利用液相色譜法評(píng)估霉菌毒素脫毒劑體外脫毒效果的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用液相色譜法評(píng)估霉菌毒素脫毒劑體外脫毒效果的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]霉菌毒素(Mycotoxins)是霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，普遍存在于飼料原料和配合飼料中。
[0003]霉菌在生殖繁衍過(guò)程不但會(huì)消耗飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，降低飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還可能產(chǎn)生多種對(duì)動(dòng)物有毒副作用的代謝產(chǎn)物，如:黃曲霉毒素(Aflatoxins)、赭曲霉毒素(Ochratoxin)、單端孢霉稀族毒素、伏馬毒素(Fumonisin)和麥角(Ergot)等，引起動(dòng)物采食量下降、飼料轉(zhuǎn)化率降低、體質(zhì)下降、發(fā)病率升高以及繁殖機(jī)能下降等。霉菌毒素具有廣泛的致癌性(主要是肝臟和腎臟的癌變)、致突變、致畸性、生殖抑制以及免疫抑制等代謝干擾作用，在飼料一動(dòng)物一畜產(chǎn)品一人的傳遞過(guò)程中不斷濃縮，對(duì)畜牧生產(chǎn)、食品安全和人類(lèi)的健康造成了嚴(yán)重的危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004]防治霉菌毒素污染的最根本措施是預(yù)防霉菌毒素的產(chǎn)生。但谷物在田間生長(zhǎng)及籽實(shí)收獲的儲(chǔ)藏和加工等各個(gè)階段均可能感染霉菌，且谷物和飼料均是大宗產(chǎn)品，很難實(shí)現(xiàn)全過(guò)程溫度和濕度等環(huán)境條件的嚴(yán)格控制。所以，霉菌及其毒素對(duì)谷物和飼料的污染幾乎是不可避免的。據(jù)報(bào)道，全球超過(guò)25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素污染。我國(guó)近年的調(diào)查結(jié)果顯不，我國(guó)伺料和原料霉囷毒素超標(biāo)的比例尚達(dá)60%?70%以上。
[0005]降低飼料中霉菌毒素危害的方法主要有生物法(酶解和微生物發(fā)酵法等)、化學(xué)法(氫氧化鈣、臭氧和氨破壞等)和物理法(清洗、熱處理和吸附劑法等)，雖然這些方法均能不同程度地緩解霉菌毒素污染產(chǎn)生的毒副作用，但是在工業(yè)化生產(chǎn)中，添加霉菌毒素吸附劑是目前最直接、最具可操作性和可行性的方法。
[0006]霉菌毒素吸附劑在動(dòng)物的消化道內(nèi)吸附霉菌毒素，減少毒素進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的數(shù)量，從而保護(hù)動(dòng)物免受霉菌毒素毒害。
[0007]自從20世紀(jì)60年代早期首次報(bào)道動(dòng)物霉菌毒素中毒癥以來(lái)，世界各地的研究者們?cè)诓恍傅匮芯肯蚪档推涠竞Φ姆椒?。但由于飼料中的霉菌毒素種類(lèi)繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各異，為防治帶來(lái)巨大的困難。谷物生長(zhǎng)、收獲、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等過(guò)程均可能受到霉菌及其毒素的污染，防止霉菌繁衍、破壞已污染飼料中的毒素和降低其在消化道中的吸收量均是避免和緩解霉菌毒素對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用的最有效方法。除防霉措施外，目前飼料工業(yè)中最經(jīng)濟(jì)可行的霉菌毒素脫毒方法是添加霉菌毒素吸附劑。
[0008]霉菌毒素吸附劑的選用應(yīng)該注意以下幾個(gè)問(wèn)題，①針對(duì)性:明確哪些是目前飼料或食品原料中污染的主要霉菌毒素，有針對(duì)性地選用吸附劑產(chǎn)品。②廣譜性:在該霉菌毒素吸附劑對(duì)毒性最大的黃曲霉毒素應(yīng)有很強(qiáng)的吸附作用，并且能夠吸附其他霉菌毒素(如嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等)。③專(zhuān)一性:該霉菌毒素吸附劑具有很好的選擇性吸附作用，即對(duì)霉菌毒素有很好的吸附作用，并且不吸附維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。④安全性:該霉菌毒素吸附劑不被動(dòng)物吸收，在動(dòng)物體內(nèi)不殘留對(duì)動(dòng)物和人沒(méi)有毒副作用。⑤可靠性:該霉菌毒素吸附劑的供應(yīng)商和生產(chǎn)商能夠提供包括實(shí)驗(yàn)室體外試驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)在內(nèi)的完整數(shù)據(jù)資料(最好是發(fā)表在世界上權(quán)威的學(xué)報(bào)刊物而非商業(yè)廣告刊物)。⑥合法性:一定要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)自己進(jìn)行效果驗(yàn)證。
