03%，平均相對峰面積RPA為O. 7136，RSD 為 33. 81% ； 9號峰，平均相對保留時間RRT為I. 1852，RSD為O. 05%，平均相對峰面積RPA為I. 0179，RSD 為 14. 74% ； 10號峰，平均相對保留時間RRT為2. 0149，RSD為O. 12%,平均相對峰面積RPA為.2.4653，RSD 為 58. 56% ； 11號峰，平均相對保留時間RRT為2. 4052，RSD為O. 20 %，平均相對峰面積RPA為I.0804，RSD 為 55. 30%。
全文摘要
本發(fā)明木豆葉藥材指紋圖譜的建立及其指紋圖譜，涉及中藥藥材的質(zhì)量控制方法，具體是建立HPLC指紋圖譜以檢測木豆葉藥材提取液的方法。方法包括(a)對照品溶液的制備；(b)供試品溶液的制備；(c)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為甲醇與1.0%～3.0%冰醋酸組成的梯度洗脫液；柱溫20～40℃；紫外檢測波長為220～300nm；流速0.5～1.2mL·min-1；時間100min～140min；(d)測定高效液相色譜法測得指紋圖譜。本發(fā)明的有益效果能有效表征木豆葉藥材的質(zhì)量，有利于監(jiān)控藥材的質(zhì)量；具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好；可快速、準(zhǔn)確地鑒別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。
文檔編號G01N30/88GK102980965SQ201210270949
公開日2013年3月20日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者黃松, 丁婕, 賴小平, 陳建南, 詹麗玲, 孫琳, 李婧, 王培培 申請人:東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院