專利名稱：提高發(fā)光測定法的靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)光測定法和提高該測定法靈敏度的方法。
利用特異結(jié)合化合物與分析物相互作用以形成復(fù)合物的技術(shù)已開發(fā)出許多分析手段。從廣義講，這些分析手段可分為多相測定法(其中特異結(jié)合化合物/分析物的復(fù)合物從未反應(yīng)的分析物和結(jié)合化合物中分離出)和均相測定法(其中不必進行上述分離)。采用附著到結(jié)合系統(tǒng)的一種或多種成分上的一種或多種產(chǎn)生信號的標記物，以指示復(fù)合物的形成。
這些技術(shù)起始采用放射性同位素作為標記物，例如，在二十世紀六十年代普遍使用的放射免疫測定法。在以下反應(yīng)式1所示的競爭性放射免疫測定法中，測定原理是目標分析物(抗原Ag)與已知量的標記抗原(Ag＊)之間競爭特異結(jié)合化合物(抗體，Ab)上的有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點，導(dǎo)致在游離態(tài)和結(jié)合態(tài)之間標記的分配，隨后測定游離態(tài)或結(jié)合態(tài)標記抗原，給抗原定量。
反應(yīng)式1(非化學計量)
另一個特異結(jié)合測定法的具體例子是日益受青眜的夾層測定法，其中兩個特異結(jié)合化合物與單個分析物分子相互反應(yīng)(例如，Ab1-Ag-Ab2)。典型地，結(jié)合化合物之一附著在一固體表面，并用來將分析物俘獲到該表面上。然后，被可檢測標記物標記的第二結(jié)合化合物與分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合，使該標記物被俘獲到該表面上以利于測定。夾層測定法也稱作免疫計量測定法。已知還有許多其他測定法也采用特異結(jié)合，如在本說明書所引出版物中所述的測定法。
除了放射性標記物外，在特異結(jié)合測定法中還采用了許多其他標記物。在許多情況下，采用熒光分子和酶以避免由于使用放射性標記物而產(chǎn)生的后處理問題。也有人提議使用發(fā)光分子作為標記物?？梢缘玫交瘜W發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。化學發(fā)光化合物是在適當條件(通常是氧化作用)下，在單電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的化合物。衰變至基態(tài)時產(chǎn)生光子?；瘜W發(fā)光分子的例子有魯米諾，異魯米諾，二吖啶鎓鹽，洛粉堿和草酸酯。由于易于測定和定量可見光的發(fā)射，在某些類型的免疫測定法中已成功地使用了化學發(fā)光標記物。US4，220，450，US4，104，029和UK1，461，877披露了化學發(fā)光測定法的例子。N.Serio和M.Pazzagl編輯的“LuminescentAssays”(第1卷，Ravin出版社，1982)一文也總結(jié)了近年來在化學發(fā)光免疫測定法領(lǐng)域中所取得的進展。
基于能量轉(zhuǎn)換的均相化學發(fā)光免疫測定法也有披露(見Patel等人，Bio.Chem.Soc.Trans.，1983，11196)。將氨基丁基乙基異魯米諾作為標記物偶聯(lián)到抗原上，并且用一種能量轉(zhuǎn)換受體，即一種熒光分子如熒光素標記相應(yīng)的抗體。當已標記的抗原結(jié)合到它們各自的被熒光素標記的抗體上時，可以觀察到460nm(藍)處的發(fā)射比移動到525nm(綠)處。用這種能量轉(zhuǎn)移法開拓了均相化學發(fā)光測定法測定幾種抗原。
