專利名稱：用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器及水體毒性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水體檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器及水體總毒性的檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著人類生產(chǎn)活動的發(fā)展，大量化學品不斷進入水環(huán)境中，成為水體污染的主要污染源。這些化學品污染物大多不是人體組成成分，也不是人體所需營養(yǎng)物質(zhì)或維持正常生理功能必須的物質(zhì)，但其可與人體接觸并進入人體，產(chǎn)生一定的生物學作用，如當有毒有害化學品通過食物網(wǎng)的放大作用進入人體內(nèi)可能會危害人體健康甚至生命。另外，水體中化學品污染也會使水體中的生物收到危害，因此，對水體毒性進行檢測及監(jiān)測是評價水體是否收到污染以及判斷污染程度的重要手段。在水體毒性檢測及監(jiān)測方法中，生物檢測由于結(jié)果直觀等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注， 蛙類、魚類、小鼠、浮游生物、海藻等生物已被用于水體毒性檢測，但是，以上述生物進行水體毒性檢測時具有測試周期長、成本高、操作復(fù)雜等缺點，不僅難以推廣，而且不能滿足現(xiàn)場快速檢測需要。微生物種群數(shù)量大、生長周期短、對環(huán)境變化的敏感性高，具有與高等動物類似的物理化學特性和酶作用過程，因此適合開發(fā)省時、低耗、無道德爭議的快速生物學毒性測試方法，尤其適合開發(fā)小型便攜式水體毒性檢測設(shè)備。在微生物毒性檢測方法中，基于發(fā)光微生物的檢測技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。國際IS011348-3規(guī)定使用深海發(fā)光細菌 V. fischeri作為受試生物，為了平衡滲透壓，測試必須在高鹽度條件下進行，可能會引起樣品中某些化學品性質(zhì)的改變，如，對于低濃度金屬樣品，鹽度校正會導致假陰性的結(jié)果；而對于一些溶解度低的樣品，如苯酚等，則會由于毒物的析出而導致假陽性結(jié)果。而且，該方法采用熒光檢測，檢測信號易受水體濁度影響，不適于渾濁和有顏色的樣品。另外，發(fā)光細菌在自然界中不是普遍存在的微生物，獲得和保存較為困難，商品發(fā)光細菌價格較為昂貴， 導致檢測成本較高。電分析儀器具有檢測靈敏度高、成本低、適合小型化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、生物分析、醫(yī)學檢測等領(lǐng)域。在微生物的新陳代謝過程中，微生物可以通過自身的呼吸作用將電子傳遞給電子媒介體，當毒性物質(zhì)存在時，微生物的呼吸作用受到抑制，進而阻礙微生物和電子媒介體之間的電子傳遞，因此，可以開發(fā)基于微生物的用于水體毒性檢測和監(jiān)測的電化學方法和儀器。如美國Lincon Technology開發(fā)了 Micredox系統(tǒng)，其可以用于檢測水體的生物需氧量；新西蘭的Pasco等人將鐵氰化鉀引入Micredox系統(tǒng)，通過測定在不同毒性物質(zhì)存在條件下微生物與作為電子媒介體的鐵氰化鉀分子之間的電子傳遞速率， 證實該系統(tǒng)可用于水體毒性檢測。但是，該系統(tǒng)直接以懸浮微生物為受試生物，懸浮微生物使用時每次都需要重新培養(yǎng)、離心、清洗等過程，不僅增加了操作時間和操作復(fù)雜性，而且由于每次培養(yǎng)的懸浮微生物狀態(tài)不可能達到完全一致，會影響檢測的靈敏度及穩(wěn)定性
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器及水體毒性的檢測方法，本發(fā)明提供的檢測方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單，適于在線水體毒性檢測和監(jiān)測。本發(fā)明提供了一種用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器，包括載體和固定在所述載體上的微生物。優(yōu)選的，所述載體為活性炭、多孔陶土、微孔玻璃、海藻酸鹽、卡拉膠、瓊脂、聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇凝膠或聚氨酯泡沫。優(yōu)選的，所述微生物為大腸桿菌、熒光假單孢菌、惡臭假單孢菌和陰溝腸桿菌中的一種或多種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的微生物反應(yīng)器包括載體和固定在所述載體上的微生物。在該微生物反應(yīng)器中，微生物被固定在載體中，不能移動，但是小分子底物和反應(yīng)代謝產(chǎn)物等可自由出入載體內(nèi)部，不僅能夠保持活性且能夠重復(fù)利用，用于檢測水體毒性時無需每次都重復(fù)培養(yǎng)、離心、清洗等過程，不僅節(jié)省了操作時間、降低了操作復(fù)雜性，而且由于微生物在所述載體上能夠長時間保持活性不變，不會影響檢測的靈敏度及穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了一種水體毒性的檢測方法，包括以下步驟a)向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水樣，培養(yǎng)后得到混合溶液；b)采用三電極體系檢測所述步驟a)中得到的混合溶液的電流。