專利名稱：基于免疫磁酶的檢測伏馬毒素b1的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測工程技術領域的方法，具體是一種快速檢測谷物類、谷物類相關產品、飼料中伏馬毒素Bl的方法。
背景技術：
伏馬毒素Bl (Fumonisin Bi, FBI)是串珠鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產生的次級代謝產物，在全世界范圍內分布廣泛。1988年，Gelderblom等首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。伏馬毒素能夠對玉米及其制品造成污染，而且在以谷物為原料的一些產品中如面條、啤酒、調味品，甚至在蘆筍中也檢測到了伏馬毒素。據報道，伏馬毒素與馬腦白質軟化癥，豬的肺水腫癥候群，大鼠肝癌等疾病有關。除上述疾病外，在南非的特蘭斯凱地區(qū)和中國林縣地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，食用伏馬毒素污染的玉米制品與人類食道癌相關。串珠鐮刀菌產生的毒素已經被國際癌癥研究會(International Agency for Research on Cancer, IARC)劃分到2B類一可能的人類致癌物。加入WTO之后，農產品及相關食品的國際貿易量日益增加，隨之對進出口產品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關、生產企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種特異、快速、簡便的伏馬毒素檢測方法?；瘜W發(fā)光(Chemiluminescence，CL)早在19世紀80年代就得到證實，即在化學反應過程中瞬間以釋放光子的形式放出能量。后發(fā)展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay， RIA)，因其高靈敏度和高特異性而受到普遍應用。CLIA是在RIA基本理論的基礎上，以標記發(fā)光劑為示蹤物信號建立起來的一種非放射標記免疫分析法。近年來發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標記免疫測定技術，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數量級，顯著優(yōu)于放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析。化學發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay, CLEIA)屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。在酶促化學發(fā)光免疫分析中可供標記的酶有很多，目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。免疫磁酶技術是將IgG標記在標記有ftOtein A的磁珠上，進行酶聯(lián)免疫方法的技術。其優(yōu)勢是利用磁珠的富集作用，檢測較大體積溶液中的微量抗原。關于伏馬毒素Bl毒素檢測，國內外已建立了多種方法。目前檢測FBl的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MQ，液譜和質譜聯(lián)用法(LC-MS)和 ELISA方法。然而，這些方法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求有專業(yè)的操作人員，不利于現(xiàn)場常規(guī)檢測使用。已有的檢測伏馬毒素Bl 毒素的ELISA試劑盒，在檢測靈敏度上不及本發(fā)明的化學發(fā)光ELISA方法，因此本方法對保障谷物類食品的安全具有更重要的作用。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于免疫磁酶的檢測伏馬毒素 Bl的方法。本發(fā)明檢測對象針對性強，準確率高，靈敏度較市售ELISA檢測試劑盒高，并且由于本發(fā)明采用抗伏馬毒素Bl單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素無交叉反應，較市售的以多克隆抗體為基礎的ELISA試劑盒有更強的特異性，減少了假陽性率。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種基于免疫磁酶的檢測伏馬毒素Bl的方法，該方法包括以下步驟步驟一，將FBl半抗原與OVA偶聯(lián)，得到FBl的偶聯(lián)物FBl-OVA ；步驟二，將抗FBl單克隆抗體與免疫磁珠結合，得到抗體-磁珠結合物；步驟三，將所述抗體-磁珠結合物加入EP管中，使用洗滌液洗滌，將待側樣品進行萃取，得到萃取液，該萃取液稀釋后加入所述管中，震蕩；步驟四，去除上清液，使用洗滌液洗滌，將所述OVA-FBl加入所述管中，震蕩；步驟五，去除上清液，使用洗滌液洗滌，將抗FBl單克隆抗體加入所述管中，震蕩；步驟六，去除上清液，使用洗滌液洗滌，將HRP標記羊抗鼠二抗加入所述管中，震蕩；步驟六，去除上清液，使用洗滌液洗滌，加入發(fā)光底物，震蕩，測定發(fā)光值；步驟七，根據已知不同濃度FBl與抗FBl單克隆抗體加入后得到的發(fā)光值，制作標準曲線，再根據待測樣品的發(fā)光值，通過標準曲線得到對應的FBl濃度。優(yōu)選地，在所述步驟一中，所述FBl半抗原與所述OVA的偶聯(lián)通過活潑酯法完成。