專利名稱：一種鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，快速檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯殘留的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，屬于殘留的免疫化學(xué)速測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)又稱酞酸酯，是一類環(huán)境雌激素，是常用增塑劑之一。被普遍應(yīng)用于玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、乙烯地板和壁紙、清潔劑、潤(rùn)滑油、個(gè)人護(hù)理用品(如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液)等數(shù)百種產(chǎn)品中。鄰苯二甲酸酯可干擾內(nèi)分泌，使男性精子數(shù)量減少、運(yùn)動(dòng)能力低下、形態(tài)異常，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致死精癥和睪丸癌，是造成男性生殖問題的“罪魁禍?zhǔn)住?，甚至影響胚胎發(fā)育，表現(xiàn)出殖發(fā)育毒性。目前，環(huán)境中殘留、積累的鄰苯二甲酸酯的現(xiàn)象普遍存在，人體主要通過食品和空氣兩個(gè)途徑吸收它。越來越多的權(quán)威科學(xué)家認(rèn)定，過去幾十年來男性精子數(shù)量和生育能力的下降與攝入越來越多的鄰苯二甲酸酯有關(guān)。為了男性健康，專家們呼吁男性少用化妝品。通常，人們?nèi)菀自谒苣z制品包裝中接觸到鄰苯二甲酸酯類，在生活中有很多食物在加工、力口熱、包裝、盛裝的過程里可能會(huì)造成塑化劑的溶出且滲入食物中。例如塑膠玩具、覆蓋食物微波加熱的保鮮膜、盛裝食物的塑膠容器、室內(nèi)裝潢或家庭產(chǎn)品亦多數(shù)屬于塑膠材質(zhì)、吃手扒雞的塑膠手套、醫(yī)療用的塑膠手套或輸血袋等，都可見鄰苯二甲酸酯類的蹤影。兒童用品中的鄰苯二甲酸酯最為重視。有關(guān)專家發(fā)現(xiàn)，含有鄰苯二甲酸酯的軟塑料玩具及兒童用品有可能被小孩放進(jìn)口中，如果放置的時(shí)間足夠長(zhǎng)，就會(huì)導(dǎo)致鄰苯二甲酸酯的溶出量超過安全水平，會(huì)危害兒童的肝臟和腎臟，也可引起兒童性早熟。一項(xiàng)最新的研究表明，鄰苯二甲酸酯可能與美國(guó)男性肥胖以及糖尿病有關(guān)。在1982年，美國(guó)國(guó)家毒理規(guī)劃署的實(shí)驗(yàn)報(bào)告就已確證大小白鼠通過食物長(zhǎng)期吸收鄰苯二甲酸酯可引發(fā)肝癌。由于塑化劑對(duì)環(huán)境及人類健康的危害，WHO 1995年公布，鄰苯二甲酸酯類化合物是必須控制一類擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)?；赑AEs在環(huán)境中的富集作用對(duì)人類健康造成的嚴(yán)重危害，EPA(美國(guó)國(guó)家環(huán)保局)將6種PAEs列為優(yōu)先控制污染物即鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP) ;8種PAEs被列入WWF (世界野生動(dòng)物保護(hù)基金會(huì))的環(huán)境激素名單中。在我國(guó)，DMP、DBP和DOP被列入“中國(guó)環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單”。世界各國(guó)對(duì)塑化劑類產(chǎn)品均加強(qiáng)了監(jiān)控與檢測(cè)。目前，PAEs的檢測(cè)方法有分光光度法、薄層色譜法、氣相色譜法(GC)、氣相色譜/質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)。EPA的標(biāo)準(zhǔn)方法是GC-ECD-MS法，我國(guó)擬發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)方法是正相高效液相色譜法(NP-HPLC)。采用分光光度法分析PAEs時(shí)，只適用于PAEs總量的測(cè)定，在特定組分的檢測(cè)上具有一定的局限性，并且檢測(cè)限較高，難以適應(yīng)微量檢測(cè)的需要。色譜法是國(guó)內(nèi)外比較常用的方法。在用GC-MS、HPLC方法檢測(cè)PAEs時(shí)，具有更好的靈敏度和選擇性。但這些方法大都需要復(fù)雜的前處理，昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力且成本高，與其它檢測(cè)系統(tǒng)相比，一次檢測(cè)樣品量少，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，僅作為少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的確證方法，滿足不了環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)快速簡(jiǎn)便的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種敏感度高、成本低的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙。同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供一種制備鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的還在于提供一種鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙?jiān)跈z測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯殘留中的應(yīng)用。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊和背襯，在所述的反應(yīng)膜上包被有鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)，結(jié)合物釋放墊上包被有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。所述的樣本墊，結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜及吸水墊依次設(shè)置在背襯上。所述的鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物由鄰苯二甲酸二丁酯經(jīng)過硝化與還原反應(yīng)后形成4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，然后與載體蛋白偶聯(lián)得到。所述鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、卵清蛋白、鐵蛋白或多聚賴氨酸。所述的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體是以鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物后制備獲得。同時(shí)，本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種制備鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙的方法,具體步驟如下(I)制備包被鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；(2)制備具有包被鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)月旲；(3)將步驟(I)制備好的結(jié)合物釋放墊和步驟(2)制備好的反應(yīng)膜與樣本墊、吸水墊和背襯組裝成試紙。本發(fā)明的制備鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙的方法，具體包括以下步驟(I)半抗原制備將鄰苯二甲酸二丁酯與經(jīng)過硝化與還原反應(yīng)后形成4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯半抗原；(2)將鄰苯二甲酸二丁酯與載體蛋白偶聯(lián)，形成鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物； (3)用鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到分泌鄰苯二甲酸二丁酯的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；
