成像細(xì)胞儀的內(nèi)部聚焦參考珠的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明一般地涉及可用于分析和測(cè)量細(xì)胞和生物樣品的分析和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明提供用于細(xì)胞成像儀的內(nèi)部校準(zhǔn)和聚焦參考的系統(tǒng)和方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】成像細(xì)胞儀的內(nèi)部聚焦參考珠
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般地涉及用于分析和測(cè)量細(xì)胞和生物樣品的分析和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于成像細(xì)胞儀的內(nèi)部校準(zhǔn)和聚焦參考的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在醫(yī)療診斷和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方面涉及通過(guò)測(cè)試生物樣品如血液、脊髓液、細(xì)胞培養(yǎng)物和尿液來(lái)對(duì)所感興趣的各種細(xì)胞和生物分子進(jìn)行檢測(cè)、識(shí)別、量化和表征。醫(yī)療服務(wù)提供者和生物醫(yī)學(xué)研究人員對(duì)這些生物樣品的細(xì)胞與生物分子的微觀存在和濃度進(jìn)行了常規(guī)分析。
[0003]例如，在用于輸血資格的患者血液樣本中需要確認(rèn)白細(xì)胞數(shù)(即白血細(xì)胞)。通過(guò)使用成像細(xì)胞儀的方法(Cellometer,Nexcelom Bioscience,LLC),白細(xì)胞計(jì)數(shù)可以通過(guò)對(duì)薄腔室的大面積成像來(lái)測(cè)量，它允許在一個(gè)特定的掃描體積之內(nèi)計(jì)數(shù)所有的白細(xì)胞。全血中含有高濃度的紅血細(xì)胞，其經(jīng)常阻礙白細(xì)胞被肉眼看到，除非紅血細(xì)胞被溶解或采用專(zhuān)門(mén)用于染色白細(xì)胞的熒光方法。上面提到的檢測(cè)方法，去白細(xì)胞的專(zhuān)業(yè)人員使用熒光或者使用當(dāng)紅血細(xì)胞溶解時(shí)的亮視野，將能夠聚焦于白細(xì)胞上。然而，大多數(shù)去白細(xì)胞的病人血液樣本中含有濃度非常低的白細(xì)胞。因此，成像系統(tǒng)可能無(wú)法檢測(cè)到任何白細(xì)胞的存在，這表示在圖像視野中沒(méi)有進(jìn)行聚焦的對(duì)象。
[0004]因此，對(duì)于提供簡(jiǎn)單和精確的校準(zhǔn)和用于聚焦的內(nèi)部參考和質(zhì)量控制從而允許準(zhǔn)確和快速成像以及超低濃度樣品測(cè)量的系統(tǒng)和方法存在長(zhǎng)期需求。
[0005]發(fā)明概沭
[0006]本發(fā)明基于一個(gè)獨(dú)特的設(shè)計(jì)方法，其獲得用于成像細(xì)胞儀校準(zhǔn)和內(nèi)部聚焦的顯著改善的系統(tǒng)。本發(fā)明提供了在測(cè)量、分析、計(jì)數(shù)或監(jiān)測(cè)顯微對(duì)象例如各種類(lèi)型的生物細(xì)胞方面的改進(jìn)。特別地，該系統(tǒng)允許對(duì)極低濃度下的細(xì)胞進(jìn)行更精確的檢測(cè)和測(cè)量。該新穎的方法對(duì)于確認(rèn)低濃度去白細(xì)胞血液樣品的細(xì)胞計(jì)數(shù)能有效并高效率地內(nèi)部聚焦和參考，并顯著地改善檢測(cè)限和從成像細(xì)胞儀獲得的結(jié)果的置信度。
[0007]在一個(gè)方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度的方法。該方法包含:將待檢測(cè)的用于確定目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度的樣品與預(yù)先確定量的微?；旌希渲兴瞿繕?biāo)細(xì)胞在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能夠在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，并且其中所述微粒在第二激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)后能夠在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光；將樣品負(fù)載于熒光成像系統(tǒng)的樣品室；將光束導(dǎo)向樣品，其中所述光束包含第二激發(fā)波長(zhǎng)；在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；用在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的熒光圖像校準(zhǔn)熒光圖像系統(tǒng)；將第二光束導(dǎo)向樣品，其中所述第二光束包含第一激發(fā)波長(zhǎng)；在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度。