優(yōu)選的，在所述步驟a)之前還包括向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和標準水樣，培養(yǎng)后得到第一混合溶液；采用三電極體系檢測所述第一混合溶液的電流。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的溫度為35°C 38°C，所述培養(yǎng)的時間為0. 5h 池。優(yōu)選的，所述步驟a)中，所述電子媒介體為鐵氰化鉀、中性紅、二茂鐵或二茂鐵的衍生物。優(yōu)選的，所述步驟a)中，所述電子媒介體在所述待測水樣中的濃度為40mmol/L 50mmol/L。優(yōu)選的，所述步驟b)中，所述三電極體系中的工作電極為微陣列電極。優(yōu)選的，所述微陣列電極為鉬微陣列電極。本發(fā)明以固定于載體上的微生物作為受試生物，在所述微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水體后，可采用三電極體系檢測待測水樣的電流，從而獲得水體毒性檢測結(jié)果。本發(fā)明以固定于載體上的微生物作為受試生物不僅能夠保持活性且能夠重復(fù)利用，用于檢測水體毒性時無需每次都重復(fù)培養(yǎng)、離心、清洗等過程，不僅節(jié)省了操作時間、降低了操作復(fù)雜性，而且由于微生物在所述載體上能夠長時間保持活性不變，不會影響檢測的靈敏度及穩(wěn)定性；本發(fā)明通過電化學方法檢測待測水體的毒性，不受水體濁度和色度的影響， 同時能夠以多種微生物作為受試生物，避免了對毒性物質(zhì)的選擇性，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，更加適合水體毒性的檢測需求。實驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供的方法檢測得到的毒性物質(zhì)的IC50值與采用MICR0T0X檢測儀檢測得到的IC50值相當，低于以懸浮微生物為受試生物檢測得到的IC50值。


圖1為本發(fā)明實施例1制備的包埋有大腸桿菌的海藻酸鈣細絲的電鏡照片；圖2為本發(fā)明實施例制備的未包埋有大腸桿菌的海藻酸鈣細絲的電鏡照片；圖3為本發(fā)明實施例21提供的濃度與電流抑制率的曲線圖；圖4為本發(fā)明實施例22提供的濃度與電流抑制率的曲線圖；圖5為本發(fā)明實施例23提供的濃度與電流抑制率的曲線圖；圖6為本發(fā)明實施例M提供的濃度與電流抑制率的曲線圖；圖7為本發(fā)明實施例沈提供的固定微生物重量與電流抑制率的曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器，包括載體和固定在所述載體上的微生物。本發(fā)明提供的微生物反應(yīng)器中，微生物被固定在載體中，不能移動，但是小分子底物和反應(yīng)代謝產(chǎn)物等可自由出入載體內(nèi)部，不僅能夠保持活性且能夠重復(fù)利用，用于檢測水體毒性時無需每次都重復(fù)培養(yǎng)、離心、清洗等過程，不僅節(jié)省了操作時間、降低了操作復(fù)雜性，而且由于微生物在所述載體上能夠長時間保持活性不變，不會影響檢測的靈敏度及穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，所述載體的作用在于固定微生物，其需要滿足以下特性操作過程簡單易行；對細胞無毒害作用；傳質(zhì)性能良好；不易被微生物分解；性質(zhì)穩(wěn)定；強度高、壽命長等。在本發(fā)明中，所述載體可以為無機材料、天然有機材料或者合成有機材料等，其中，無機材料包括但不限于活性炭、多孔陶土、微孔玻璃等，優(yōu)選為活性炭，具有強度大、傳質(zhì)性好、 對細胞無毒害、制備過程簡單等優(yōu)點；天然有機材料包括但不限于海藻酸鹽、卡拉膠、瓊脂等，優(yōu)選為海藻酸鹽，具有對微生物無毒害作用、傳質(zhì)性好等優(yōu)點；合成有機材料包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇凝膠、聚氨酯泡沫等，優(yōu)選為聚乙烯醇凝膠，具有強度高、化學穩(wěn)定性好等優(yōu)點。在本發(fā)明中，所述微生物作為檢測水體毒性的受試生物存在，本發(fā)明對其并無特殊限制，可以為單一菌種，也可以為混合菌種，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要進行選擇或確定。所述微生物優(yōu)選為大腸桿菌、熒光假單孢菌、惡臭假單孢菌和陰溝腸桿菌中的一種或多種，更優(yōu)選為大腸桿菌或熒光假單孢菌。本發(fā)明對所述微生物固定在所述載體上的方式?jīng)]有特殊限制，可以為吸附、包埋、 交聯(lián)、化學共價或自身固定化等方法。本發(fā)明對所述微生物的個數(shù)與所述載體的重量沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)選用的微生物種類、載體種類和固定方式自行確定。本發(fā)明對所述微生物反應(yīng)器的制備方法沒有特殊限制，可以按照以下方法制備(1)吸附法依據(jù)帶電微生物細胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力的作用， 使微生物固定在載體表面和內(nèi)部形成微生物反應(yīng)器的方法，具體包括以下步驟將載體干燥后置于接種菌體的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后得到微生物反應(yīng)器。在采用吸附法制備微生物反應(yīng)器時，所述載體為具有吸附功能的多孔類載體，如活性炭等。