[0009]在霉菌毒素研制過(guò)程中使用最多是簡(jiǎn)單的體外等溫吸附法。該方法以水作為反應(yīng)介質(zhì)，根據(jù)吸附劑和毒素間的劑量反應(yīng)關(guān)系，經(jīng)分離固體吸附劑后，測(cè)定液相中剩余毒素的量，計(jì)算被吸收的量。常見(jiàn)指標(biāo)有單濃度吸附率、等溫吸附曲線和化學(xué)吸附常數(shù)(Ca)。該法在固定pH值和單一水介質(zhì)中反應(yīng)，不能反映消化道的復(fù)雜成分環(huán)境及pH值變化。有的研究雖模擬了消化道生理環(huán)境，但未考慮胃腸道pH變化和食糜滯留時(shí)間，以及消化酶對(duì)吸附效果測(cè)值的干擾。Ruby在研究污泥中金屬元素的生物利用率時(shí)，考慮了單胃動(dòng)物酶、鹽、PH、溫度和時(shí)間間隔之間互作的影響，所用的胃腸道模型都是人為添加各種物質(zhì)，這與胃腸道環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，所檢測(cè)得到的結(jié)果也與吸附劑在體內(nèi)真實(shí)情況有所差距。
[0010]目前生產(chǎn)中常用的毒素吸附劑種類(lèi)繁多，質(zhì)量參差不齊，也無(wú)統(tǒng)一的國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，迫切需要建立可靠的霉菌毒素吸附劑吸附性能評(píng)估方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明主要提供了一種利用液相色譜法評(píng)估霉菌毒素脫毒劑體外脫毒效果的方法，能夠模擬胃腸道環(huán)境評(píng)價(jià)方法，用動(dòng)物的消化道食糜上清液為反應(yīng)介質(zhì)，完全再現(xiàn)動(dòng)物胃腸道環(huán)境，更加真實(shí)地評(píng)定吸附劑吸附效果。其技術(shù)方案如下:
[0012]—種利用液相色譜法評(píng)估霉菌毒素脫毒劑體外脫毒效果的方法，包括以下步驟:
[0013](1)前期準(zhǔn)備
[0014]1.霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0015]a.稱(chēng)取霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為20 μ g/ml的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；
[0016]b.稱(chēng)取霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制成濃度為0 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液；
[0017]c.向色譜柱注入霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018]I1.脫毒劑樣品
[0019]稱(chēng)取待評(píng)估的脫毒劑過(guò)篩處理，得脫毒劑樣品；
[0020]II1.反應(yīng)介質(zhì)的獲取
[0021 ] 采集豬胃部或小腸腸道食糜，用離心機(jī)離心處理，提取上清液，保存?zhèn)溆茫?br>[0022](2)脫毒處理
[0023]1.體外吸附脫毒評(píng)價(jià)
[0024]a.稱(chēng)取脫毒劑樣品，用雙蒸水配制成2mg/ml的脫毒劑溶液，避光攪拌處理；
[0025]b.吸取等量的脫毒劑溶液和lOyg/ml的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液至離心管中，恒溫振蕩避光吸附脫毒；
[0026]c.離心處理，得上清液一；
[0027]II模擬體內(nèi)吸附脫毒評(píng)價(jià)
[0028]a.稱(chēng)取脫毒劑樣品，溶于反應(yīng)介質(zhì)和雙蒸水的混合液中，脫毒劑的濃度為2mg/ml，反應(yīng)介質(zhì)的體積含量為10%，避光攪拌處理；
[0029]b.吸取等量的脫毒劑溶液和lOyg/ml的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液至離心管中，恒溫振蕩避光吸附脫毒；
[0030]c.離心處理，得上清液二；
[0031](3)液相色譜檢測(cè)