除了化學發(fā)光分子外，也可以使用生物發(fā)光分子作為標記物。化學發(fā)光分子和生物發(fā)光分子的區(qū)別在于，生物發(fā)光測定法需要蛋白質(zhì)的相互作用，這種蛋白質(zhì)通常是光引發(fā)酶(如熒光素酶)或可結(jié)合真正的發(fā)光分子但在不存在外部引發(fā)劑如鈣離子的情況下不發(fā)光的光蛋白。在以下文獻中敘述了許多這種測定法例如WilfridR.Vutt主編的“PracticalImmunoassay”的第五章，V.14;“ClincalandBiochemicafAssays”(MarcelDekkarInc，1984);以及Patel和Cormier的“AnalyticalApplicationsofBioluminescenseandChemiluminescence”(273-276頁，AcademicPress，Inc，1984)。也可以參見涉及生物發(fā)光和化學發(fā)光測定法的題為“DetectingorQuantifyingSubstancesUsingLabellingTechnigues”的478，817號美國專利和1987年6月5日提交的題為“BioluminescentImmunoassaysUtilizingCoelenterate-DerivedLuciferasesandPhotoproteins”的059，137號美國專利申請。
生物發(fā)光測定法的優(yōu)點在于對于這些化合物可提供高的理論靈敏度。且沒有后處理問題。測定濃度為10-20M的生物發(fā)光標記物在理論上是可能的。但是，通常達不到這一理論極限，原因是在生物發(fā)光測定法中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與進行分析的反應(yīng)容器的表面非特異結(jié)合以及這些蛋白質(zhì)分子與反應(yīng)介質(zhì)中的其他成分非特異結(jié)合的相互作用。
蛋白質(zhì)的“粘著性”，尤其是對玻璃表面的粘著性是熟知的。在本發(fā)明之前，曾采用非相關(guān)的蛋白質(zhì)如血清清蛋白預(yù)涂反應(yīng)容器表面，使測定法中所用的蛋白質(zhì)不與表面粘結(jié)。但是，這種方法不能達到最大靈敏度，因為涂覆蛋白質(zhì)對各種表面和反應(yīng)介質(zhì)中的成分的結(jié)合親合力與標記蛋白質(zhì)的親合力不同。
因此，在使用生物發(fā)光標記物檢測樣品中是否存在分析物的技術(shù)中，仍有要加改進的地方。
本發(fā)明的目的之一是提供一種提高生物發(fā)光測定法的靈敏度的方法。
本發(fā)明的另一個目的是降低所有類型的生物發(fā)光測定法中的本底發(fā)光。
通過提供一種能夠改善用于檢測樣品中是否存在分析物的生物發(fā)光測定法的靈敏度的技術(shù)，來實現(xiàn)本發(fā)明的這些和其他目的。該方法使用一種與發(fā)光分子結(jié)合的光蛋白作為被測結(jié)合系統(tǒng)的組分的標記物，并檢測結(jié)合在光蛋白上的發(fā)光分子所發(fā)射的光，光蛋白具有特異性能，即能夠結(jié)合發(fā)光分子而在不存在外部引發(fā)劑條件下不發(fā)光。通過在反應(yīng)介質(zhì)中引入引發(fā)劑之前、最好在反應(yīng)介質(zhì)中引入標記物之前使反應(yīng)介質(zhì)與不含有結(jié)合發(fā)光分子的光蛋白(這種蛋白質(zhì)通常稱作脫輔基光蛋白)接觸，可以降低反應(yīng)介質(zhì)中的本底發(fā)光。然后，向反應(yīng)介質(zhì)中加入外部引發(fā)劑以引發(fā)發(fā)光。由于使用作為標記物的相同蛋白質(zhì)防止了以前由于生物發(fā)光系統(tǒng)的蛋白質(zhì)成分粘結(jié)在表面或反應(yīng)介質(zhì)成分上而引起的本底發(fā)光，從而提高了靈敏度。