本發(fā)明首先將載體干燥后在接種有菌體的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，微生物被吸附到載體內(nèi)部或表面，形成微生物反應(yīng)器。本發(fā)明對所述干燥和培養(yǎng)的參數(shù)均沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)選用的載體種類、微生物種類等進行選擇和確定。如，載體為碳氈、微生物為熒光假單孢菌時，干燥的溫度優(yōu)選為60°C 100°C，時間優(yōu)選為池 8h ；培養(yǎng)溫度優(yōu)選為28 V 32°C，時間優(yōu)選為20h 25h，優(yōu)選在80r/min 120r/min的轉(zhuǎn)速下進行培養(yǎng)。(2)包埋法又叫包埋固定化，是使微生物細胞包埋在聚合物或膜內(nèi)，或使微生物細胞擴散進入多孔性的載體內(nèi)部，小分子底物及反應(yīng)代謝產(chǎn)物可自由出入，而微生物固定不動。以海藻酸鈣為例，采用包埋法制備微生物反應(yīng)器的方法如下培養(yǎng)微生物，得到微生物懸浮液；將海藻酸鈉溶于水中，得到海藻酸鈉溶液；將所述微生物懸浮液和所述海藻酸鈉溶液混合，得到混合溶液；采用注射器將所述混合溶液注入到氯化鈣溶液中，得到包埋有微生物的海藻酸鈣絲；將所述包埋有微生物的海藻酸鈣絲固化后，得到微生物反應(yīng)器。本發(fā)明對所述培養(yǎng)微生物的方法沒有特殊限制，根據(jù)選用的不同種類的微生物進行擴大培養(yǎng)即可。本發(fā)明對所述微生物的個數(shù)和所述海藻酸鈣的重量比沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行確定。(3)交聯(lián)法利用微生物中酶分子中的氨基或羥基與交聯(lián)劑的官能基團發(fā)生反應(yīng)，交聯(lián)形成共價鍵，使微生物菌體相互形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)微生物的固定化。(4)化學共價法使非水溶性載體與微生物以共價鍵的形式結(jié)合。(5)自身固定化法依靠微生物自身的絮凝作用在載體上固定化形成。得到微生物反應(yīng)器后，可將其用于水體毒性檢測及監(jiān)測，且使用時無需每次都重復(fù)培養(yǎng)、離心、清洗等過程，不僅節(jié)省了操作時間、降低了操作復(fù)雜性，而且由于微生物在所述載體上能夠長時間保持活性不變，不會影響檢測的靈敏度及穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了一種水體毒性的檢測方法，包括以下步驟a)向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水樣，得到混合溶液；b)采用三電極體系檢測所述步驟a)中得到的混合溶液的電流。本發(fā)明以固定于載體上的微生物作為受試生物，在所述微生物反應(yīng)器中加入待測水樣和電子媒介體后，可采用三電極體系檢測待測水樣電流，本發(fā)明通過電化學方法檢測待測水樣的毒性，不受水體濁度和色度的影響，同時能夠以多種微生物作為受試生物，避免了對毒性物質(zhì)的選擇性，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，更加適合水體毒性的檢測需求。本發(fā)明提供的方法可用于水體急性毒性檢測，也可以用于水體毒性日常監(jiān)測，用于水體毒性日常監(jiān)測時，將電子媒介體和待測水體加入到上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，同時采用三電極體系檢測所述待測水體的電流，根據(jù)電流變化即可判斷水體日常毒性；用于水體急性毒性檢測時，以未受污染的水或自來水作為標準水體，將標準水樣和待測水樣分別與電子媒介體混合之后加入到上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中進
6行培養(yǎng)，同時采用三電極體系分別檢測所述標準水樣和待測水樣的電流，進行對比后即可判斷待測水體急性毒性情況。在本發(fā)明中，所述水體急性毒性檢測方法具體包括以下步驟向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入標準水樣和電子媒介體，得到第一混合溶液；采用三電極體系檢測所述第一混合溶液的電流值；向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水樣，得到第二混合溶液；采用三電極體系檢測所述第二混合溶液的電流值；根據(jù)所述第一混合溶液的電流值和所述第二混合溶液的電流值判斷水體毒性污染情況。所述對水體的日常監(jiān)測方法具體包括以下步驟向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水樣，得到混合溶液；采用三電極體系檢測所述混合溶液的電流值；根據(jù)電流值的變化即可判斷水體毒性變化情況。