基于納米金標記和酪胺信號放大技術(shù)測定脫落酸的方法
【專利摘要】基于納米金標記和酪胺信號放大技術(shù)測定脫落酸的方法。以生物素化脫落酸抗體修飾納米金為標記物，以磁珠為載體，結(jié)合酪胺信號放大技術(shù)和PIP-HRP-H2O2化學(xué)發(fā)光體系高靈敏度測定脫落酸的方法。屬于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域。其原理是用抗體修飾磁珠捕獲目標物脫落酸；用生物素化脫落酸抗體修飾納米金，并以其為標記物；然后利用酪胺信號放大技術(shù)在磁珠表面聚集鏈霉親和素-HRP；再利用PIP-HRP-H2O2化學(xué)發(fā)光體系實現(xiàn)對目標物的測定。由于通過酪胺信號放大在磁珠表面有大量的鏈霉親和素-HRP形成，再利用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測體系，實現(xiàn)了脫落酸的高靈敏度測定。方法具有簡單、成本低、靈敏度高的優(yōu)勢。
【專利說明】基于納米金標記和酪胺信號放大技術(shù)測定脫落酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及以納米金為標記物和酪胺信號放大技術(shù)建立的分析方法。具體涉及一種植物激素脫落酸測定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脫落酸(abscisic acid, ΑΒΑ)是植物體內(nèi)一種重要的激素，由類胡蘿卜素降解形成，有阻遏赤霉酸及細胞分裂素促進生長的作用；與葉子的衰老、果實的脫落等有關(guān)。雖然含量甚微，但對調(diào)節(jié)植物體的生長、成熟和衰老有著重要的作用。準確測定這種植物激素的含量，研究其變化規(guī)律，對于探索果實成熟及貯藏保鮮具有重要意義。植物激素測定的傳統(tǒng)方法主要有色譜法及聯(lián)用技術(shù)[Hou SJ, Zhu J, DingMY, Lv GH.Simultaneousdetermination of gibberellic acid, indole-3-acetic acid and abscisic acid inwheat extracts by solid—phase extraction andliquid chromatography-electrospraytandem mass spectrometry.Talantaj 2008，76:798]、免疫學(xué)方法[Ferreiraa WDj KerbauybGBj Krausb JE，Pescadorc Rj Suzuki RM.Thidiazuron influences the endogenous levelsof cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium.JPlant Phys，2006，163:1126]、光譜法、電化學(xué)方法[Carretero AS, Cruces-Bianco C，PenaMS，Ramirez SC，Gutierrez AF.Determination of phytohormones of environmentalimpact by capillary zone electrophoresis.J Agric Food Chemj 2004, 52:1419 ；LiuX，Ma L，Lin YWj Lu YT.Determination of abscisic acid by capillary electrophoresiswith laser-1nduced fluorescence detection.J Chromatogr A，2003，1021:209 ;LiJ，Xiao LT，Zeng GM，Huang GH，Shen GLj Yu RQ.1mmunosensor for rapid detection ofgibberellin acid in the rice grain.J Agric Food Chem，2005，53:1348]等。目前測定脫落酸的方法主要有HPLC法[劉長江，劉旸旸，李書倩，張博，辛廣.HPLC法測定軟棗獼猴桃中內(nèi)源激素脫落酸含量.食品研究與開發(fā).2012，33:162;孫崇臻，王超，蔡子哲，陳沿廷，吳希陽.高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸.食品科學(xué)，2013，34:281]、ELASE法[周振華，楚霞，沈國勵，俞汝勤.間接競爭ELISA方法用于脫落酸的檢測.化學(xué)傳感器.2009，29: 29]等。
[0003]但是，這些方法的各有其缺點，本發(fā)明利用納米金為標記物和磁珠為載體，以酪胺信號放大技術(shù)，實現(xiàn)植物激素脫落酸的測定，具有方法簡單、成本低、靈敏度高的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種測定脫落酸的方法，以納米金為標記物、磁珠為載體，結(jié)合酪胺信號放大技術(shù)和PIP (對碘苯酚)-HRP-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，實現(xiàn)脫落酸的測定。