通過參考以下具體的實施方案和說明書附圖
，可以更好地理解本發(fā)明，其中附圖是在分析物存在和不存在的情況下發(fā)光(即需要的發(fā)光和本底)的示意圖。
本發(fā)明提供一種提高用于檢測樣品中是否存在分析物和/或其含量的生物發(fā)光測定法的靈敏度的方法。本發(fā)明的優(yōu)點之一是，該方法能夠降低任何類型的生物發(fā)光測定法的本底發(fā)光，不論測定法是多相的還是均相的，直接的或競爭性的或是其他類型。實現(xiàn)這一點是可能的，因為降低本底發(fā)光的關(guān)鍵步驟不包括在測定法本身步驟中。相反，在使用與發(fā)光分子結(jié)合的相應(yīng)的光蛋白作為生物發(fā)光標記物的同時，通過使反應(yīng)介質(zhì)與脫輔基光蛋白接觸，可降低本底發(fā)光。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可在光蛋白標記物和脫輔基光蛋白本底物之間的真正發(fā)光分子不發(fā)生交換情況下進行測定，即增加而不是降低本底發(fā)光。
本發(fā)明的關(guān)鍵成分是光蛋白，該蛋白質(zhì)結(jié)合在它的發(fā)光分子上并能夠通過外部引發(fā)劑引發(fā)，作為被檢測成分的可檢測標記物。還必須存在相應(yīng)的脫輔基光蛋白(沒有結(jié)合發(fā)光分子的光蛋白)。該光蛋白與通常報導(dǎo)的在生物發(fā)光測定法中使用的熒光素酶不同，熒光素酶和光蛋白都能催化發(fā)光分子產(chǎn)生光，但是它們的作用機制不同。熒光素酶通常在氧化反應(yīng)之前的長時間內(nèi)不與發(fā)光分子結(jié)合，相反，它立即與熒光素反應(yīng)(在氧存在下)產(chǎn)生光。
用于本發(fā)明方法中的特異生物發(fā)光標記物(光蛋白)包括能夠結(jié)合到熒光素或其他發(fā)光分子上并能夠被外部引發(fā)劑引發(fā)的蛋白質(zhì)或相關(guān)分子(如糖蛋白)。通過其在氧存在下與真正的發(fā)光分子結(jié)合但不發(fā)光的能力，光蛋白易于與在初始結(jié)合時引發(fā)發(fā)光反應(yīng)的熒光素酶和其它酶區(qū)分開。在光蛋白的定義中排除了在氧存在下，不需要使用其他引發(fā)劑分子就能產(chǎn)生光的熒光素酶和其他酶。
結(jié)合熒光素和相關(guān)的發(fā)光分子而不直接發(fā)光的分子統(tǒng)稱作光蛋白。從腔腸動物中獲得的光蛋白特別適宜于實施本發(fā)明。從腔腸動物中獲得的光蛋白的例子有水母光蛋白，Obelin，mnemiopsin和berovin。這些分子在許多技術(shù)出版物中有敘述，例如Ward等，在“ProcNatlAcadSciUSA”(1975)722530-2534所述。這些從腔腸動物中獲得的蛋白質(zhì)在不存在游離的鈣離子情況下是穩(wěn)定的并含有腔腸動物熒光素和結(jié)合在蛋白質(zhì)上的氧。當從腔腸動物中獲得的光蛋白的生物發(fā)光引發(fā)劑一鈣離子加到用光蛋白標記的溶液中時，產(chǎn)生最大波長約469nm的藍光。上述標記在1987年6月5日提交的059，137號美國專利申請中有詳細敘述。利用遺傳工程技術(shù)制備的一種脫輔基光蛋白形式在以下文獻中有敘述165，422號(申請日1988年2月29日)美國專利申請和173，045號(申請日1988年3月27日)美國專利申請，上述兩篇文獻的題目均為“RecombinantDNAVectorsCapableofExpressingApoaeguorin”。
生物發(fā)光標記物與特異結(jié)合系統(tǒng)中的分析物和其他成分的結(jié)合在以下出版物中有敘述題為“BioluminescentImmunoassaysUntilzingCoelenterate-DerivedLuciferasesandPhotoproteins”的059，137號(申請日1987年6月5日)美國專利申請和題為“DetectingorQuantifyingSubstancesUSingLabellingTechniques”的4，478，817號美國專利。