[0008]在另一個(gè)方面，本發(fā)明一般地涉及用來(lái)校準(zhǔn)用于在低濃度下測(cè)量目標(biāo)細(xì)胞的熒光成像系統(tǒng)的方法。所述方法包含:制備一種包含預(yù)先確定量的、其上結(jié)合有能發(fā)射熒光的染料的微粒；將光束導(dǎo)向樣品，其中所述光束包含能對(duì)所述染料進(jìn)行熒光激發(fā)的波長(zhǎng)，從而導(dǎo)致所述微粒的可觀測(cè)熒光圖像；并且用觀測(cè)到的微粒熒光圖像作為參考校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)。
[0009]在還有另一個(gè)方面，本發(fā)明一般地涉及用于檢測(cè)樣品中生物物質(zhì)存在的方法。所述方法包含:將待檢測(cè)的用于確定生物物質(zhì)存在的樣品使用在激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)后能夠在檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的染料進(jìn)行染色；將待檢測(cè)樣品與預(yù)先確定量的、在激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在檢測(cè)波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)兩者下發(fā)射熒光的微粒進(jìn)行混合；在參考波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；在檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中生物物質(zhì)的存在。
[0010]附圖簡(jiǎn)沭
[0011]圖1顯示了一種示例性的現(xiàn)有技術(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)。
[0012]圖2顯示(左上)吖啶橙(AO)染色血液樣品的亮視野圖像；(右上)UV激發(fā)下的染色樣品，其導(dǎo)致沒(méi)有熒光信號(hào)；(左下)藍(lán)光激發(fā)下的染色樣品，其導(dǎo)致AO染色白細(xì)胞的明亮熒光信號(hào)。
[0013]圖3顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導(dǎo)致明亮的熒光信號(hào)；(右)在藍(lán)光激發(fā)下的微球，其不產(chǎn)生突光信號(hào)。
[0014]圖4顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導(dǎo)致明亮的熒光信號(hào)；(右)在藍(lán)光激發(fā)下的AO染色的微球，顯示出AO結(jié)合于微球并發(fā)射綠色熒光。
[0015]圖5顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導(dǎo)致明亮的熒光信號(hào)；(右)在藍(lán)光激發(fā)下的微球以及AO染色的白細(xì)胞，對(duì)于這兩種粒子都顯示出AO明亮的熒光。
[0016]圖6顯示了(左)紫外激發(fā)下的微球，其導(dǎo)致明亮的熒光信號(hào)；(右)在藍(lán)光激發(fā)下的微球以及AO染色的白細(xì)胞，對(duì)于這兩種粒子都顯示出AO明亮的熒光。紅線圓圈是在兩個(gè)頻率(channel)中都發(fā)熒光的微球。
[0017]圖7顯示了紫外激發(fā)下的微球，其導(dǎo)致明亮的熒光信號(hào)，而PI染色的Jurkat細(xì)胞只發(fā)射輕微熒光；(右)只有在藍(lán)光激發(fā)下的PI染色的Jurkat細(xì)胞顯示出PI明亮的熒光。紅線圓圈是在兩個(gè)頻率中都發(fā)熒光的微球。
[0018]圖8顯示了紫外激發(fā)的珠(綠色)和碘化丙啶(藍(lán)色)的激發(fā)和發(fā)射光譜。紫外光激發(fā)珠和PI染色Jurkat細(xì)胞兩者，并且長(zhǎng)通濾波器收集二者的熒光，除了 Jurkat細(xì)胞更弱一些。藍(lán)光只激發(fā)PI ;因此，只有Jurkat細(xì)胞能夠被檢測(cè)到。
[0019]發(fā)明詳沭
[0020]本發(fā)明提供了一種獨(dú)特設(shè)計(jì)方法以及一種用于成像細(xì)胞儀的校準(zhǔn)和內(nèi)部聚焦的顯著改進(jìn)的系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明提供了在測(cè)量、分析、計(jì)數(shù)或監(jiān)測(cè)顯微可見(jiàn)對(duì)象例如各種類(lèi)型的生物細(xì)胞方面的改進(jìn)。本發(fā)明的系統(tǒng)允許對(duì)在極低濃度下的細(xì)胞進(jìn)行更精確的檢測(cè)以及測(cè)量。該新穎的方法顯著地降低了檢測(cè)限和增加了從成像細(xì)胞儀獲得的結(jié)果的置信度。
[0021]很多疾病的生物機(jī)制已經(jīng)通過(guò)對(duì)體液或組織樣本的微觀檢查而被闡明。組織病理學(xué)檢查也為對(duì)多種疾病有效醫(yī)學(xué)治療的發(fā)展提供了機(jī)會(huì)。在標(biāo)準(zhǔn)的解剖病理學(xué)中，基于細(xì)胞形態(tài)和染色特征進(jìn)行診斷。對(duì)經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)方法(例如蘇木精和曙紅)染色組織樣本的微觀檢查和分類(lèi)已經(jīng)顯著促進(jìn)了癌癥的治療。例如，腫瘤樣品可以被檢查從而描繪出腫瘤類(lèi)型并提示患者是否可能響應(yīng)于特定類(lèi)型的化療。