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述洗滌液為pH為7. 4的0. OlM磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述萃取液的稀釋倍數為5倍。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述萃取的方法為取樣品，按照重量體積比1 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min，將上清液通過快速定性濾紙過濾，即得萃取液。進一步優(yōu)選地，所述稀釋液為pH 8. 2的0. IM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有體積比為 0. 01% ^ Tween-20。優(yōu)選地，在所述步驟三中，所述震蕩步驟為室溫震蕩30分鐘。優(yōu)選地，在所述步驟六中，所述震蕩步驟為室溫震蕩1分鐘。優(yōu)選地，在所述步驟四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。優(yōu)選地，在所述步驟七中，所述標準曲線的做法為=WWAFBl濃度的對數值為橫坐標，以加入不同濃度FBl所得到的不同發(fā)光值除以不加入FBl所得到的發(fā)光值為縱坐標， 通過Microsoft Excel軟件，做出散點圖并添加趨勢線公式和R2。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明是鑒于待測樣品若有FBl 毒素，由于FBl和免疫磁珠上的抗FBl單克隆抗體特異性結合，而卵清蛋白(OVA)與FBl和的偶聯(lián)物OVA-FBl加入反應體系中后，可以和未被FBl結合的單克隆抗體結合。再次加入抗FBl單克隆抗體后，抗體可以和OVA-FBl結合。而且在加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗后，HRP再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。由于待測樣品中含有的FBl的量與發(fā)光檢測結果有線性關系，因此可以通過標準曲線算出待測樣品中含有的FBl的量。本發(fā)明檢測對象針對性強，準確率高，靈敏度較市售ELISA檢測試劑盒高。并且由于本發(fā)明采用抗伏馬毒素Bl單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素無交叉反應，較市售的以多克隆抗體為基礎的ELISA試劑盒有更強的特異性，減少了假陽性率。
圖1為本發(fā)明實施例原理的示意圖；圖2為本發(fā)明實施例檢測的示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一，伏馬毒素Bl完全抗原(OVA-FBl)的制備將2.5mg卵清白蛋白(OVA)溶于0. Iml 0. OlM的PB緩沖液中，加入10 μ 150% (V/ V)戊二醛(GA)，室溫攪拌過夜。4°C條件下用PBS透析過夜，除去多余GA。0. 5mg FBI溶于 0.2ml 25% (V/V)乙醇，將其加入到激活的OVA透析物(約0. 15ml)中，加入0. ImllM碳酸緩沖液(pH 9.5)，4°C攪拌過夜。加入0.05ml IM賴氨酸(pH 7)，4°〇反應池。最后用PBS 透析72h，2次換液，-20°C保存。步驟二，抗FBl單克隆抗體與免疫磁珠結合取免疫磁珠50μ1，使用洗滌液(0.01M磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4)洗滌3次后， 加入含5yg抗FBl單克隆抗體的結合緩沖液(0. IM磷酸緩沖液，pH 8. 2，含0. 01 % Tween-20)200y 1，室溫震蕩反應30分鐘。再使用洗滌緩沖液洗滌3次，最后加入結合緩沖液，_4°C保存。步驟三，化學發(fā)光ELISA檢測待測樣品萃取液(1)將抗體-磁珠結合物稀釋至一定濃度后取50 μ 1加入EP管中，使用洗滌液洗滌3次。取0. 3g樣品，加入:3ml 70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min。上清液通過快速定性濾紙過濾，使用結合緩沖液(0. IM磷酸緩沖液，pH 8. 2，含0. 01% Tween-20) 稀釋5倍后，取Iml加入含有抗體-磁珠的管中，室溫震蕩反應30分鐘，其中在標準曲線孔中依次加入10、5、1、0· 5,0. 1,0. 0U0ng/ml的FBI純品1ml，并做3次重復；在待測孔中加制備的待測樣品萃取液1ml，并做3次重復，空白孔中不加入抗體-磁珠結合物，如圖2所示。(2)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將OVA-FBl使用結合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200 μ 1加入EP管中，室溫震蕩反應30分鐘。(3)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將抗FBl單克隆抗體使用結合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200ul加入EP管中，室溫震蕩反應30分鐘。(4)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌3次后，將HRP標記羊抗鼠二抗使用結合緩沖液稀釋至一定濃度后，取200 μ 1加入EP管中，室溫震蕩反應30分鐘。(5)使用磁力架將溶液上清去除，使用洗滌液洗滌后加入發(fā)光底物(魯米諾+對
