專利名稱：一種檢測ngal膠體金試紙條及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學診斷領域，具體涉及ー種檢測中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術：
繼發(fā)于腎小管細胞損傷(包括缺血性損傷或腎毒性損傷)的急性腎功能衰竭(AFR)，盡管在支持治療法中取得了重大的進展，但是仍然是臨床醫(yī)學和腎病學中普遍而潛在破壞性的難題，該疾病具有持續(xù)的死亡率和高發(fā)病率的特點。研究表明，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)作為Iipocalin家族的ー個新的成員，是診斷急性腎損傷的重要標志物之一。美國專利2004/0219603描述了中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)最為檢測腎小管細胞損傷早期發(fā)作的尿生物標記物。 近年美國臨床化學協(xié)會(AACC)年度會議的研究結果發(fā)表得知檢測尿中中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白可能有助于臨床醫(yī)生檢測心臟移植患者環(huán)孢霉素誘導的毒性，以及調節(jié)環(huán)孢霉素劑量以預防其對腎臟造成的不可逆?zhèn)?。Kim RW等表明心臟手術后尿及血中的NGAL在術后6小時達到最高水平，且尿NGAL及血NGAL水平與術后急性腎損傷AKI及不良預后相關。目前，檢測NGAL的方法主要有免疫吸附劑測定法(ELISA)，中國專利CN101566633涉及膠乳增強免疫比濁法、夾心法ELISA、競爭法ELISA來測定NGAL的水平。然而，該方法對檢測設備有一定要求，操作繁瑣，檢測時間長，不能對急性腎功能衰竭進行快速早期預測，不能用于床邊快速診斷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供ー種特異性強、結果準確、操作簡單，適合床邊快速診斷的檢測NGAL膠體金試紙條及其制備方法，為急性腎功能衰竭進行早期預測提供一種簡單的檢測診斷方法及工具。為解決該問題，本發(fā)明采用以下技術方案得以實現(xiàn)
一種檢測NGAL膠體金試紙條，包括塑料底襯、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上設有相互平行的質控線和檢測線；所述的質控線上含有兔抗人IgG抗體，所述檢測線含有ー種NGAL單克隆抗體，所述的金標墊上有金標記的另ー種NGAL單克隆抗體。所述的檢測線上的NGAL單克隆抗體和金標墊上的另ー種NGAL單克隆抗體由雜交瘤細胞株3B1和雜交瘤細胞株4B2分泌產生。雜交瘤細胞株3B1和雜交瘤細胞株4C2來源于南京基蛋生物科技有限公司，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號分別為CCTCC NO C201249 和 CCTCC NO :C201250，保藏日期均為 2012 年 5 月 9 日。所述檢測線上的ー種NGAL單克隆抗體和金標墊上的金標記的另ー種NGAL單克隆抗體能夠相互配對。
所述ー種NGAL單克隆抗體為3B1，金標記的另ー種NGAL單克隆抗體為4C2。所述ー種NGAL單克隆抗體為4C2，金標記的另ー種NGAL單克隆抗體為3B1。制備ー種檢測NGAL膠體金試紙條的制備方法，其步驟包括
1)將ー種NGAL單克隆抗體液噴到硝酸纖維素膜上形成檢測線，將兔抗人IgG抗體液噴到硝酸纖維素膜的另一區(qū)域形成 質控線；
2)將另ー種NGAL單克隆抗體加到膠體金中，得到膠體金——抗體復合物溶液,將該復合物溶液涂覆玻璃纖維素膜或聚酯膜上得到金標墊；
3)將塑料底襯、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊進行粘貼，組裝成檢測NGAL膠體金試紙條。所述的硝酸纖維素膜包被過程中，NGAL單克隆抗體液是用20mmol/L、pH7. 4的PB(磷酸氫ニ鈉，磷酸ニ氫鈉)緩沖液稀釋到2. 0mg/mlo雜交瘤細胞株3B1和雜交瘤細胞株4C2分泌產生的單克隆抗體具有不同的表位，已通過雙抗夾心法進行了鑒定。所述的質控線包被兔抗人IgG抗體。所述金標墊與樣品墊的材料為聚酯膜、玻璃纖維膜。本發(fā)明利用雙抗夾心原理來檢測NGAL的含量，根據檢測線上條帶顏色來判斷樣品液中NGAL的含量，質控線上如果沒有紫紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條失效。本發(fā)明的檢測NGAL膠體金試紙條具有以下優(yōu)點I)與目前ELISA法檢測NGAL試劑盒相比，不需要專業(yè)人員，可直接觀察得到結果，也可以根據FIA8000系列免疫定量分析儀在十分鐘內得到定量結果；2)檢測方法簡單，快速，適用于NGAL床邊快速診斷。本發(fā)明對急性腎功能衰竭進行快速早期預測，應用前景廣闊。