[0022]傳統(tǒng)地，對(duì)基于細(xì)胞分析的熒光檢測(cè)使用熒光顯微鏡、熒光板閱讀器(fluorescent plate reader)或流式細(xì)胞儀進(jìn)行。這些突光檢測(cè)方法通常引入昂貴的激發(fā)光源例如激光或弧光燈，從而具有高強(qiáng)度的激發(fā)。通常，存在激發(fā)光源和具有用來(lái)收集特定熒光信號(hào)的發(fā)射濾光器的檢測(cè)探針。在一種儀器例如熒光顯微鏡中，通常需要二向色濾光器來(lái)反射從頂部正常入射到目標(biāo)生物樣品的光。發(fā)射的熒光經(jīng)由二向色濾光器進(jìn)入檢測(cè)器(相機(jī)、分光儀等)然后被收集。
[0023]以前，NexcelomBioscience fluorescent Cellometer 技術(shù)在由光學(xué)鏡片、相機(jī)和樣品夾持器的組合件中使用Omega Optical提供的濾管。它能提供細(xì)胞和其他生物樣品的足夠的熒光圖像(圖1)。該技術(shù)提供了簡(jiǎn)單且有效率的方法來(lái)產(chǎn)生生物樣品熒光圖像，但是對(duì)于低熒光信號(hào)檢測(cè)缺乏靈敏度。一個(gè)可歸因的因素是激發(fā)光在濾管中通過(guò)發(fā)射濾光器的泄漏。只有一個(gè)特定的濾管和一個(gè)LED能被用于一種顏色，沒(méi)有太多的空間引入其他顏色。
[0024]如本文所公開(kāi)的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用熒光微球來(lái)開(kāi)發(fā)一種用于低濃度去白細(xì)胞血液樣品的簡(jiǎn)單內(nèi)部聚焦和校準(zhǔn)方法。目前的熒光檢測(cè)白細(xì)胞方法是用吖啶橙(AO)核酸染料染色，并且使用480nm/525nm波長(zhǎng)激發(fā)/發(fā)射。通過(guò)使用能夠在紫外(UV)光下激發(fā)并發(fā)射綠色熒光(525nm)的熒光微球，人們可以改變激發(fā)光源來(lái)檢測(cè)UV激發(fā)下用于聚焦的微球然后計(jì)數(shù)藍(lán)光激發(fā)的AO染色的白細(xì)胞。
[0025]本發(fā)明顯著改善了靈敏度和檢測(cè)限。
[0026]在一個(gè)方面，本發(fā)明一般地涉及用于確定樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度的方法。該方法包含:將待檢測(cè)的用于確定目標(biāo)細(xì)胞存在或濃度的樣品與預(yù)先確定量的微?；旌希渲兴瞿繕?biāo)細(xì)胞在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能夠在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，并且其中所述微粒在第二激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)后能夠在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光；將樣品負(fù)載于熒光成像系統(tǒng)的樣品室；將光束導(dǎo)向樣品，其中所述光束包含第二激發(fā)波長(zhǎng)；在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；用在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的熒光圖像校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)；將第二光束導(dǎo)向樣品，其中所述第二光束包含第一激發(fā)波長(zhǎng)；在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度。
[0027]在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)細(xì)胞能在不用染料染色時(shí)發(fā)射突光。在另一些實(shí)施方式中，目標(biāo)細(xì)胞只能在用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。
[0028]在一些實(shí)施方式中，微粒能在不用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。在另一些實(shí)施方式中，微粒只能在用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。
[0029]在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)細(xì)胞用在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的第一染料染色，并且微粒用在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的第二染料染色。
[0030]在某些實(shí)施方式中，本方法包含對(duì)待檢測(cè)的用于確定目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度的樣品用第一染料進(jìn)行染色，其中第一染料在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光；并且將待檢測(cè)的樣品和預(yù)先確定量的、其上結(jié)合有在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的第二染料的微?；旌?。