(4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；(5)將制備的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體加入步驟4)制備的膠體金中，得到鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；(6)將鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合物釋放墊上，用含0. 1-1. 5%卵清蛋白的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制的緩沖液浸濕30秒，37°C烘2h備用；(7)將鄰苯二甲酸二丁酯-人血清白蛋白偶聯(lián)物(HSA)包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成測(cè)試區(qū)，并將羊抗鼠IgG包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控區(qū)，用含0. I %牛血清的封閉液進(jìn)行封閉；(8)將樣本墊0. 1-1. 5%的兔血清蛋白、1-1. 5%吐溫-20用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制的緩沖液浸泡2h，37°C烘2h備用；

(9)鄰苯二甲酸二丁酯膠體金試紙卡的組裝在背襯上按順序依次粘附反應(yīng)膜、吸水墊、結(jié)合物釋放墊和樣本墊，然后切成3_寬的小條，加塑料盒，真空包裝。本發(fā)明的方法還采用了一種鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙?jiān)跈z測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯殘留中的應(yīng)用。本發(fā)明的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)試紙采用高度特異性的抗體-抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，在反應(yīng)膜測(cè)試區(qū)包被鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)抗原、結(jié)合物釋放墊包被膠體金標(biāo)記的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體，利用競(jìng)爭(zhēng)法來檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鄰苯二甲酸二丁酯。通過待測(cè)樣品中鄰苯二甲酸二丁酯與包被在反應(yīng)膜上的鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物共同競(jìng)爭(zhēng)鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，根據(jù)測(cè)試區(qū)紅色條帶有無或顏色深淺來判斷待測(cè)樣品液中是否含有鄰苯二甲酸二丁酯或含量多少。本發(fā)明的試紙將樣本墊蓋住結(jié)合物釋放墊可以延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果的觀察時(shí)間，樣本墊也可以將檢測(cè)液體充分吸收能與金標(biāo)抗體完全接觸充分反應(yīng)、減少誤差。本發(fā)明的膠體金試紙具有敏感度高、價(jià)格低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。適合應(yīng)用于大批樣品的檢測(cè)，尤其是免疫層析法，檢測(cè)速度快，靈敏度高，與HPLC、GC-MS檢測(cè)有較高一致性，而且非常適合活體動(dòng)物的檢測(cè)；成本低，無需大型儀器，而且可以直接對(duì)尿液、飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。被廣泛用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)、銷售、質(zhì)量監(jiān)督、衛(wèi)生檢驗(yàn)、進(jìn)出口檢驗(yàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖和漁業(yè)生產(chǎn)的鄰苯二甲酸酯檢測(cè)。本發(fā)明的對(duì)鄰苯二甲酸酯免疫學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)提我國(guó)高環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品鄰苯二甲酸酯控制和監(jiān)測(cè)水平，保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和消費(fèi)者的健康具有重要意義。檢測(cè)時(shí)，樣品滴入試劑卡孔內(nèi)，當(dāng)鄰苯二甲酸二丁酯在樣品中濃度低時(shí)，膠體金抗體在層析過程中會(huì)被固定在反應(yīng)膜上的鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)物結(jié)合，在測(cè)試區(qū)(T)質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)各一條紅色條帶。如果鄰苯二甲酸二丁酯在樣品中濃度高時(shí)，膠體金抗體與鄰苯二甲酸二丁酯全部結(jié)合，從而在(T)區(qū)內(nèi)因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)反應(yīng)不會(huì)與鄰苯二甲酸二丁酯偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣品在檢測(cè)過程中由于缺少抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，將會(huì)在(T)區(qū)與(C)區(qū)內(nèi)出現(xiàn)紅色條帶。陽性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，而⑴區(qū)不顯色時(shí)，判為陽性。陰性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，⑴區(qū)同時(shí)也顯示出紅色條帶，且⑴區(qū)顏色接近(C)線或者淺于(C)線時(shí)，判為陽性。無效當(dāng)(C)區(qū)不顯示出紅色條帶，則無論(T)區(qū)顯示出紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。