發(fā)光分子能否加載到脫輔基光蛋白的條件現(xiàn)已清楚，并有可能選擇反應(yīng)介質(zhì)的條件以便不發(fā)生發(fā)光分子在光蛋白和脫輔基光蛋白之間的交換。在這些條件下，由于用以消除本底發(fā)光的脫輔基光蛋白不含有發(fā)光分子，當被外部引發(fā)劑(對于從腔腸動物中獲得的光蛋白為鈣離子)引發(fā)時，只要用作標記物的光蛋白才發(fā)光。
發(fā)光分子(如熒光素)可以容易地結(jié)合到脫輔基光蛋白上形成光蛋白。通常稱這種過程為光蛋白的加載。蛋白質(zhì)的加載發(fā)光在使脫輔基光蛋白保持其正常構(gòu)象的生理條件下和含硫化合物，典型地是還原劑如巰基乙醇(ME)或二硫蘇糖醇(DTT)存在條件下。對加載條件沒有其他的特殊限制。一般情況下，于水溶液中，在4～40℃，較好在10～30℃，最好在約20～25℃下進行加載?？梢缘皇潜仨毷褂镁彌_溶液。加載介質(zhì)的PH一般為5～10，較好為6～8。典型的是發(fā)光分子的濃度比脫輔基光蛋白的濃度大，以確?？焖偌虞d。發(fā)光分子與光蛋白的濃度比典型的是1∶1～20∶1，最好是2∶1～5∶1。
含硫醇的試劑典型的是分子量低于500的小有機分子，以使該硫醇易從加載光蛋白中分離出?？梢圆捎脤游龇?、透析法或其它按照粒徑能分離化合物的技術(shù)進行分離。含硫醇的化合物的濃度一般高于脫輔基光蛋白的濃度。由于一般測定不出加載溶液中的脫輔基光蛋白的濃度，所以1-10mM硫醇濃度典型地用作起始濃度，而且根據(jù)需要，可以上下調(diào)節(jié)以獲得所需結(jié)果(有效加載)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在無可溶性硫醇時，脫輔基光蛋白和光蛋白之間發(fā)光分子不發(fā)生顯著交換。所以，測定可以在基本上沒有含硫醇化合物的條件下進行，而且不發(fā)生發(fā)光分子從光蛋白到脫輔基光蛋白的轉(zhuǎn)移。因此，先使反應(yīng)介質(zhì)與脫輔基光蛋白接觸，然后使用加載光蛋白，在基本上沒有含硫醇化合物的條件下進行反應(yīng)，則可以消除本底發(fā)光。
為了消除本底發(fā)光使用脫輔基光蛋白所包括的步驟與以前所采用的、使用其它蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)的步驟相同。典型地，使用脫輔基光蛋白稀釋液，其濃度最好約0.01-約10mM，最佳約0.1-1mM。為減少與盛反應(yīng)介質(zhì)的反應(yīng)容器的表面粘結(jié)所采用的大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)涉及用非干擾蛋白質(zhì)溶液涂覆反應(yīng)容器的表面，然后排干以除掉過量的液體。可以采用此技術(shù)或其它用脫輔基光蛋白接觸反應(yīng)容器的表面的技術(shù)。另外，可以直接向反應(yīng)介質(zhì)溶液中加入脫輔基光蛋白，以防止在光蛋白標記物和其它分子，特別是反應(yīng)介質(zhì)中存在的抗體一類的其它大分子之間發(fā)生任何非特異性結(jié)合?？商峁┻^量的脫輔基光蛋白以幾乎全部消除這種結(jié)合，而不必擔心發(fā)光分子從光蛋白轉(zhuǎn)移到脫輔基光蛋白中。
由于分析溶液中的反應(yīng)介質(zhì)一般是在化驗員的控制之下，所以不把硫醇加到反應(yīng)介質(zhì)中便可將其除去。如果知道硫醇存在于樣品中，則可以采取步驟從反應(yīng)介質(zhì)中除去硫醇。例如，如果被分析物是大分子，則可以采用透析法除去小的、可溶的含硫醇化合物。如果被分析物是用透析法也可除去小分子，則可以將氧氣通入樣品，以與硫醇反應(yīng)，把它除掉。