[0031]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，其上結(jié)合有第二染料的微粒在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光。并且檢測(cè)樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度包含將在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的樣品的熒光圖像和在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的樣品的熒光圖像進(jìn)行比較。[0032]在某些實(shí)施方式中，校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)包含在作為參考的微粒上聚焦熒光成像系統(tǒng)。
[0033]待檢測(cè)的樣品可以具有少于約IO8細(xì)胞/毫升的目標(biāo)細(xì)胞(例如，少于約IO7細(xì)胞/毫升、少于約IO6細(xì)胞/毫升、少于約IO5細(xì)胞/毫升、少于約IO4細(xì)胞/毫升、少于約IO3細(xì)胞/毫升、或少于約IO2細(xì)胞/毫升的目標(biāo)細(xì)胞)。在某些實(shí)施方式中，待檢測(cè)的樣品在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的熒光圖像中由單一目標(biāo)細(xì)胞組成。
[0034]使用本發(fā)明方法可以分析的樣品包含獲自或衍生自活有機(jī)體的生物物質(zhì)。這樣的樣品包含，但不限于，頭發(fā)、皮膚、組織、培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞介質(zhì)和體液。目標(biāo)細(xì)胞可以是適合于用本發(fā)明方法檢測(cè)和測(cè)量的任何細(xì)胞，例如，白細(xì)胞、干細(xì)胞、脊髓細(xì)胞、滑液、體液細(xì)胞、牛乳體細(xì)胞和免疫表型。
[0035]在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，微粒是微球，例如，選自不同熒光波長(zhǎng)的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯珠。
[0036]在一些實(shí)施方式中,微球具有基本上均一的直徑，例如，從約3 μ m至約50 μ m的直徑、從約4 μ m至約30 μ m的直徑或從約5 μ m至約15 μ m的直徑。
[0037]第一染料可以選自適于特定應(yīng)用的任何染料，例如，吖啶橙、碘化丙啶(PI)和溴乙錠。
[0038]第二染料可以選自能夠在UV波長(zhǎng)下激發(fā)和發(fā)射出綠色熒光的任何染色劑，例如，ProQ Emerald 300 或 Firefli 突光綠染料。
[0039]在一些實(shí)施方式中，第一激發(fā)波長(zhǎng)選自約470nm至約550nm,例如，選自約480nm至約525nm。在一些實(shí)施方式中，第二激發(fā)波長(zhǎng)選自約350nm至約400nm,例如，約375nm至約395nm。在一些其它實(shí)施方式中，第一激發(fā)波長(zhǎng)選自約580nm至約650nm、約590nm至約640nm、約600nm至約630nm。第二激發(fā)波長(zhǎng)選自約470nm至約525nm。
[0040]在一些實(shí)施方式中，第一檢測(cè)波長(zhǎng)選自約500nm至約640nm,例如，選自約510nm至約600nm。在一些實(shí)施方式中，第二檢測(cè)波長(zhǎng)與第一檢測(cè)波長(zhǎng)相同，例如選自約510nm至約600nm、約 690nm 至約 750nm 或約 700nm 至約 740nm。
[0041]在另一個(gè)方面，本發(fā)明一般地涉及一種用來(lái)校準(zhǔn)用于在低濃度下測(cè)量目標(biāo)細(xì)胞的熒光成像系統(tǒng)的方法。所述方法包含:制備一種包含預(yù)先確定量的、其上結(jié)合有能發(fā)射熒光的染料的微粒的樣品；將光束導(dǎo)向樣品，其中所述光束包含能對(duì)所述染料進(jìn)行熒光激發(fā)的波長(zhǎng)，從而產(chǎn)生所述微粒的可觀測(cè)熒光圖像；并且用觀測(cè)到的微粒熒光圖像作為參考來(lái)校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)。
[0042]在一些實(shí)施方式中，校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)包含用微粒作為定量參考來(lái)正確地聚焦熒光成像系統(tǒng)。
[0043]在一些其它實(shí)施方式中，校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)包含測(cè)量用作定量?jī)?nèi)部參考的微粒的一種或多種性質(zhì)，例如，微粒的粒度和熒光強(qiáng)度。
