專利名稱：Fe²⁺-H₂O₂-亞甲基藍化學發(fā)光體系測定綠原酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及綠原酸的測定方法，具體是用Fe2+-H2O2-亞甲基藍化學發(fā)光體系測定綠原酸的方法。本發(fā)明屬于植物化學、天然產(chǎn)物化學、食品化學、分析化學、有機化學、生物化學、植物次生代謝物質(zhì)的生理學、植物生物活性物質(zhì)、食品、保健品、藥品等研究領域。
背景技術：
綠原酸(Chlorogenic acid)又叫咖啡鞋酸,化學名為3_咖啡?？崴?。綠原酸是一種多酹類化合物，由一分子咖啡酸(Caffeic acid)和一分子奎尼酸(Quinic acid, I-輕基六氫沒食子酸)縮合脫水而成的縮酚酸，分子結(jié)構(gòu)見說明書附圖，它是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。綠原酸具有較強的藥理活性，具有廣譜抗菌，抗病毒及抗真菌的作用，主要用于清熱解毒、涼散風熱，痛腫療瘡，喉痹丹毒，熱血毒痢，風熱感冒等疾病的治療，能降低血液中膽固醇含量，加強機體防御機能，具有較高的藥用價值。隨著抗生素濫用及不良反應的增加，開發(fā)具有良好抗菌效果的中藥的呼聲越來越高。綠原酸作為抗菌作用顯著的中藥，越來越受到醫(yī)藥界關注。因此，對綠原酸含量的檢測也成為必不可少的重要組成部分。目前國內(nèi)外定性和定量分析綠原酸的方法主要有分光光度法(袁華，鄧良，孫炎彬2007)、高效液相色譜法(梅林2007 ;朱晴峰，陳梅榮等2011)、薄層色譜法(聶松柳，孟楣2010)、毛細管電泳法(楊新等1999 ;呂元琦，部春華，袁倬斌2004)和化學發(fā)光法(賀彩霞，陸明剛1997 ;張紅影，徐向東，石紅梅等2011)?，F(xiàn)有檢測方法存在一定的缺陷分光光度法比較耗時，且重現(xiàn)性差；高效液相色譜法儀器比較貴，同時需要專業(yè)技術人員，培養(yǎng)一名優(yōu)秀的檢測師需要很長的時間，另外專用色譜純的流動相和色譜柱比較貴；薄層色譜法和毛細管電泳法所用的化學試劑比較多， 步驟繁瑣，適合于小樣品的純化；張紅影，徐向東等做的化學發(fā)光法需要用到比較貴重的 Ag(III);賀彩霞，陸明剛等做的化學發(fā)光法干擾物質(zhì)較多不便廣泛應用。化學發(fā)光分析法由于其靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單，越來越受到人們的青睞。采用魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系和魯米諾-KIO4體系測定綠原酸的方法文獻有報道，但Fe2+-H2O2-亞甲基藍化學發(fā)光體系用于綠原酸的測定未見報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有檢測方法的缺陷，提供一種操作更加簡單，檢測成本低， 標準曲線的線性好的Fe2+-H2O2-亞甲基藍化學發(fā)光體系測定綠原酸的方法。具體步驟為(I)制備試劑用I 20X l(T3mol/L H2SO4作為溶劑，配制I 20X l(T3mol/L的硫酸亞鐵銨溶液(Fe2+);用二次蒸餾水作為溶劑，分別配制I 20X10_5mol/L的亞甲基藍溶液、體積百分比濃度為O. I 5%的雙氧水、濃度為O. 001 10mg/mL的綠原酸標準溶液和樣品綠原酸溶液。(2)流動注射化學發(fā)光檢測儀的設定主動泵分別將步驟(I)制備好的硫酸亞鐵銨溶液(Fe2+)和綠原酸標準溶液以30 60r/min的流速通過相應的管道進行三通混合，輸入流動注射化學發(fā)光分析儀；副動泵將步驟(I)制備好的亞甲基藍溶液和雙氧水以50 80r/min的流速通過十六通注射閥注入流通池，注樣時間10 20秒，各液混合，檢測其化學發(fā)光強度I，記錄數(shù)據(jù)。上述測試過程在35°C 土1°C恒溫進行；(3)做出標準曲線方程I =-4. 0125X+2047,其中X以yg/ml計，濃度在I 500 μ g/ml 范圍，R2 = O. 9944 ；(4)樣品綠原酸含量測定按照步驟(2)操作過程，測試樣品綠原酸的化學發(fā)光強度，代入標準曲線方程，計算樣品綠原酸的含量x= (2047-1)/4. 0125，其中X以μ g/ml