[0005]技術(shù)方案
[0006]一種基于納米金標記和酪胺信號放大技術(shù)測定脫落酸的方法。其特征在于用納米金為標記物，羧基化磁珠為載體，再以酪胺信號放大技術(shù)和PIP-HRP-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，實現(xiàn)脫落酸的測定。測定步驟如下:
[0007](I)納米金的制備。將用于制備納米金的玻璃儀器及聚四氟乙烯攪拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸餾水沖洗后烘干備用。再向500mL三口燒瓶中加入250mL水，再加入
2.5mLl%HAuCl4，在電爐上加熱至沸騰后，快速加入4.4mLl%檸檬酸鈉。溶液在2~3分鐘內(nèi)其顏色由淡黃色逐漸變?yōu)榫萍t色，然后繼續(xù)保持沸10~15分鐘，移走熱源，在室溫下繼續(xù)攪拌至冷卻，定容至200mL，置4°C冰箱冷藏備用。
[0008](2)生物素化脫落酸抗體的制備。首先用lmol/LpH9.2的NaHCO3溶液將脫落酸抗體稀釋為lmg/mL ;用DMF將Bio-NHS配制成50mg/mL的溶液；然后按Bio-HNS與脫落酸抗體質(zhì)量比1:7的比例將其混合，室溫下攪拌混勻反應(yīng)4h，即得生物素化脫落酸抗體。
[0009](3)抗體修飾納米金的制備。在2mL的小試管中加入150 μ L, IO^7M的巰基丙酸，再加入ImL0.1M的EDC，活化30分鐘。另取一個5mL的小試管，加入2mL納米金，ImL咪唑緩沖液(0.1Μ，ρΗ6.8)，活化30分鐘。將上述兩溶液混合反應(yīng)12小時，磁性分離，棄上清液，再用磷酸緩沖溶液洗三次，定容至2mL。將10 μ g生物素化IgG、3 μ g生物素化脫落酸抗體加入上述溶液中，混合反應(yīng)12小時，得抗體修飾納米金。
[0010](4)抗體修飾磁珠的制備。取30 μ L磁珠于1.5mL小試管中，用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，加入200 μ L咪唑-HCl緩沖溶液(0.1Μ)和100 μ L0.2Μ的EDC溶液，在37°C下反應(yīng)40分鐘。然后用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次,最后加入200 μ L磷酸緩沖溶液搖勻。再加入1(^8抗體，371:振蕩孵育過夜。最后，用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，磁性分離后，分散于200 μ L磷酸緩沖溶液中。再加入200 μ L0.lg/mL的BSA，并置于37°C下反應(yīng)40分鐘，再用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，磁性分離后，分散于200 μ L磷酸緩沖溶液中，得抗體修飾磁珠。4V冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0011 ] (5)生物素化酪胺的制備。分別取10.0mgBio-NHS和酪胺-HCl，用DMF溶解，分別配制成10mg/mL的溶液;在配置的酪胺-HCl溶液中`加入三乙胺10 μ L，室溫放置4小時后，取17.3 μ L，與60.2 μ L的Bio-NHS溶液混合，室溫反應(yīng)4小時，即得生物素化酪胺，4°C冰箱保存?zhèn)洹?br> [0012](6)脫落酸的測定。取脫落酸標準溶液或樣品溶液10 μ L加入50 μ L的抗體修飾磁珠溶液中，37°C下反應(yīng)30分鐘。然后加入抗體修飾納米金20μ L，37°C下反應(yīng)30分鐘，磁性分離，并用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次后分散于80 μ L磷酸緩沖溶液中。然后加入40 μ L的生物素化酪胺溶液，再加入10 μ L體積分數(shù)為0.5%的過氧化氫溶液，在37°C避光振蕩孵育30分鐘，用含0.05% (體積分數(shù))吐溫-20的磷酸緩沖液洗滌三次。然后再加入40 μ L的鏈霉親和素-HRP，37°C振蕩孵育30分鐘，用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次后分散于80 μ L磷酸緩沖溶液中。然后進行化學(xué)發(fā)光測定，根據(jù)標準溶液濃度和化學(xué)發(fā)光信號關(guān)系作圖得標準曲線；根據(jù)所測定樣品溶液的化學(xué)發(fā)光信號對樣品中脫落酸含量進行定量。
[0013](7)樣品分析，將微納米級微透析探針插入模式植物內(nèi)部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣，在通道下游待測組分按步驟(6)方法進行實驗，根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號和步驟(6)所得標準曲線可以獲取植物激素脫落酸的含量。