另外，沒有跡象表明硫醇可影響水母發(fā)光蛋白的活性。盡管要求加入硫醇，但一旦加入了，在所述測定條件下，熒光素分子不會被硫醇從水母發(fā)光蛋白中轉(zhuǎn)換出來。
樣品可以是任何懷疑含有被分析物的樣品，該樣品將按照與要收集的樣品類型有關(guān)的標準方法處理。典型樣品包括血液(血清，血漿或全血)、尿、唾液、糞便、組織樣品等等。既可以使用最初所獲得形式的樣品，也可以將樣品經(jīng)過各種加工步驟以提供便于測定形式的被分析物。例如，如果在正常情況下在細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)被分析物，則可將細胞壁破壞以使被分析物釋放到反應(yīng)介質(zhì)中。
一旦發(fā)生分析結(jié)合相互作用，則采取相應(yīng)步驟以測定在結(jié)合體系的復(fù)合或未復(fù)合標記組分中可檢測標記物的存在或含量。由于可以用于本技術(shù)的分析類型有多種，所以這些測定方法可以變化很大。例如，如果測定法是均相測定法，則可以采用急冷處理，將與急冷劑示蹤的特異性結(jié)合分子復(fù)合的標記分析物與存在于溶液中的標記分析物區(qū)分開。如果反應(yīng)是其中固液相分離的多相測定，則從固相受體復(fù)合物分離反應(yīng)介質(zhì)，測定固相復(fù)合物或液相未復(fù)合的可檢測標記組分中的標記物。從所用的標記物類型和測定法的具體類型(如均相或多相，產(chǎn)物或未反應(yīng)底物的測定)來看，測定可檢測標記物和兩組分之一是否存在或其含量所需的具體步驟是臨床化學領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯而易見的。測定發(fā)光是在被測介質(zhì)中加合適的引發(fā)物之后進行的，以便按前面討論的那樣誘導(dǎo)發(fā)光。
按照均相或多相測定法所用的不同技術(shù)，可以寬范圍變化實際結(jié)合測定法的各個步驟。由于測定法本身不是本發(fā)明的一部分，所以沒必要介紹各種可以使用的測定法。參見本說明書背景部分所列的出版物關(guān)于生物發(fā)光測定法的例子。
以下提供實施例，該實施例只用來說明，不意味著對本發(fā)明作限制。
實施例在微量滴定板上檢測糖脂在檢測由外源凝集素結(jié)合到固體表面上的糖脂的分析技術(shù)中，采用本發(fā)明降低了本底發(fā)光和提高了靈敏度。
由食用蝸牛(HelixPomatia)得到的外源凝集素用作糖脂測定法中特異性結(jié)合化合物。這種外源凝集素有市售(SigmaChemicalCo)，其特異性已完全被確證(近來的研究，見Torres和Smith的ArchBiochemBiophys(1988)2621-11)。福斯曼糖脂和人血型測定法可分別用于羊或人的紅細胞的全脂提取物的復(fù)合混合物。純化的糖脂是在單親合層析分離的步驟中從這些紅細胞膜的粗提取物得到的(Torres和Smith，1988)。
在測定法中，基本試劑是食用蝸牛(Helix Pomatia)，外源凝集素，重組水母發(fā)光蛋白和抗生蛋白鏈菌素，天然的水母發(fā)光蛋白是從水母(Aeguorea Victoria)得到的20，000道爾頓生物發(fā)光蛋白質(zhì)。每分子蛋白質(zhì)加入時含有1分子腔腸動物型發(fā)色團，即熒光素(Shimomura等人，J.Cell Comp Physiol(1962)59頁223-238;Ward和Cormier Proc Natl.Acad.Sci USA(1975)，72頁2530-2534)在含有Ca2+時，蛋白質(zhì)產(chǎn)生藍光(tmax＝469nm)。