在本發(fā)明中，對所述標準水樣和待測水樣進行檢測或監(jiān)測時所采用的微生物反應(yīng)器、電子媒介體的種類、用量等均相同，本發(fā)明以待測水體為例進行說明。對待測水體毒性進行檢測時，首先向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水樣，進行培養(yǎng)后得到混合溶液。本發(fā)明對所述培養(yǎng)的溫度、時間和方式?jīng)]有特殊限制，可根據(jù)選用的微生物的種類進行確定，如微生物為大腸桿菌時，優(yōu)選為35°C 38°C下保溫培養(yǎng)0. 5h 2h。在進行培養(yǎng)過程中，微生物進行新陳代謝，消耗氧氣分解有機物，并將其轉(zhuǎn)化為簡單的無機物，如式(1)、式(2)所示02(aq)+4H++4e" ^ 2H20(I) (2)在此過程中，有機物被微生物降解，生成CO2,并產(chǎn)生4個電子；水中的氧分子接受 4個電子，生成兩個水分子；由于氧氣在水中的溶解度較低，在無氧的條件下，電子媒介體， 如鐵氰化鉀等可取代氧作為人工電子受體，生成CO2和亞鐵氰化鉀，如式C3)所示由式⑴、式⑵和式⑶可知，微生物降解有機物的過程可被簡化為電子傳遞的過程，即微生物降解速率與電子傳遞速率成比例，進而導致呼吸速率與電子傳遞成比例。當毒性物質(zhì)侵入水體時，上述微生物的正常呼吸作用將受到抑制，甚至導致微生物的死亡，微生物由于呼吸作用向外傳遞的電子的數(shù)量也會隨之減少。根據(jù)該過程，可以采用待測水體進入微生物反應(yīng)器前后微生物呼吸速率受到的抑制程度表征水體毒性，具體為采用電流抑制率與濃度之間的關(guān)系(ic，Inhibitory Concentration)來表征水體毒性，可通過公式(I)計算電流抑制率
權(quán)利要求
1.一種用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器，包括載體和固定在所述載體上的微生
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物反應(yīng)器，其特征在于，所述載體為活性炭、多孔陶土、 微孔玻璃、海藻酸鹽、卡拉膠、瓊脂、聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇凝膠或聚氨酯泡沫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物反應(yīng)器，其特征在于，所述微生物為大腸桿菌、熒光假單孢菌、惡臭假單孢菌和陰溝腸桿菌中的一種或多種。
4.一種水體毒性的檢測方法，包括以下步驟a)向權(quán)利要求1 3任意一項所述的微生物反應(yīng)器中加入待測水樣和電子媒介體，培養(yǎng)后得到混合溶液；b)采用三電極體系檢測所述步驟a)中得到的混合溶液的電流。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，在所述步驟a)之前還包括 向標準水樣中加入電子媒介體和權(quán)利要求1 3任意一項所述的微生物反應(yīng)器，培養(yǎng)后得到第一混合溶液；采用三電極體系檢測所述第一混合溶液的電流。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的溫度為30°C 40°C，所述培養(yǎng)的時間為0. 5h 2h。
7.根據(jù)權(quán)利要求3 6任意一項所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟a)中，所述電子媒介體為鐵氰化鉀、中性紅、二茂鐵或二茂鐵的衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟a)中，所述電子媒介體在所述待測水樣中的濃度為40mmol/L 50mmol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟b)中，所述三電極體系中的工作電極為微陣列電極。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述微陣列電極為鉬微陣列電極。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測水體毒性的微生物反應(yīng)器，包括載體和固定在所述載體上的微生物。本發(fā)明還提供了一種水體毒性的檢測方法，包括以下步驟a)向上述技術(shù)方案所述的微生物反應(yīng)器中加入電子媒介體和待測水樣，培養(yǎng)后得到混合溶液；b)采用三電極體系檢測所述步驟a)中得到的混合溶液的電流。本發(fā)明以固定于載體上的微生物作為受試生物不僅能夠長時間保持活性且能夠重復(fù)利用，相對于懸浮微生物用于檢測水體毒性來講，無需每次都經(jīng)歷重復(fù)培養(yǎng)、離心、清洗等過程，不僅節(jié)省了操作時間、降低了操作復(fù)雜性，而且由于微生物在所述載體上能夠長時間保持活性不變，不會影響檢測的靈敏度及穩(wěn)定性。
文檔編號G01N27/327GK102520040SQ20121000480
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者董紹俊, 雍達明 申請人:中國科學院長春應(yīng)用化學研究所