圖I為ー種用于檢測NGAL膠體金試紙條結構示意圖。圖2為ー種用于檢測NGAL膠體金試紙條檢測模式圖。圖3為本發(fā)明實施例I制備的試紙條的線性范圍相關性。圖4為本發(fā)明實施例I制備的試紙條與雅培ARCHITECT尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白測定試劑盒檢測結果相關性。其中，I.塑料底襯；2.硝酸纖維素膜；3.金標墊；4.樣品墊；5.吸水墊；6.質控線；7.檢測線；8.樣品槽；A.層析方向。
具體實施例方式 下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進ー步詳細的闡述。以下對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明的具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。實施例I檢測NGAL膠體金試紙的制備 I、膠體金一抗體復合物的制備
(I)配制氯金酸水溶液將IOg氯金酸IOOOml的三蒸水溶解,配制成1%的水溶液，置于4°C備用，有效期3個月；(2)配制檸檬酸三鈉用三蒸水溶解檸檬酸三鈉，配制1%的水溶液，用0.22 u膜濾過，置于4°C備用，有效期7天；
(3)配制1%碳酸鉀水溶液將Ig碳酸鉀用IOOml用三蒸水溶解，用0.22 u膜濾過，置于4°C備用，有效期7天；
(4)配制金標抗體保存液將15g的蔗糖，20iU的疊氮鈉，在IOOmlpH7. 4的1%BSA溶解，用0.22U膜濾過，置于4°C備用，有效期7天；
(5)制備膠體金顆粒用三蒸水將1%氯金酸稀釋成0.01%,置于95°C反應10分鐘，加入Iml檸檬酸三鈉，繼續(xù)反應15分鐘，待膠體金溶液顏色由藍經紫變紅后，冷卻后加入2ml1%碳酸鉀溶液備用。外觀應純凈，透亮，無沉淀和漂浮物；
(6)制備膠體金一抗體復合物用1%碳酸鉀溶液調節(jié)膠體金pH值至7.5,按照10 ii g鏈親和素/ml膠體金的量加入鏈親和素溶液充分混勻，置于25°C水浴反應30分鐘后再加入5%BSA,封閉20分鐘后，離心取沉淀，用BSA恢復其終濃度為1%，4°C保存?zhèn)溆?。?0 y g 單抗-生物素/ml膠體金的量將NGAL單克隆抗體3B1 (或NGAL單克隆抗體4C2)-生物素加入膠體金中，37°C攪拌反應40分鐘，加入5%BSA,封閉攪拌20分鐘，6000r/min離心20分鐘，棄上清，沉淀以金標抗體保存液恢復體積，4 °C保存。2、免疫層析試紙條的組裝 (I)硝酸纖維素膜的處理
檢測線的制備將NGAL單克隆抗體4C2 (或NGAL單克隆抗體3B1)用20mmol/L pH7. 2的PB (磷酸氫ニ鈉，磷酸ニ氫鈉)緩沖液稀釋到2. Omg/ml的濃度，0. 8 yl/cm在硝酸纖維素膜上劃線，在干燥箱內20°C鼓風干燥12h。質控線的制備將兔抗人IgG抗體按4mg/ml的濃度，0. 8 U 1/cm在硝酸纖維素膜上劃質控線，該線與檢測線平行，兩線間隔4mm，然后在干燥箱內20°C鼓風干燥12h，密封干燥保存。(2)金標墊的制備
金標墊的預處理將制作金標墊的材料玻璃纖維素膜或聚酯膜放入金標緩沖液(20mMPBS+1%酪蛋白+1%PVP+1%蔗糖+0. 2%Triton)中浸泡2 4小時，取出后，25°C干燥8小時。將采用不同于檢測線所用的抗體NGAL單克隆抗體3B1 (或NGAL單克隆抗體4C2)的膠體金一抗體復合物用噴金儀均勻的鋪在處理好的金標墊上，噴量I. 0iil/cm，25°C干燥4 8小時,密封干燥保存。(3)樣品墊的制備
將樣品墊用IOOmM PBS緩沖液浸泡2 4小時，取出后25°C干燥8小時。(4)吸水墊的制備
吸水紙裁剪成30*2. 7cm每條。(5)組裝
塑料底村，樣品墊和吸水紙為本領域通用的部件。將上述硝酸纖維素膜，吸水墊，金標墊，樣品墊粘貼在塑料底襯上(如附圖I)。將貼好的中間物用斬切機切成5. 6cm寬的試紙條。實施例2檢測NGAL膠體金試紙的使用 I.定性檢測把待檢樣品滴加在本試紙的樣品墊上，當待檢樣品進入測試端吋，由于毛細效應，液體沿著層析方向A移動。若在試紙的質控線和檢測線的位置處分別出現(xiàn)一條紫紅色的條帶，表明待檢液中含有相應的抗原即為陽性樣品；若僅在試紙的質控線位置處出現(xiàn)紫紅色的條帶，表明待檢液中含有相應的抗原在檢測下限以下即為陰性樣品；若在試紙的質控線和檢測線的位置處都無紫紅色的條帶出現(xiàn)，表明該檢測結果為無效結果。2.定量檢測