[0014]本發(fā)明的化學(xué)試劑優(yōu)選分析純試劑，所有溶液均用二次蒸餾水配置。
[0015]本發(fā)明的磷酸緩沖溶液(0.2ΜρΗ7.4)配制方法:取濃度為35.61g/L的Na2HPO4.2H20 溶液 81mL，濃度為 27.6g/L 的 NaH2PO4.H2O 溶液 19mL 混合即得。
[0016]咪唑-HCl緩沖液配制方法:取咪唑6.8g，氯化鈉11.7g，加于500mL 二次蒸餾水中，加0.lmol/L鹽酸186mL,調(diào)pH至6.8,最后加二次蒸懼水至I升即得。
[0017]本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光測定選用MP1-E型化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)。
[0018]本發(fā)明的振蕩孵育選用THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(全壇市醫(yī)療儀器廠)。
[0019]本發(fā)明的離心機選用Anke-TGL_16C飛鴿牌高速離心機(上海市安亭科學(xué)儀器廠)。
[0020]本發(fā)明的pH測量選用PHS-3D型酸度計(上海雷磁儀器廠)。
[0021]本發(fā)明的磁性分離選用55002型磁性分離架(天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)
[0022]本發(fā)明的顯著效果
[0023]本發(fā)明研究了不同濃度脫落酸與發(fā)光強度之間的關(guān)系，得到了檢測脫落酸的標準曲線，線性范圍及線性方程。
[0024]當脫落酸的濃度在1.0ng/mL-3000.0ng/mL之間時，隨著脫落酸濃度的變化,化學(xué)發(fā)光強度有明顯變化。經(jīng)計算得到檢測脫落酸的線性方程為Ia=2.13C+26.62 (Ia是化學(xué)發(fā)光強度；C是脫落酸的濃度，ng/mL ；η=12, η表示同一濃度測定次數(shù)，R2=0.9897)。檢測限是0.3ng/mL(3 σ )。該測定方法的精密度通過對濃度為7.0ng/mL的脫落酸進行11次平行測定而計算得出，相對標準偏差分別為3.8%，表明本發(fā)明的測定方法有較好的重現(xiàn)性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1.酪胺信號放大技術(shù)測定脫落酸原理圖
[0026]圖2.脫落酸標準曲線。橫坐標是脫落酸濃度，單位是ng/mL，縱坐標Ia是體系的化學(xué)發(fā)光強度。
【具體實施方式】
[0027]按照技術(shù)方案的步驟(1)至(6)得到脫落酸標準曲線見圖2，其中N-羥基琥珀酰亞胺生物素(Bio-NHS)、辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(鏈霉親和素-HRP)購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；氯金酸(HAuCl4),檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)均購于天津市博迪化工有限公司；脫落酸、吐溫-20、咪唑購自國藥化學(xué)試劑公司；1_乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、生物素化IgG購自Sigma公司；脫落酸抗體購自盛世中方(北京)生物科技有限公司；巰基丙酸購自天津市博迪化工有限公司；牛血清蛋白(BSA)、二甲基甲酰胺(DMF)購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；酪胺-HCl購自北京化工廠；磁珠(羧基化，粒徑為I~2μπι)購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。
[0028]根據(jù)發(fā)明的方法對脫落酸含量進行了測定，并采用標準加入法對方法進行了評價，樣品測定回收率為98.5 - 102.6%，測定結(jié)果見表1，本發(fā)明的方法在脫落酸檢測中具有精密度高的特點。測定時用微納米級微透析探針插入模式植物水稻莖部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣。
[0029]表1.樣品分析測定結(jié)果a’b
[0030]
【權(quán)利要求】