圖I為本發(fā)明檢測(cè)試紙卡的組裝示意圖；圖2為本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果分析示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本發(fā)明的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠 體金免疫試紙，包括反應(yīng)膜2、樣本墊
3、結(jié)合物釋放墊4、吸水墊5和背襯1，在所述的反應(yīng)膜2上包被有鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)6和羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)7，結(jié)合物釋放墊4包被有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物8。本實(shí)施例的樣本墊3，結(jié)合物釋放墊4、反應(yīng)膜2及吸水墊5依次設(shè)置在背襯I上。鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物由鄰苯二甲酸二丁酯經(jīng)過硝化與還原反應(yīng)后形成4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，然后與載體蛋白偶聯(lián)得到。其中，鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白為牛血清白蛋白。鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體是以鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物后制備獲得。實(shí)施例2本發(fā)明的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙制備方法包括以下步驟I、鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定(I) 4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯-牛血清白蛋白的合成取碳化二亞胺IOOmg用pH8. 0的10mol/L PBS液3. Oml充分溶解(簡(jiǎn)稱I液)；取
4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯IOmg溶于Iml 二甲基甲酰胺(2液)；取牛血清白蛋白20mg溶于Iml 10mol/L的PBs (pH8. 0)液中(3液);將(2液)與(3液)混合，在磁力攪拌下逐漸加A (I液)，4°C攪拌12h。用蒸餾水使之充分透析4-6天，得免疫抗原。2、鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的制備(I)動(dòng)物免疫將免疫抗原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為50 y g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。(2)細(xì)胞融合和克隆取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5 : I比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將鄰苯二甲酸二丁酯的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成IXlO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
(4)單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后腹腔注射鄰苯二甲酸二丁酯的單克隆雜交瘤細(xì)胞IO5個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸按法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入_20°C環(huán)境保存。3、鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(I)膠體金的制 備用雙蒸去離子水將I %氯金酸稀釋成0.01%，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每IOOmlO. 01 %氯金酸加入2ml I %檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期為一個(gè)月。(2)鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下,用0. IM碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8. 2,按I 2 ii g/ml抗體膠體金加入抗體鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10% BSA至終濃度為I %，靜置30min。12000rpm、4°C離心30min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用，保存60天。4、結(jié)合物釋放墊的包被將結(jié)合物釋放墊浸泡于含有0. 1-1. 5%的卵清蛋白的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制的緩沖液中浸濕30秒，37°C烘2h ;用點(diǎn)膜儀將制備好的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物均勻包被在結(jié)合物釋放墊上，真空干燥，真空封裝，置4°C備用。5、硝酸纖維素膜的處理處理包被鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成測(cè)試區(qū)，包被羊抗鼠IgG構(gòu)成質(zhì)控區(qū)，再用含0. 1%牛血清的封閉液進(jìn)行封閉。包被過程將硝酸纖維素膜用用磷酸緩沖液(含3%的甲醇)將鄰苯二甲酸二丁酯-血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜作為測(cè)試區(qū)，包被量為0. 8 u g/cm2，測(cè)試區(qū)靠近結(jié)合墊端，距結(jié)合墊端約8mm ;用0. OlM pH 7. 4PBS緩沖液(含3%的甲醇)將羊抗鼠IgG抗體稀釋到150 yg/ml，用點(diǎn)膜儀將其包被于纖維素膜作為質(zhì)控區(qū)，包被量為0. 8 u g/cm2,質(zhì)控區(qū)靠近吸水墊，距吸收墊約8mm，兩線距離5_8mm。37°C烘干，封裝。6、膠體金免疫試紙卡的組裝在PVC背襯上按順序粘附硝酸纖維素膜、吸水墊、結(jié)合物釋放墊和樣本墊，將貼樣本墊蓋住結(jié)合物釋放墊，然后切成2-3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝。原包裝應(yīng)在18-25°C的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效期一年。本發(fā)明的試紙卡將樣本墊蓋住結(jié)合物釋放墊可以延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果觀察時(shí)間，樣本墊也可以將檢測(cè)液體充分吸收能與金標(biāo)抗體完全接觸、充分反應(yīng)，從而減少誤差。實(shí)施例3 :樣本中殘留的檢測(cè)I、樣本前處理稱取雞肉、豬肉、豬肝、香腸、魚肉、蝦肉、蜂蜜、膨化食品等樣本50g，勻漿，放入具塞三角瓶中，加入IOOml提取劑(甲醇、乙酸乙酯等)，提取lh。離心，取上清，濃縮至1ml，用PBS或生理鹽水稀釋。