[0032]取上清液一和上清液二分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)。
[0033]優(yōu)選的，所述霉菌毒素為黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮或嘔吐毒素。
[0034]優(yōu)選的，所述液相色譜檢測(cè)的條件為:
[0035]色譜柱:C18柱，長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6mm,填料直徑5 μ m ;
[0036]流動(dòng)相:對(duì)黃曲霉毒素測(cè)定時(shí)，流動(dòng)相體積比為甲醇:水=48:52，超聲脫氣，經(jīng)過(guò)0.45 μ m濾膜過(guò)濾；對(duì)玉米赤霉稀炯測(cè)定時(shí)，流動(dòng)相體積比為乙腈:水=1:1，超聲脫氣，經(jīng)過(guò)0.45 μπι濾膜過(guò)濾；對(duì)嘔吐毒素測(cè)定時(shí)，流動(dòng)相體積比為甲醇:水=20:80，超聲脫氣，經(jīng)過(guò)0.45 μ m濾膜過(guò)濾；
[0037]流速:lml/min;
[0038]進(jìn)樣體積:20 yL;
[0039]檢測(cè)波長(zhǎng):黃曲霉毒素:Ex = 360nm, Em = 440nm ;玉米赤霉稀酮:Ex = 274nm，Em=440nm ;嘔吐毒素:218nm ；
[0040]保留時(shí)間:10min。
[0041]優(yōu)選的，步驟(1)前期準(zhǔn)備中，脫毒劑樣品為過(guò)0.28_孔篩。
[0042]優(yōu)選的，步驟⑴前期準(zhǔn)備中，采集豬小腸腸道食糜為用離心機(jī)20000rpm離心處理。
[0043]優(yōu)選的，步驟(2)脫毒處理中，吸取0.25ml脫毒劑溶液和0.25ml的10 μ g/ml的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液至1.5ml離心管中，37°C恒溫振蕩避光吸附脫毒4小時(shí)。
[0044]優(yōu)選的，脫毒劑對(duì)霉菌毒素的吸附率按式(A)計(jì)算:X = ml/m0*100%= (m0-m2) /m0*100%式(A)，其中，X為吸附率，mO為霉菌毒素的添加量，ml為霉菌毒素的吸附量，m2為霉菌毒素的殘余量。
[0045]采用上述利用液相色譜法評(píng)估霉菌毒素脫毒劑體外脫毒效果的方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0046](1)本發(fā)明提供了霉菌毒素脫毒劑對(duì)黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的體夕卜、體內(nèi)模擬的評(píng)估方法，適用于不同脫毒劑產(chǎn)品對(duì)黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的吸附率評(píng)估；
[0047](2)本發(fā)明選用成年健康豬胃和小腸食糜上清液作為體外評(píng)價(jià)試驗(yàn)的反應(yīng)介質(zhì)，該介質(zhì)應(yīng)含有動(dòng)物消化道可能干擾霉菌毒素吸附的各種化學(xué)成分和酸堿環(huán)境，同時(shí)模擬動(dòng)物消化道的溫度和運(yùn)動(dòng)條件，旨在使評(píng)價(jià)結(jié)果更加接近吸附劑在體內(nèi)作用效果；
[0048](3)本發(fā)明的評(píng)估方法可以用于篩選合適的脫毒劑，在篩選脫毒劑時(shí)，首選是進(jìn)行體外吸附脫毒評(píng)價(jià)，以水為反應(yīng)介質(zhì)，初步篩選有效的霉菌毒素脫毒劑；二是模擬胃腸道環(huán)境評(píng)價(jià)方法，用動(dòng)物的消化道食糜上清液為反應(yīng)介質(zhì)，完全再現(xiàn)動(dòng)物胃腸道環(huán)境，更加真實(shí)地評(píng)定脫毒劑吸附脫毒效果。
【具體實(shí)施方式】
[0049]—、試劑與溶液
[0050]除特殊說(shuō)明外，所有試劑均為分析純，水為蒸餾水，色譜用水為去離子水，符合GB/T 6682中的一級(jí)用水規(guī)定。
[0051]1.試劑
[0052]甲醇(色譜純)
[0053]超純水(去離子水)
[0054]乙腈(色譜純)
[0055]乙腈-水混合液:50ml乙腈與50ml超純水混合
[0056]黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品:純度會(huì)99% ;玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品:純度會(huì)98% ;嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品:純度會(huì)98%。
[0057]2.霉菌毒素