[0044]在還有另一個(gè)方面，本發(fā)明一般地涉及用于檢測(cè)樣品中生物物質(zhì)存在的方法。所述方法包含:將待檢測(cè)的用于確定生物物質(zhì)存在的樣品用在激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的染料染色；將待檢測(cè)的樣品與預(yù)先確定量的、在激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在檢測(cè)波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)兩者下發(fā)射熒光的微粒進(jìn)行混合；在參考波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；在檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；并且確定樣品中生物物質(zhì)的存在。實(shí)施例
[0045]材料和儀器
[0046]首先，為了開(kāi)發(fā)內(nèi)部聚焦參考方法，檢查了兩種類(lèi)型的微球。兩種微球都能在UV下激發(fā)和發(fā)射綠色波長(zhǎng)。微球#2也能被藍(lán)光激發(fā)和發(fā)射出綠光。測(cè)量微球在UV和藍(lán)光下的激發(fā)，以觀察其熒光輸出。血液樣品或者受試者，通過(guò)刺破他的手指來(lái)收集少量血。吖啶橙染料被制成10 μ g/ml用于染色血液樣品中的白細(xì)胞。在開(kāi)發(fā)內(nèi)部聚焦參考微球時(shí)，使用The Cellometer Vision(Nexcelom)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含兩個(gè)過(guò)濾器套件。一個(gè)套件具有在UV范圍內(nèi)的激發(fā)和發(fā)射出綠光，另一個(gè)套件具有藍(lán)色范圍內(nèi)的激發(fā)和相同的綠光發(fā)射。
[0047]初始突光檢測(cè)測(cè)量
[0048]首先，用5 μ I的AO染色20微升血液樣品并用綠光發(fā)射濾光器觀察其在UV和藍(lán)色激發(fā)下的突光。染色的血液(20 μ I)被移液至Cellometer的計(jì)數(shù)室并使用CellometerVision系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)熒光。接下來(lái)，微球被移至室并且在系統(tǒng)中也測(cè)量了他們的熒光。最后，將微球與AO混合并再次在系統(tǒng)中測(cè)量熒光。
[0049]內(nèi)部聚焦參考方法
[0050]選自之前的實(shí)驗(yàn)中的合適的微球與AO染色的血液樣品混合。將20微升血液樣品、5 μ I的AO和5 μ I微球混合?；旌衔锉灰埔褐罜ellometer計(jì)數(shù)室并得到白細(xì)胞計(jì)數(shù)的圖像。
[0051]初始突光檢測(cè)測(cè)量
[0052]AO染色的血液樣品的熒光圖像顯示于圖2。AO染色白細(xì)胞的熒光信號(hào)在藍(lán)光激發(fā)下是高的，并且在UV激發(fā)下沒(méi)有信號(hào)。亮視野圖像也顯示于圖2中，其中紅血細(xì)胞覆蓋整個(gè)圖像，因而白細(xì)胞僅能在熒光下被觀察到。
[0053]微球的熒光圖像顯示于圖3。微球的熒光信號(hào)在UV激發(fā)下是高的，并且如同預(yù)期一樣在藍(lán)光激發(fā)下沒(méi)有信號(hào)。結(jié)果顯示AO染色的血液及微球混合物能用于在UV頻率下聚焦樣品并且在藍(lán)光色頻率下僅計(jì)數(shù)AO染色的白細(xì)胞。
[0054]與AO混合的微球的突光圖像顯不于圖4。如同預(yù)期一樣,微球突光信號(hào)在UV激發(fā)下是高的。然而，在藍(lán)光頻率，AO結(jié)合于微球并在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)射熒光。微球用前面提及的第二種類(lèi)型代替，其在兩種激發(fā)光源下都發(fā)射熒光。
[0055]內(nèi)部聚焦參考方法
[0056]與微球混合的AO染色血液樣品的突光圖像顯不于圖5?；旌衔锿还庑盘?hào)表明在UV激發(fā)下僅有明亮微球熒光，而在藍(lán)光激發(fā)下微球和AO染色白細(xì)胞兩者都是高的。
[0057]通過(guò)在UV激發(fā)頻率下識(shí)別微球并利用他們進(jìn)行聚焦，通過(guò)從藍(lán)光頻率的總計(jì)數(shù)中減去微球計(jì)數(shù)從而可以在藍(lán)光頻率下計(jì)數(shù)實(shí)際的白細(xì)胞。該方法可用于當(dāng)血液樣品中白細(xì)胞濃度非常低，其中只有一個(gè)或甚至沒(méi)有細(xì)胞被檢測(cè)到時(shí)。如果是這樣的話，聚焦參考微球能夠確保圖像被聚焦在對(duì)象的焦平面上，因而在去白細(xì)胞血液樣品是合格的情況下不產(chǎn)生偏差。
[0058]實(shí)施例1白細(xì)胞成像
[0059]用大幅照相機(jī)對(duì)大量血液進(jìn)行成像，特別是用于確認(rèn)去白細(xì)胞血液樣品的白細(xì)胞計(jì)數(shù)。拍攝了兩個(gè)圖像(圖6)，一個(gè)具有UV激發(fā)和另一個(gè)具有藍(lán)光。血液樣品用吖啶橙染色劑和在兩個(gè)頻率下都發(fā)射熒光的熒光珠稀釋至1:1。
[0060]在UV激發(fā)頻率下只計(jì)數(shù)珠并且在藍(lán)光激發(fā)頻率下計(jì)數(shù)所有的顆粒(珠+AO染色白細(xì)胞)，相減得到了血液樣品中白細(xì)胞濃度的測(cè)量值。
[0061]實(shí)施例2白細(xì)胞成像
[0062]使用PI染色的Jurkat，以及具有510nm長(zhǎng)通濾波器的光學(xué)組件QMAX藍(lán)和具有51Onm長(zhǎng)通濾波器的535nm_401nm，在UV和藍(lán)光激發(fā)下取得了兩個(gè)圖像(圖7和圖8)。