1.基于納米金標記和酪胺信號放大技術(shù)測定脫落酸的方法，其特征在于以納米金為標記物和磁珠為載體，以酪胺信號放大技術(shù)和PIP-HRP-H2O2化學(xué)發(fā)光體系實現(xiàn)植物激素脫落酸的測定，測定步驟如下: (O納米金的制備:將用于制備納米金的玻璃儀器及聚四氟乙烯攪拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸餾水沖洗后烘干備用；再向500mL三口燒瓶中加入250mL水，再加入2.5mLl%HAuCl4，在電爐上加熱至沸騰后，快速加入4.4mLl%檸檬酸鈉；溶液顏色由淡黃色逐漸變?yōu)榫萍t色，然后繼續(xù)保持沸10~15分鐘，移走熱源，在室溫下繼續(xù)攪拌至冷卻，定容至200mL，置4°C冰箱冷藏備用； (2)生物素化脫落酸抗體的制備:首先用lmol/LpH9.2的NaHCO3溶液將脫落酸抗體稀釋為lmg/mL ;用DMF將Bio-NHS配制成50mg/mL的溶液；然后按Bio-HNS與脫落酸抗體質(zhì)量比1:7的比例將其混合，室溫下攪拌混勻反應(yīng)4h，即得生物素化脫落酸抗體； (3)抗體修飾納米金的制備:在2mL的小試管中加入150μ L，10_7Μ的巰基丙酸，再加入lmL、0.1M的EDC，活化30分鐘；另取一個5mL的小試管，加入2mL納米金，ImL咪唑緩沖液(0.1M，pH6.8)，活化30分鐘；將上述兩溶液混合反應(yīng)12小時，磁性分離，棄上清液，再用磷酸緩沖溶液洗三次，定容至2mL ;然后將10 μ g生物素化IgG、3 μ g生物素化脫落酸抗體加入上述溶液中，混合反應(yīng)12小時,得抗體修飾納米金； (4)抗體修飾磁珠的制備:取30μ L磁珠于1.5mL小試管中，用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，加入200 μ L咪唑-HCl緩沖溶液(0.1Μ)和100 μ L0.2Μ的EDC溶液，在37°C下反應(yīng)40分鐘；然后用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，最后加入200 μ L磷酸緩沖溶液搖勻；再加入10μ g抗體，37°C孵育過夜；最后，用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，磁性分離后，分散于200 μ L磷酸緩沖溶液中；再加入200 μ L0.lg/mL的BSA，并置于37°C下反應(yīng)40分鐘，再用200 μ L磷酸緩沖溶液洗滌三次，磁性分離后，分散于200 μ L磷酸緩沖溶液中，得抗體修飾磁珠，4°C冰箱保存?zhèn)?用； (5)生物素化酪胺的制備:分別取10.0mgBio-NHS和酪胺-HC1，用DMF溶解，分別配制成10mg/mL的溶液；在配置的酪胺-HCl溶液中加入三乙胺10 μ L，室溫放置4小時后取17.3 μ L，與60.2 μ L的Bio-NHS溶液混合，室溫反應(yīng)4小時，即得生物素化酪胺，4°C冰箱保存?zhèn)洌? (6)脫落酸的測定:取不同量的脫落酸標準溶液或樣品溶液加入抗體修飾磁珠溶液中，37°C下反應(yīng)30分鐘；然后加入抗體修飾納米金，37°C下反應(yīng)30分鐘，磁性分離，并用磷酸緩沖溶液洗滌三次后分散于磷酸緩沖溶液中；然后加入生物素化酪胺溶液，再加入體積分數(shù)為0.5%的過氧化氫溶液，在37°C避光孵育30分鐘，用含0.05% (體積分數(shù))吐溫-20的磷酸緩沖液洗滌三次；然后再加入鏈霉親和素_HRP，37°C孵育30分鐘，用磷酸緩沖溶液洗滌三次后分散于磷酸緩沖溶液中；然后進行化學(xué)發(fā)光測定，根據(jù)標準溶液濃度和化學(xué)發(fā)光信號關(guān)系作圖得標準曲線；根據(jù)所測定樣品溶液的化學(xué)發(fā)光信號對樣品中脫落酸含量進行定量; (7 )樣品分析:將微納米級微透析探針插入模式植物內(nèi)部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣，在通道下游待測組分按步驟(6)方法進行實驗，根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號和步驟(6)所得標準曲線可以獲取植物激素脫落酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1測定脫落酸的方法，其特征在于所述化學(xué)試劑為分析純試劑，所有溶液均用二次蒸餾水配置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1測定脫落酸的方法，其特征在于所述磷酸緩沖液濃度為0.2M，ρΗ7.4，配制方法:取濃度為35.61g/L的Na2HPO4.2H20溶液8ImL,濃度為27.6g/L的NaH2PO4.H2O溶液19mL混合即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的測定脫落酸的方法，其特征在于所述咪唑-HCl緩沖液配制方法:取咪唑6.8g,氯化鈉11.7g,加于5OOmL 二次蒸懼水中，加0.lmol/L鹽酸186mL,調(diào)pH至6.8,最后加二次蒸懼水至I升。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的測定脫落酸的方法，其特征為以PIP-HRP-H2O2化學(xué)發(fā)光體系對化學(xué)發(fā)光進行測定?！?br> 【文檔編號】G01N21/76GK103592291SQ201310467561
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】混旭, 康泰, 謝國亮 申請人:青島科技大學(xué)