量子產(chǎn)率可使得在10-19-10-20M之間檢測水母發(fā)光蛋白。如前所述，將水母光蛋白克隆，可得到其產(chǎn)光性大致與天然水母發(fā)光蛋白的產(chǎn)光性相同的已表達的水母發(fā)光蛋白的克數(shù)。用NHS-LC生物素(Pierce化學公司產(chǎn)品)制備生物素化的水母發(fā)光蛋白(B-AEQ)。將脫輔基水母發(fā)光蛋白以約1.0mg/ml的濃度溶解在0.1M NaHCO3、0.2M NaCl中(PH8.4)。然后加入NHS-LC生物素衍生物以得到比脫輔基水母發(fā)光蛋白過量3倍摩爾的生物素，并于4℃保溫混合物4小時。加入25ul 1M甘氨酸于0.1M NaHCO3(PH8)以終止反應(yīng)。在Sphadex G-25柱(Pharmacia PD-10或等同物)上，從生物素化的脫輔基水母發(fā)光蛋白中分離出反應(yīng)副產(chǎn)物，并將生物素化的蛋白質(zhì)于4℃貯存在50mMTris(0.2MNaCl，5mMEDTA，PH8)中。
抗生蛋白鏈菌素是從阿維丁鏈霉菌得到的60，000道爾頓生物素結(jié)合的蛋白質(zhì)。每分子蛋白質(zhì)可結(jié)合4摩爾生物素(Chalet和Wolf Arch.Biochem.Biophys(1964)106∶1)市售的抗生蛋白鏈菌素高度親合地結(jié)合到生物素上(KD約10-15M)。
生物素化的食用蝸牛(HelixPomatia)凝集素(B-HPA)的制備是在2ml生物素化緩沖劑(0.1M硼酸鈉，PH8.5)中溶解5mg純蛋白質(zhì)(Sigma化學公司)，加入3倍摩爾過量的NHS-LC-生物素(Pierce)和于室溫保溫1小時進行生物素化。該反應(yīng)產(chǎn)物對含5mMEDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-EDTA)透析并保存在-80℃。其它試劑可從市場得到。
將糖脂溶于甲醇中，并將含0.001-25ng糖脂的等分樣品(50ul)稀釋液加到微量滴定板(Falcon＃3911)孔中。在室溫下使甲醇蒸發(fā)過液，使糖脂結(jié)合到微量滴定板孔的表面上。隨后按以下順序進行檢測福斯曼糖脂所用的結(jié)合和洗滌步驟1.)為了防止生物素化的水母發(fā)光蛋白的非特異性結(jié)合，將微量滴定板孔用脫輔基水母發(fā)光蛋白(1mg/ml)和PBS-EDTA的溶液處理30分鐘，隨后用PBS-EDTA洗滌。
2.)加入B-HPA(于PBS-EDTA中，0.1mg/ml)，保溫30分鐘。
3.)用PBS-EDTA洗滌。
4.)與抗生蛋白鏈菌素(SA;0.1mg/ml，于PBC-EDTA中)一起保溫30分鐘。
5.)用PBS-EDTA洗滌。
6.)與B-AEQ(1ug/ml，于PBS-EDTA中)一起保溫30分鐘。
7.)用PBS-EDTA洗滌。
用于保溫和洗滌的溶液體積為200ul，且步驟5-7在4℃下進行。在步驟7之后，微量滴定板孔含有糖脂-(B-HPA)-SA(B-AEQ)三元復(fù)合物。通過使微量滴定板孔與含25mM GalNAC的PBS-EDTA一起保溫30分鐘，洗脫結(jié)合的B-AEQ。在加入Ca++之后用Berthold發(fā)光計(型號9500)計數(shù)含有結(jié)合到糖脂上的B-AEQ的等分洗脫液的光子數(shù)。該初步實驗的結(jié)果示于附圖中。該測定法用于福斯曼糖脂;即與紅細胞糖苷脂不反應(yīng)(所述紅細胞糖苷脂是具有末端β1，3-連接的GalNAC的福斯曼結(jié)構(gòu)的直接前體)，且當反應(yīng)混合物中包含GalNAC時，反應(yīng)則完全受到抑制。