[0063]在檢測(cè)PI染色Jurkat的頻率下，沒(méi)有觀測(cè)到珠的熒光信號(hào)。方法將涉及用珠在UV激發(fā)下聚焦，然后轉(zhuǎn)換至藍(lán)光激發(fā)并計(jì)數(shù)PI染色的所有細(xì)胞。該方法相比于前面描述的方法更簡(jiǎn)單，其中不需要進(jìn)行相減。本方法是使用一種頻率用珠聚焦，并然后轉(zhuǎn)換至另一個(gè)頻率計(jì)數(shù)所有的細(xì)胞。
[0064]引入作為參考
[0065]在本公開(kāi)中已經(jīng)參考并引用了其它文獻(xiàn)，例如專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利公開(kāi)、雜志、書(shū)籍、論文、網(wǎng)絡(luò)內(nèi)容。出于所有的目的，所有這些文件以其全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用并入本文。
[0066]等同物
[0067]代表性的實(shí)施例旨在幫助解釋本發(fā)明，并不旨在也不應(yīng)該被解釋成用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，根據(jù)本文件的全部?jī)?nèi)容(包含實(shí)施例和本文引入的對(duì)科學(xué)及專(zhuān)利文獻(xiàn)的引用)，對(duì)本領(lǐng)技術(shù)人員而言，除了本文顯示和描述的這些內(nèi)容，對(duì)本發(fā)明的各種修改及其許多其它實(shí)施方式都是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例包含重要的附加信息、例證和指導(dǎo)，其能在其各種實(shí)施方式及其等價(jià)物中來(lái)適應(yīng)于實(shí)施本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)樣品中目標(biāo)細(xì)胞存在或濃度的方法，其包含: 將待檢測(cè)的用于確定目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度的樣品與預(yù)先確定量的微粒混合，其中所述目標(biāo)細(xì)胞在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，并且其中所述微粒在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光； 將樣品負(fù)載于熒光成像系統(tǒng)的樣品室； 將光束導(dǎo)向樣品，其中所述光束包含第二激發(fā)波長(zhǎng)； 在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像； 用在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的熒光圖像校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)； 將第二光束導(dǎo)向樣品，其中所述第二光束包含第一激發(fā)波長(zhǎng)； 在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得所述樣品的熒光圖像；和 測(cè)定樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)細(xì)胞能在不用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。
3.根據(jù)權(quán)利要求 1的方法，其中所述目標(biāo)細(xì)胞能在用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒能在不用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒能在用染料染色時(shí)發(fā)射熒光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)細(xì)胞用在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的第一染料染色，并且 其中所述微粒用在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的第二染料染色。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其包含: 將待檢測(cè)的用于確定目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度的樣品用第一染料染色，其中所述第一染料在第一激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光；和 將待檢測(cè)的樣品與預(yù)先確定量的、其上結(jié)合有在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的第二染料的微?；旌?。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在其上結(jié)合有第二染料的所述微粒在第二激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光，并且 其中確定樣品中目標(biāo)細(xì)胞的存在或濃度包含將在第二檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的樣品熒光圖像與在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的樣品熒光圖像進(jìn)行比較。