5碘酚)200 μ 1，室溫震蕩反應1分鐘后吸出，加入96孔板中，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定，得到結果。如圖1所示，磁珠1與ftOtein A 2結合，抗FBl單克隆抗體3分別與ftx)tein A2 和0VA-FB14結合，抗FBl單克隆抗體5分別與0VA-FB14和HRP標記的羊抗鼠二抗6結合。步驟四，檢測FBl的標準曲線的制作與結果判定(1)根據已知不同濃度FBl與抗FBl單克隆抗體加入后，得到的發(fā)光值，繪制標準曲線，具體做法為=WWAFBl濃度的對數值為橫坐標，以加入不同濃度FBl所得到的不同發(fā)光值的平均數，除以不加入FBl (空白)所得到的發(fā)光值為縱坐標，通過Microsoft Excel 軟件，繪制散點圖并添加趨勢線公式和R2 ；(2)根據待測樣品的發(fā)光值的平均值，通過標準曲線所得到的趨勢線公式計算，得到對應的FBl濃度。
權利要求
1.一種基于免疫磁酶檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，將FBl半抗原與OVA偶聯(lián)，得到FBl的偶聯(lián)物FBl-OVA ；步驟二，將抗FBl單克隆抗體與免疫磁珠結合，得到抗體-磁珠結合物； 步驟三，將所述抗體-磁珠結合物加入EP管中，使用洗滌液洗滌，將待側樣品進行萃取，得到萃取液，該萃取液稀釋后加入所述管中，震蕩；步驟四，去除上清液，使用洗滌液洗滌，將所述OVA-FBl加入所述管中，震蕩； 步驟五，去除上清液，使用洗滌液洗滌，將抗FBl單克隆抗體加入所述管中，震蕩； 步驟六，去除上清液，使用洗滌液洗滌，將HRP標記羊抗鼠二抗加入所述管中，震蕩； 步驟六，去除上清液，使用洗滌液洗滌，加入發(fā)光底物，震蕩，測定發(fā)光值； 步驟七，根據已知不同濃度FBl與抗FBl單克隆抗體加入后得到的發(fā)光值，制作標準曲線，再根據待測樣品的發(fā)光值，通過標準曲線得到對應的FBl濃度。
2.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟一中，所述 FBl半抗原與所述OVA的偶聯(lián)通過活潑酯法完成。
3.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述洗滌液為pH為7. 4的0. OlM磷酸鹽緩沖液。
4.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述萃取液的稀釋倍數為5倍。
5.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述萃取的方法為取樣品，按照重量體積比1 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩 15min，靜置30min，將上清液通過快速定性濾紙過濾，即得萃取液。
6.如權利要求5所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，其特征在于，所述稀釋液為pH 8. 2的0. IM磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液含有體積比為0. 01%的Tween-20。
7.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述震蕩步驟為室溫震蕩30分鐘。
8.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟六中，所述震蕩步驟為室溫震蕩1分鐘。
9.如權利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
10.如權利要求1至9任一項所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步驟七中，所述標準曲線的做法為=WWAFBl濃度的對數值為橫坐標，以加入不同濃度FBl所得到的不同發(fā)光值除以不加入FBl所得到的發(fā)光值為縱坐標，通過Microsoft Excel軟件， 做出散點圖并添加趨勢線公式和R2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測伏馬毒素B1的方法，包括以下步驟將FB1半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物FB1-OVA；將抗FB1單克隆抗體與免疫磁珠結合；將抗體-磁珠結合物加入EP管中，洗滌，將待側樣品的萃取液加入上述管中，震蕩；去除上清液，洗滌，將OVA-FB1加入上述管中，震蕩；去除上清液，洗滌，將抗FB1單克隆抗體加入上述管中，震蕩；去除上清液，洗滌，將HRP標記羊抗鼠二抗加入上述管中，震蕩；去除上清液，洗滌，加入發(fā)光底物，震蕩，測定發(fā)光值；制作標準曲線，再根據待測樣品的發(fā)光值，通過標準曲線得到對應的FB1濃度。本發(fā)明采用抗FB1單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素無交叉反應，特異性強，減少了假陽性率。
文檔編號G01N33/577GK102539772SQ20121000240
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權日2012年1月6日
發(fā)明者嚴亞賢, 孫建和, 王元凱 申請人:上海交通大學