在這種測定法中，檢測微量滴定板孔中福斯曼糖脂的可靠限度是62.5微微克(42毫微微摩爾)。這些結(jié)果證實用在測定之前從三元復(fù)合物中洗脫出水母發(fā)光蛋白的發(fā)光分析法能夠以毫微微摩爾水平檢測福斯曼糖脂。不使用脫輔基水母發(fā)光蛋白作為保護劑的類似測定法所具有的檢測范圍為1000微微克。
本說明中所引用的所有出版物及專利申請在此均作為參改文獻。正像本說明書前面逐一列舉的那樣。
盡管已用說明書和實施例詳細介紹了本發(fā)明，但在不背離本發(fā)明的權(quán)利要求的精神實質(zhì)和范圍的條件下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員顯然可以做出某些改進和變化。
權(quán)利要求
1.檢測樣品中是否存在被分析物的方法，該方法是使被分析物與特異性結(jié)合化合物相互作用以在反應(yīng)介質(zhì)中形成復(fù)合物，其中復(fù)合物的形成是通過測定標記發(fā)光分子在形成復(fù)合物的特異性結(jié)合體系中一組分上發(fā)出的光而檢測的，其特征在于a)用結(jié)合到發(fā)光分子上的光蛋白作為標記物，其中所述發(fā)光分子仍與所述光蛋白結(jié)合，在無外部引發(fā)物時不發(fā)光；b)在所述光蛋白標記物加到所述反應(yīng)介質(zhì)之前，使所述反應(yīng)介質(zhì)與所述光蛋白的脫輔基光蛋白接觸，其中在沒有所述發(fā)光分子時所述脫輔基光蛋白含有所述光蛋白；以及c)在形成所述復(fù)合物之后，將所述引發(fā)物加到所述反應(yīng)介質(zhì)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性結(jié)合化合物是外源凝集素，抗體或細胞表面受體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述特異性結(jié)合化合物附著在固體表面上，從而在所述特異性結(jié)合化合物和所述分析物之間形成固相復(fù)合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述標記組分存在于液相反應(yīng)介質(zhì)中，而且在所述檢測之前，從所述液相反應(yīng)介質(zhì)中分離出所述固相復(fù)合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述光蛋白是腔腸動物光蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述光蛋白是水母發(fā)光蛋白，所述脫輔基光蛋白是脫輔基水母發(fā)光蛋白。
7.權(quán)利要求6的方法，其中加入所述引發(fā)物包括在測定水母發(fā)光蛋白發(fā)出的光之前立即加入鈣離子于所述反應(yīng)介質(zhì)中。
全文摘要
檢測樣品中是否存在被分析物的改進方法，該方法是使被分析物與特異性結(jié)合化合物相互作用以在反應(yīng)介質(zhì)中形成復(fù)合物，其中復(fù)合物的形成是通過測定用作標記物的發(fā)光分子在形成復(fù)合物的特異性結(jié)合體系的一組分上發(fā)出的光檢測的，其特征在于用結(jié)合到發(fā)光分子上的光蛋白作標記物，在無外加引發(fā)物時發(fā)光分子不發(fā)光而且仍與光蛋白結(jié)合；在光蛋白標記物加到反應(yīng)介質(zhì)之前使反應(yīng)介質(zhì)與脫輔基光蛋白接觸以降低本底發(fā)光；在形成復(fù)合物后，在反應(yīng)介質(zhì)中加入引發(fā)物。
文檔編號G01N33/68GK1046605SQ9010198
公開日1990年10月31日 申請日期1990年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月10日
發(fā)明者大衛(wèi)F·史密斯, 理查德O·麥堅拿 申請人:Ela技術(shù)有限公司