if ο在優(yōu)化的條件下，綠原酸標準溶液的濃度在I 500 μ g/nf范圍內(nèi)與發(fā)光強度I呈線性關系I = -4. 0125X+2047，其中x以μ g/ml if, R2 = O. 9944，這表明可利用這一方法對
綠原酸進行定量分析。本發(fā)明與現(xiàn)有的方法相比，本測定方法的儀器設備簡單，操作方便，分析快速，檢測成本低，靈敏度高，重復性好，線性范圍寬，可在線進行常規(guī)性測定，易于應用到工業(yè)或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。本發(fā)明是一種在線檢測綠原酸的方法。一般以往檢測一個綠原酸樣品需要20 30分鐘，本發(fā)明所需時間僅僅在5分鐘之內(nèi)，比現(xiàn)有的其它檢測方法迅速，因此可以應用于綠原酸的提取和純化及結(jié)晶的工業(yè)化生產(chǎn)；富含綠原酸植物的栽培和育種；綠原酸在食品、保健品、藥品中的含量檢測。


附圖為綠原酸的分子結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式實施例I.儀器設備IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀(西安瑞邁電子有限公司)。整個分析過程中采樣、注樣、實驗數(shù)據(jù)采集及處理，均由Windows XP系統(tǒng)下IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀完成。2.材料與試劑2. I 材料綠原酸標準品中國藥品生物制品檢定所；綠原酸樣品西安奧澤生物科技有限公司。2. 2制備試劑用O. 01mol/L H2SO4作為溶劑，配制2. 2X 10_3mol/L的硫酸亞鐵銨溶液(Fe2+);用二次蒸餾水作為溶劑，配制6. 4X10_5mol/L的亞甲基藍溶液、體積百分比濃度O. 5%雙氧水、濃度為10mg/mL綠原酸標準溶液和樣品綠原酸溶液；再用濃度為10mg/mL 綠原酸標準溶液制備出濃度區(qū)間I 1000 μ g/mL的多個不同濃度的系列溶液，以備制做標準曲線時使用。
3.流動注射化學發(fā)光檢測儀的設定主動泵分別將制備好的硫酸亞鐵銨溶液 (Fe2+)和綠原酸標準溶液以45r/min的流速通過相應的管道進行三通混合，輸入流動注射化學發(fā)光分析儀；副動泵將制備好的亞甲基藍溶液和雙氧水以55r/min的流速通過十六通注射閥注入流通池，注樣時間15秒，各液混合，檢測其化學發(fā)光強度，記錄數(shù)據(jù)，做出標準曲線方程(I = _4.0125x+2047);然后重復上述操作過程，測試樣品綠原酸的化學發(fā)光強度 (I = 1653. O)，代入標準曲線方程，計算樣品綠原酸的含量(X = 98. 2 μ g/ml)。上述測試過程在35 °C ±1°C恒溫進行。4.試驗與結(jié)果分析4. I試驗條件的優(yōu)化4. I. I流路參數(shù)的選擇流速的影響在流動注射分析中，流速是影響測定靈敏度的一個重要因素。流速太慢會導致最大發(fā)光在流通池之前，流速太快會導致最大發(fā)光在流通池之后，在固定最短閥池距的前提下，對主副蠕動泵的轉(zhuǎn)數(shù)在10 90r/min范圍內(nèi)進行考察，確定最佳主副泵的轉(zhuǎn)數(shù)分別為 45r/min(2. 25ml/min)和 55r/min(2. 75ml/min)時，I 最大。其它參數(shù)流通管(聚四氟乙烯管)內(nèi)徑為O. 8mm,閥池距為12cm，光電倍增管負高壓為800V。4. I. 2單因素試驗確定反應介質(zhì)的濃度范圍 Fe2+濃度試驗考察了 Fe2+濃度在I. OX 10_4 ~ 5. OX 10_3mol/L范圍內(nèi)對化學發(fā)光強度的影響，結(jié)果表明化學發(fā)光強度隨Fe2+濃度增加而增大，當Fe2+濃度超過 2. 2X10_3mol/L時發(fā)光強度趨于穩(wěn)定。根據(jù)考察結(jié)果篩選出Fe2+濃度為2. 2X10_3mol/L。亞甲基藍濃度試驗考察了亞甲基藍濃度在1.0X10_5 1.0X10_4mol/L范圍內(nèi)對化學發(fā)光強度的影響。結(jié)果表明在低濃度時，發(fā)光強度較弱；隨著亞甲基藍濃度增加， 發(fā)光強度也增大；當亞甲基藍濃度為6. 4X10-5mol/L時發(fā)光強度達到最大。根據(jù)考察結(jié)果篩選出亞甲基藍濃度為6. 