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中校準(zhǔn)所述熒光成像系統(tǒng)包含將熒光成像系統(tǒng)聚焦在作為參考的微粒上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述待檢測(cè)的樣品包含少于約IO8細(xì)胞/毫升的目標(biāo)細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述待檢測(cè)的樣品包含少于約IO5細(xì)胞/毫升的目標(biāo)細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述待檢測(cè)的樣品由在第一檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得的熒光圖像中的單一目標(biāo)細(xì)胞組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)細(xì)胞選自白細(xì)胞、干細(xì)胞、脊髓細(xì)胞、滑液、體液細(xì)胞、牛乳體細(xì)胞和免疫表型。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒是微球。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微粒選自:各種熒光波長(zhǎng)的聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯珠。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述微球具有實(shí)質(zhì)上均一的直徑。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述微球的直徑是約3μ m至約50 μ m。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述微球的直徑是約5μ m至約15 μ m。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一染料選自:吖啶橙、碘化丙啶和溴乙錠。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述第一染料是碘化丙啶。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二染料選自能在UV波長(zhǎng)下激發(fā)并發(fā)射綠色熒光的染色劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二染料是ProQEmerald 300。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法·，其中所述第二染料是Firefli熒光綠染料。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一激發(fā)波長(zhǎng)選自約470nm至約550nm。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中所述第一激發(fā)波長(zhǎng)選自約480nm至約525nm。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二激發(fā)波長(zhǎng)選自約350nm至約400nm。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法,其中所述第二激發(fā)波長(zhǎng)選自約375nm至約395nm。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一檢測(cè)波長(zhǎng)選自約500nm至約640nm。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法,其中所述第一檢測(cè)波長(zhǎng)選自約510nm至約600nm。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二檢測(cè)波長(zhǎng)與第一檢測(cè)波長(zhǎng)相同。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法,其中所述第二檢測(cè)波長(zhǎng)選自約510nm至約600nm。
32.一種用于校準(zhǔn)用來(lái)測(cè)量低濃度下目標(biāo)細(xì)胞的熒光成像系統(tǒng)的方法，其包含: 制備包含預(yù)先確定量的、其上結(jié)合有能發(fā)射熒光的染料的微粒； 將光束導(dǎo)向樣品，其中所述光束包含能對(duì)染料進(jìn)行熒光激發(fā)的波長(zhǎng)，從而產(chǎn)生微粒的可觀測(cè)熒光圖像；以及 用所述微粒的可觀測(cè)熒光圖像作為參考來(lái)校準(zhǔn)所述熒光成像系統(tǒng)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中校準(zhǔn)所述熒光成像系統(tǒng)包含用微粒作為定量參考對(duì)熒光成像系統(tǒng)正確地聚焦。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中校準(zhǔn)所述熒光圖像系統(tǒng)包含測(cè)量作為定量?jī)?nèi)部參考的微粒的一種或多種性質(zhì)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述微粒的一種或多種性質(zhì)是粒度和熒光強(qiáng)度。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述待測(cè)試的樣品包含少于約IO8細(xì)胞/毫升的目標(biāo)細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微粒是微球。