(I)線性范圍
采用本發(fā)明制備的試紙條做檢測線性范圍實驗。取NGAL標準品，用生理鹽水稀釋成8個濃度，其濃度范圍是20ng/mL-1500ng/mL，每個濃度重復測定3次，將測定濃度的平均值與理論濃度進行線性回歸分析，計算回歸方程y = 0. 905x - 22. 17，相關系數(shù)r=0. 9995，表
明本發(fā)明試紙條在20ng/mL-1500ng/mL線性范圍內相關性很好(見圖3)。(2)靈敏度
以生理鹽水為空白樣本，用本發(fā)明試紙條進行測定，重復20次，計算讀數(shù)均值V為23. 95，標準差SD為8. 319。計算V+2SD為40. 59，根據回歸方程計算空白樣本濃度為15.58ng/ml。(3)檢測范圍
在線性檢測范圍下限每隔8%取濃度值，將標準品稀釋成16. 8 ng/mL, 18. 4 ng/mL, 20ng/mL, 21.6 ng/mL, 23. 2 ng/mL,利用FIA8000系列免疫定量分析儀重復測定10次,分別計算變異系數(shù) CV。16. 8 ng/mL, 18. 4 ng/mL NGAL 測定 CV 分別為 12. 65%, 10. 89%。而 20 ng/mL，21.6 ng/mL, 23. 2 ng/mL NGAL測定CV在8%左右，均小于10%。由此可見，最低濃度水平20 ng/mL為檢測下限。(4)與雅培ARCHITECT尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白測定試劑盒相關性比較
取100份尿液樣品，將其等分，一份采用本發(fā)明制備的試紙條及其配套儀器FIA8000系列免疫定量分析儀進行測定，另ー份雅培ARCHITECT尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白測定試劑盒及其配套儀器ARCHITECT!免疫分析儀進行測定，測定結果見圖4，結果顯示其相關性很好r=0. 9905, P > 0. 05，兩種方法間無統(tǒng)計學差異。
權利要求
1.一種檢測NGAL膠體金試紙條，包括塑料底襯、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上設有相互平行的質控線和檢測線；所述的質控線上含有兔抗人IgG抗體，所述檢測線含有一種NGAL單克隆抗體，所述的金標墊上有金標記的另一種NGAL單克隆抗體。
2.根據權利要求I所述的檢測NGAL膠體金試紙條，其特征在于檢測線上的一種NGAL單克隆抗體和金標墊上的金標記的另一種NGAL單克隆抗體能夠相互配對。
3.根據權利要求I所述的檢測NGAL膠體金試紙條，其特征在于一種NGAL單克隆抗體為3B1，金標記的另一種NGAL單克隆抗體為4C2。
4.根據權利要求I所述的檢測NGAL膠體金試紙條，其特征在于一種NGAL單克隆抗體為4C2，金標記的另一種NGAL單克隆抗體為3B1。
5.一種檢測NGAL膠體金試紙條的制備方法，包括以下步驟 1)將一種NGAL單克隆抗體液噴到硝酸纖維素膜上形成檢測線，將兔抗人IgG抗體液噴到硝酸纖維素膜的另一區(qū)域形成質控線； 2)將另一種NGAL單克隆抗體加到膠體金中，得到膠體金——抗體復合物溶液,將該復合物溶液涂覆玻璃纖維素膜或聚酯膜上得到金標墊； 3)將塑料底襯、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊進行粘貼，組裝成檢測NGAL膠體金試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)膠體金試紙條及其制備方法。該試紙條包括塑料底襯、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊，所述的硝酸纖維素膜上設有相互平行的質控線和檢測線；所述的質控線上含有兔抗人IgG抗體，所述檢測線含有一種NGAL單克隆抗體，所述的金標墊上有金標記的另一種NGAL單克隆抗體。本發(fā)明可對急性腎功能衰竭進行早期預測，特異性強、結果準確、操作簡單，適合床邊快速診斷。
文檔編號G01N33/68GK102759623SQ201210231509
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權日2012年7月6日
發(fā)明者王勇, 蘇恩本, 陳偉, 顏彬, 黃力 申請人:南京基蛋生物科技有限公司