2、用試紙卡檢測(cè)將樣品用滴管滴入試劑卡孔內(nèi)，滴加3滴，加后計(jì)時(shí)，5_8min內(nèi)觀察結(jié)果。超過IOmin樣品檢測(cè)判讀無效。3、檢測(cè)結(jié)果分析陽性當(dāng)(C)區(qū)顯紅色條帶，而⑴區(qū)不顯色，判為陽性。陰性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，⑴區(qū)同時(shí)也顯示出紅色條帶，且⑴區(qū)顏色接近或淺于(C)區(qū)時(shí)，判為陰性。 無效當(dāng)(C)區(qū)不顯示出紅色條帶，則無論(T)區(qū)顯示出紅色條帶與否，該試紙卡判為無效。
權(quán)利要求
1.一種鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，其特征在于包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊和背襯，在所述的反應(yīng)膜上包被有鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)，結(jié)合物釋放墊包被有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，其特征在于所述的樣本墊，結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜及吸水墊依次設(shè)置在背襯上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，其特征在于所述的鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物由鄰苯二甲酸二丁酯經(jīng)過硝化與還原反應(yīng)后形成4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯半抗原，然后與載體蛋白偶聯(lián)得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，其特征在于所述鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、卵清蛋白、鐵蛋白或多聚賴氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙，其特征在于所述的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體是以鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫抗原免疫試驗(yàn)動(dòng)物后制備獲得。
6.一種制備如權(quán)利要求I所述鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙的方法，其特征在于，具體步驟如下 (1)制備包被鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊； (2)制備具有包被鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜； (3)將步驟(I)制備好的結(jié)合物釋放墊和步驟(2)制備好的反應(yīng)膜與樣本墊、吸水墊和背襯組裝成試紙。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙的方法，其特征在于，具體包括以下步驟 (1)半抗原制備將鄰苯二甲酸二丁酯與經(jīng)過硝化與還原反應(yīng)后形成4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯半抗原； (2)將鄰苯二甲酸二丁酯與載體蛋白偶聯(lián)，形成鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物； (3)用鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到分泌鄰苯二甲酸二丁酯的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株； (4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金； (5)將制備的鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體加入步驟4)制備的膠體金中，得到鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； (6)將鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合物釋放墊上，用含O.1-1. 5%卵清蛋白的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制的緩沖液浸濕30秒，37°C烘2h備用； (7)將鄰苯二甲酸二丁酯-人血清白蛋白偶聯(lián)物(HSA)包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成測(cè)試區(qū)，并將羊抗鼠IgG包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控區(qū)，用含O. 1%牛血清的封閉液進(jìn)行封閉； (8)將樣本墊0.1-1. 5%的兔血清蛋白、1-1. 5%吐溫-20用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制的緩沖液浸泡2h，37°C烘2h備用； (9)鄰苯二甲酸二丁酯膠體金試紙卡的組裝在背襯上按順序依次粘附反應(yīng)膜、吸水墊、結(jié)合物釋放墊和樣本墊，然后切成3_寬的小條，加塑料盒，真空包裝。
8.—種如權(quán)利要求I所述的鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙?jiān)跈z測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯快速檢測(cè)用膠體金免疫試紙及其制備方法和應(yīng)用，包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊和背襯，在所述的反應(yīng)膜上包被有鄰苯二甲酸二丁酯-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)，結(jié)合物釋放墊包被有鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。本發(fā)明提供的試紙可用于檢測(cè)雞肉、豬肉、尿液、蜂蜜等動(dòng)物源性食品中的鄰苯二甲酸二丁酯殘留含量。該試紙操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、檢測(cè)速度快、適合大規(guī)模推廣、能夠現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合大量樣本篩查，不需專用儀器設(shè)備及專業(yè)人員，易推廣實(shí)施。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102680714SQ201210010889
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者周變?nèi)A, 孔濤, 常景周, 張才, 李嘉嘉, 李潤(rùn)樂, 楊自軍, 王振華, 趙振升, 郝雪琴, 魏迎軍 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)