38.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述微粒是聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述微球具有實(shí)質(zhì)上均一的直徑。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述微球的直徑是約3μ m至約50微米。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述微球的直徑是約5μπι至約15微米。
42.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述染料選自:吖啶橙、碘化丙啶和溴乙錠。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述染料是碘化丙啶。
44.根據(jù)權(quán)利要求32的方法,其中所述激發(fā)波長(zhǎng)選自約470nm至約550nm。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法,其中所述激發(fā)波長(zhǎng)選自約480nm至約525nm。
46.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中獲得所述熒光圖像的波長(zhǎng)選自約350nm至約400nm。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述熒光圖像在約375nm至約395nm獲得。
48.一種用于檢測(cè)樣品中生物物質(zhì)存在的方法，其包含: 將待檢測(cè)的用于確定生物物質(zhì)存在的樣品用在激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在檢測(cè)波長(zhǎng)下發(fā)射熒光的染料染色； 將待檢測(cè)的樣品與預(yù)先確定量的、在激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)后能在檢測(cè)波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)二者下發(fā)射突光的微?；旌?； 在參考波長(zhǎng)下獲得樣品的熒光圖像； 在檢測(cè)波長(zhǎng)下獲得樣品的熒光圖像；和 確定樣品中生物物質(zhì)的存在。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述待檢測(cè)的樣品包含少于約IO8細(xì)胞/毫升的生物物質(zhì)。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述微粒是微球。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述微粒是聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的方法,其中所述微球具有基本上均一的直徑。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述微球的直徑是約3μ m至約50 μ m。`
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述微球的直徑是約5μπι至約15μ m。
55.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述染料選自:卩丫啶橙、碘化丙唆、溴乙錠和其他核酸染色劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述染料是碘化丙啶。
57.根據(jù)權(quán)利要求48的方法,其中所述激發(fā)波長(zhǎng)選自約470nm至約550nm。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的方法,其中所述激發(fā)波長(zhǎng)選自約480nm至約525nm。
59.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述參考激發(fā)波長(zhǎng)選自約350nm至約400nm。
60.根據(jù)權(quán)利要求48的方法,其中所述檢測(cè)波長(zhǎng)選自約510nm至約600nm。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103443625SQ201180054859
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月21日
【發(fā)明者】L·L·常, J·丘, P·李, K·弗拉納根, T·史密斯 申請(qǐng)人:耐克思樂(lè)生物科學(xué)有限責(zé)任公司