4Xl(T5mol/L。雙氧水濃度試驗考察了雙氧水在體積百分比濃度O. 1% 5%范圍內(nèi)對化學發(fā)光強度的影響，結(jié)果表明隨著雙氧水濃度的增加，發(fā)光強度迅速增大，當雙氧水濃度增加至O. 5%時發(fā)光強度達到最大。試驗選擇雙氧水濃度為O. 5%。硫酸濃度試驗了硫酸濃度在I. OX 10_4 I. OX KTmol/L范圍內(nèi)對化學發(fā)光強度的影響，結(jié)果表明當硫酸濃度為I. OX l(T2mol/L時發(fā)光強度達到最大,試驗選擇硫酸濃度為 I. OX 10 2mol/L。4. 2標準曲線、精密度、重復性、檢測限和穩(wěn)定性4. 2. I標準曲線方程的獲得在優(yōu)化的條件下，綠原酸的濃度在I 500 μ g/mL范圍內(nèi)與發(fā)光強度I呈線關系， 其方程為 I = -4. 0125x+2047，其中 x 以 μ g/ml 計，R2 = O. 9944。4. 2. 2方法的精密度、重復性及檢測限試驗精密度在選定的最佳實驗條件下，對5 μ g/ml的綠原酸標準溶液連續(xù)11次測定， 平均值為 49. 78 μ g/ml，RSD 為 3. 62 %。重復性將50 μ g/ml綠原酸標準溶液分為6份,分別測定,平均值為50. 05 μ g/ ml, RSD 為 3. 46%0
檢測限I.O μ g/ml4. 3干擾試驗綠原酸來源于葉片，在提取過程中共存其他組分，它們可能對該化學發(fā)光體系測定綠原酸有一定的影響。為此，研究了 100倍的Na+、Cl_、K+、Br_、C032_、S042_和N03_ ；50倍的 Fe3+、Ca2+、Cu2+、Mn2+ ；10倍的淀粉、糊精、麥芽糖、蔗糖以及葡萄糖等分別對50 μ g/ml的綠原酸進行干擾測定實驗。結(jié)果表明，它們不干擾測定。4. 4加標回收率試驗結(jié)果表I回收率實驗結(jié)果
權利要求
1.一種測定綠原酸的方法，其特征在于具體步驟為(1)制備試劑用I 20X10-3mol/L H2SO4作為溶劑，配制I 20X liTW/L的硫酸亞鐵銨溶液；用二次蒸餾水作為溶劑，分別配制I 20X 10_5mol/L的亞甲基藍溶液、體積百分比濃度為O. I 5%的雙氧水、濃度為O. 001 10mg/mL的綠原酸標準溶液和樣品綠原酸溶液；(2)流動注射化學發(fā)光檢測儀的設定主動泵分別將步驟(I)制備好的硫酸亞鐵銨溶液和綠原酸標準溶液以30 60r/min的流速通過相應的管道進行三通混合，輸入流動注射化學發(fā)光分析儀；副動泵將步驟(I)制備好的亞甲基藍溶液和雙氧水以50 80r/min的流速通過十六通注射閥注入流通池，注樣時間10 20秒，各液混合，檢測其化學發(fā)光強度I， 記錄數(shù)據(jù)；上述測試過程在35°C 土 1°C恒溫進行；(3)做出標準曲線方程1= -4. 0125x+2047，其中x以μ g/ml計，濃度在I 500 μ g/ml 范圍，R2 = O. 9944 ；(4)樣品綠原酸含量測定按照步驟(2)操作過程，測試樣品綠原酸的化學發(fā)光強度， 代入標準曲線方程，計算樣品綠原酸的含量x = (2047-1)/4. 0125，其中x以μ g/ml計。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Fe2+-H2O2-亞甲基藍化學發(fā)光體系測定綠原酸的方法。用H2SO4作為溶劑，配制硫酸亞鐵銨溶液；用二次蒸餾水作為溶劑，配亞甲基藍溶液、雙氧水、綠原酸標準溶液和樣品綠原酸溶液。主動泵分別將制備好的硫酸亞鐵銨溶液和綠原酸標準溶液進行三通混合，輸入流動注射化學發(fā)光分析儀；副動泵將制備好的亞甲基藍溶液和雙氧水注入流通池，檢測其化學發(fā)光強度I，記錄數(shù)據(jù)；做出標準曲線方程I＝-4.0125x+2047，其中x以μg/ml計，濃度在1～500μg/ml范圍，R2＝0.9944。按照上述操作過程，測試樣品綠原酸的化學發(fā)光強度，代入標準曲線方程，計算樣品綠原酸的含量x＝(2047-I)/4.0125，其中x以μg/ml計。本發(fā)明檢測方法簡單、成本低，可在線進行常規(guī)性測定。
文檔編號G01N21/76GK102590190SQ20121002275
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權日2012年1月31日
發(fā)明者吳瓊, 蔣澤軍, 郝再彬 申請人:桂林理工大學